免疫学方法在食源性副溶血性弧菌检测中的应用研究进展

谢雪钦1,刘 舟2,*
(1.厦门市产品质量监督检验院,福建 厦门 361004;2.厦门医学院药学系,福建 厦门 361008)

摘 要:副溶血性弧菌可污染以海产品为主的各类食品,其引发的食品安全事件数量已经跃升至我国食品中毒事件数首位。相对于传统培养法及现代分子检测技术,基于抗原-抗体特异性识别反应的免疫鉴定及分型策略在检测效率、特异性、现场适用性、前处理简便性等诸多方面显现突出优势。本文在解析当前副溶血性弧菌抗体种类及制备方法的基础上,就免疫磁珠分离、酶联免疫吸附测定、免疫层析测试、免疫传感器、免疫荧光显微术等方法在食源性副溶血性弧菌检测中的应用现状进行综述,以期为该病原菌的快速检测提供借鉴和参考。

关键词:食源性副溶血性弧菌;免疫磁珠分离;酶联免疫吸附测定;免疫层析测试;免疫传感器;免疫荧光显微术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种革兰氏阴性嗜盐菌,普遍污染以海产品为主的各类食品,已成为世界性公共卫生问题[1]。据国家食源性疾病监测网的数据(2003—2007年),VP已跃升为我国细菌性食物中毒事故的首要病原[2-3],文献综述法估计VP感染占我国食源性疾病的比例高达68.0%[4]。美国疾病预防控制中心的食源性疾病监测数据(2009—2013)[5-8]同样显示,VP已成为继沙门氏菌、空肠弯曲菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌等之后的主要致病因子,主要感染生蚝、蛤蜊等海产品,软体类水产中VP致疾病爆发频次在2012—2013年均为发生频率第3的食物-致病菌组合。而欧盟食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)和欧洲疾病预防控制中心(European Centre for Disease Prevention and Control,ECDC)联合发布的欧盟人畜共患疾病、致病因子以及食源性疾病报告(2011—2014)[9-12]显示,VP在欧盟成员国中的西班牙和法国有爆发报道,主要感染软体及甲壳类水生动物等,引发数十例病例。

VP感染引起腹泻、腹痛、恶心、呕吐、发热等急性肠胃炎症状,重症患者还出现脱水、休克昏迷甚至死亡,严重威胁健康[13-14]。鉴于其感染普发性及危害严重性,近年来许多现代快速检测方法[15],包括显色培养基法、分子生物学方法、免疫检测法等被开发用于VP的检测。其中免疫法通过制备高特异性抗体,经抗原-抗体专一性结合精准靶向于目标菌,借由免疫传感器、免疫磁珠分离(immunomagnetic separation,IMS)、乳胶凝集、酶联免疫吸附测定(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)、免疫层析检测(immunochromatographic assay,ICA)、免疫荧光显微术(immunofluorescence microscopy,IFM)等技术广泛用于病原菌的富集及快速检测,较之传统培养法有效提高检测效率[16-18]。本文就上述免疫学方法在食源性VP检测上的应用进行综述,以期为免疫学方法的进一步创新及其与其他检测技术的融合提供思路,使其更好地服务于病原检测,保障食品安全。

1 抗VP免疫抗体的制备

基于免疫学方法检测食源性致病菌的关键在于高质量抗体的制备。抗体的靶向性及排他性、效价决定了抗原-抗体识别反应的专一性及灵敏度。用于微生物免疫检测的抗体分为多克隆抗体(polyclonal antibodies,PAbs)、单克隆抗体(monoclonal antibodies,MAbs)和以单链抗体(single chain antibody fragment,scFv)为代表的3 类基因工程抗体。

VP为多血清型细菌,包括至少12 种菌体(O)抗原、70余种荚膜(K)抗原和1 种各菌株相同的鞭毛(H)抗原[19-20]。以菌体、鞭毛蛋白或溶血毒素蛋白为抗原,近年来国内外研究者制备了多种高特异性、高效价抗体用于VP的免疫检测。

1.1 抗全菌抗体

VP为微生物抗原,属于具有较强的免疫原性和免疫反应性的完全抗原,经灭活后的全菌可作为免疫原制备高特异性抗体。

池信才等[21]以甲醛灭活的VP全菌免疫小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得1 株针对VP的MAbs,其特异性强、效价高,结合兔抗VP-Mabs,建立双抗体夹心ELISA法用于患病大黄鱼中VP的检测,准确度高;经摸索、优化抗原浓度及灭活方式、免疫接种剂量和时间间隔等影响PAbs效价的关键因素,窦勇等[22]同样以灭活菌体为抗原制备了兔源PAbs,效价高达1.6×105,交叉及阻断实验显示其高度特异靶向于VP。以灭活全菌为免疫原,采用杂交瘤技术,张星等[23]亦获得了4 株稳定分泌VP-MAbs的杂交瘤细胞株,其中5D8与供试的9 株其他弧菌均无交叉反应,可用于VP的特异性检验。

除了上述以单一VP菌株作为免疫原外,多个菌株混合液亦可作为抗原用于制备抗体。如Prompamorn等[24]以5 株VP纯菌的混合液多次注射兔子,获得VP-2D、VP-11H、VP-11B、VP-516和VP-618 5 种不同的MAbs,分别特异识别该菌不同血清型亚群,结合霍乱弧菌、溶藻弧菌和哈氏弧菌特异性MAbs,可通过点杂交免疫反应直接区分海产品中的不同弧菌。

此外,为减少对实验动物的副作用、简化抗体制备工艺,闫茂仓等[25]制备了卵黄抗体替代传统动物抗体用于VP免疫检测,以该抗体建立的间接ELISA法可高度特异地检出低至103CFU/mL的VP,与其他常见水产弧菌无交叉反应性。

1.2 抗H抗原抗体

VP有极鞭毛和周(侧)鞭毛两套鞭毛系统以适应不同环境,其中前者负责菌体泳动,后者则与游动细胞类型转换及生物膜形成相关[26]。鞭毛是重要的表面抗原,也是主要的抗原决定因子,具有特异性H抗原,可作为抗体制备的理想抗原。

如以柔性Linker序列串联VP的3 个极鞭毛基因FlaA、FlaB和FlaF,于大肠杆菌中融合表达,纯化蛋白产物免疫獭兔制备抗血清,可特异性检测6 种食物中毒性弧菌,对其他27 种非目标菌无任何交叉反应[27]。杨新[28]通过基因工程手段成功构建高容量噬菌体单链抗体展示库,并从中筛选得到1 株抗VP极鞭毛蛋白FlaB的高亲和力scFv,为建立基于鞭毛蛋白特异性免疫识别反应的VP免疫检测法奠定良好基础。

除了上述以基因工程表达的鞭毛蛋白为免疫原外,也有研究者通过不同方法直接从菌体中提取鞭毛蛋白用于特异性免疫抗体激发。Dotta等[29]分离了VP的鞭毛核心蛋白并以其为免疫原制备MAbs,玻片凝集反应表明该抗体可使41 株VP菌悬液在30 s内迅速发生凝集,而与30 株供试创伤弧菌无任何交叉反应,交联该抗体的磁珠可有效富集35%~45%浓度为102~103CFU/mL的VP。以差速离心法提取的高纯度VP鞭毛蛋白为抗原免疫小鼠,张蕾等[30]通过杂交瘤技术获得了高特异性鞭毛蛋白单抗VpNo.6,在供试涵盖27 个属共208 株细菌的免疫检测中未出现假阴(阳)性,以其建立的双抗体夹心ELISA法检测VP纯菌及模拟样品的灵敏度低至103CFU/mL和21 CFU/g,为建立VP免疫检测方法提供了良好的抗体资源。

1.3 抗溶血毒素蛋白抗体

VP溶血性毒素包括耐热直接溶血毒素(thermostable direct hemolysin,TDH)、TDH相关溶血毒素(TDH-related hemolysin,TRH)和不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)3 种,是该菌关键致病因子[31]。鉴于此,以溶血毒素蛋白为免疫原制备抗体可用于致病性VP的鉴别。

早在20世纪90年代,日本大阪大学的研究者即制备出抗VP-TDH[32]和TRH[33]的MAbs,部分抗体间具有两类溶血素交叉免疫反应活性。将其用于ELISA法检测临床及环境VP分离菌株,表明分离自病理样本的神奈川现象阴性及阳性菌株分别为携带TDH和TRH,而环境分离菌株则多为溶血素阴性。Kumar等[34]以纯化的TRH重组蛋白亦制备了MAbs,可用于海产品中VP初筛检测。

Sakata等[35]以TLH异源表达蛋白为抗原制备MAbs,特异性测试结果表明该抗体对78 株供试VP均呈阳性,而对53 株非VP菌中的5 株存在假阳性反应;以此MAbs建立ELISA法可在24 h内实现模拟染菌及市售生鲜海产品中低至100 MPN/g VP的快速检测。通过噬菌体展示技术,Wang Rongzhi等[36]借由基因工程表达TLH蛋白,制备了一株高亲和性单链抗体scFv-LA3,可有效中和TLH诱发的细胞毒性。近期,Chen Yaoguang等[37]还有效结合了抗体的特异性、亲和力以及GFP的可视性,制备融合GFP的抗VP-TLH荧光抗体并解析了其晶体结构,有望为生物体内VP实时、原位检测提供有力工具。

除了以基因工程表达毒素蛋白为免疫原外,也有研究者直接从菌体中提取溶血素作为抗原。如杨靖亚等[38]提取纯化高纯度VP-TDH作为免疫原,通过小鼠腹腔先后进行5 次免疫,运用常规间接ELISA法筛选杂交瘤细胞,采取有限稀释法进行细胞亚克隆,最终获得一株针对副溶血弧菌TDH高特异性、亲和力、稳定分泌MAbs的杂交瘤细胞株T9H4。

2 免疫学方法在食源性VP检测中的应用

在获得理想效价及高特异性抗体的基础上,国内外研究者不断致力于发掘各类免疫学方法用于食品中VP的检测,有效缩短检测时间、提高方法靶向性并改善其现场适用性,为食品安全检测推波助力。

2.1 IMS用于VP富集

微生物检测的关键限速步骤在于增菌。IMS法有效结合抗原-抗体识别反应的特异性和磁珠的磁场响应性,实现复杂基质或增菌液中目标菌的直接分离、富集,有效消除基质干扰、提高检测效率,在食源性致病菌的检测中广受青睐[39-40]

结合聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、发酵实验、显色培养基等下游检测技术,IMS法已被广泛用于食品中VP的检测。VP神奈川现象与该菌肠道致病性密切相关,但常规微生物培养方法难以从食品及环境样本中分离出TDH阳性VP菌。为克服上述缺陷,Hara-Kudo[41]和张凡非[42]等分别尝试通过以K6抗体包被的免疫磁珠富集水生贝类和海水、海泥和蛤肉中的O3:K6型VP,结果表明经富集、浓缩后相对于未处理对照,其神奈川阳性VP的分离率显著提高。通过采用VP特异性抗体包被磁珠吸附分离,Seo等[43]将芯片ELISA法检测样品中VP的前增菌时间从大于24 h缩至小于9 h,实现在一个工作日内完成检验,为及时处置染菌食品、防止其流通扩散发挥重要作用。以自制高特异性鞭毛蛋白MAbs[30]偶联免疫磁珠,北京出入境检验检疫局曾静带领的团队就IMS在生蚝等海产品中VP的分离、富集及其与环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、PCR等下游核酸检测技术的结合应用进行了系列的研究[44-46],对103~105CFU/mL VP的富集率高达74%~87%,未增菌条件下可检测菌浓度低至140 CFU/mL的纯菌或1.9×103CFU/mL的染菌生蚝,缩短增菌时间至8 h仍可检出VP浓度低至0.19 CFU/g的生蚝或2 CFU/25 g的扇贝。

除了定性检测,基于IMS的下游检测技术还被用于VP的计数。如为定量检测环境中低含量(<1%)的TDH阳性VP,日本京都大学Tanaka[47]和Escalante-Maldonado[48]等建立并优化了基于IMS富集技术的最大可能数(most probable number,MPN)法,用于海产品中致病性VP的准确定量,方法适用于世界各气候带不同染菌量水产品的检测;此外,吴世嘉等[49]分别以包被VP抗体的纳米磁珠和上转荧光颗粒为捕获、信号探针,构建了“捕获探针-VP-信号探针”三明治结构式免疫识别及检测方法。通过荧光激发可实现VP的定性及定量检测,灵敏度达103CFU/mL,上转荧光强度与目标菌浓度在5×103~5×105CFU/mL范围内呈良好线性关系。

综上所述,IMS技术可有效提高食品中VP的检测效率,其应用的核心在于高特异性及亲和力免疫磁珠的制备。目前国内磁珠市场仍以瑞士Dynal等品牌为主流,亟需开发我国自主知识产权的高性能免疫磁珠产品。就VP免疫磁珠而言,国内研究者也开展了一定的工作:如黄韵仪[50]和苏晨曦[51]等筛选特异性抗体、磁珠粒径,优化交联条件(活化剂、偶联方法、时间和温度等),获得了捕获性能理想、特异性高的磁珠,为IMS在VP检测中的应用提供了良好资源。

另外,也有研究者不借助纳米磁珠,而是直接将VP抗体包被于PCR管上用于捕获样品中的靶标菌,结合下游VP特异性基因扩增反应,亦可有效提高检测灵敏度[52-53]。2.2 酶联免疫吸附测定

ELISA是将抗原、抗体的特异性免疫反应与酶的高效催化反应性有机结合起来的一项技术,具有特异性强、敏感性高、高通量、检测时间短等优点。借由多种VP特异性抗体,以颜色、荧光或电化学信号变化为指标,ELISA技术在食品VP检测中发挥重要作用。

早在1985年,Honda等[54]比较了3 种形式ELISA检测VP-TDH的效力,结果证实仅夹心型ELISA可高效检测VP纯菌及阳性增菌液,甚至可检出在传统我妻氏培养基上神奈川现象阴性的致病性VP菌。此后,该团队又进一步优化ELISA方案,以尼龙膜为支持介质实现了VP中两种关键溶血素——TDH和TRH的同步可视化检测[55]。王文等[56]将生物素-亲和素系统引入斑点ELISA,利用其放大效应提高检测灵敏度10~100 倍,方法特异性高、准确、快速,对311 份鱼样品检测结果与传统方法无显著性差异,可用于大量鱼样本中VP的快速检测。此后,国内外研究者以溶血素或全菌制备特异性抗体,通过间接竞争ELISA或双抗体夹心ELISA实现食品中VP或致病性VP的快速检测,经优化后检测限多可达103~104CFU/mL[25,34,57-60]。其中Kumar等[34]建立的ELISA法虽以TRH融合蛋白抗体为探针,但与TDH阳性VP存在交叉反应,无法区分两种溶血素携带菌。

除了上述传统意义上基于酶-底物显色反应的ELISA法外,Wang Ling等[61]首次以胶体金和Cd/Te量子点分别标记VP-PAbs和-MAbs,构建量子点探针-金标抗体-样品的“三明治”型免疫反应体系,基于胶体金可猝灭量子点荧光的原理建立了VP荧光猝灭免疫测定法。该方法特异性强、灵敏,荧光强度与纯VP浓度对数线性相关度达99.7%,可用于食品中VP的快筛及定量检测。

2.3 免疫层析检测

尽管ELISA因其高灵敏性及准确性被誉为免疫检测的金标准,但其实施需要酶标仪等检测仪器、严格的环境条件及专业操作人员,不适用于现场、即时检测。ICA将ELISA方案整合至层层叠加的试纸条上,为现场便携式免疫检测提供了良好的平台[62]

以胶体金、磁性颗粒、荧光基团等为标记,借由颜色、磁性、电化学、荧光等信号指示,国内外研究者开发了多种ICA用于食品中VP的快速检测。如Guo Ailing等[63]以灭活全菌免疫兔子制备了VP特异性MAbs和PAbs,前者与胶体金交联作为信号显示抗体,后者固定于T线上作为捕获抗体,制备了双抗体夹心ICA。产品高度特异,可在15 min内肉眼直读浓度不小于105CFU/mL的纯菌或经10 h增菌后的食品样本信号,其保质期在37 ℃条件下可长达90 d。传统胶体金标记ICA通过金颗粒聚集效应显色而实现信号解析,其信号强度有一定的局限性,可能导致误判。为克服上述不足,王广峰等[64]通过添加金标二抗进一步提高阳性样品检测线上的金颗粒浓度,有效增强VP试纸条的显色度。此外,除了上述采用MAbs/PAbs组合建立的ICA外,也可采用针对不同抗原表位的两种MAbs,以此构建的免疫检测特异性更强,但成本高。如以VP的F0F1ATP合成酶δ-亚基的两个不同抗原表位制备两种高特异性MAbs并建立夹心型胶体金ICA,Sakata等[65]实现了VP菌落的快速、简易化鉴定以替代冗繁的传统生化反应,特异性检测结果显示其对多达218 株供试菌株表现出100%准确检测。

胶体金标记ICA以肉眼判读颜色信号实现结果解析,仅可用于靶标物的定性及半定量检测,难以准确定量。近年来,许多新型标记方式被不断发掘,结合仪器判读ICA信号实现更精确的定量检测[66]。Liu Yingying等[67-68]以磁性纳米颗粒代替胶体金标记抗体,以磁信号阅读仪替代肉眼读取信号,优化并建立了双抗体夹心式磁性ICA,可在10 min内检出低至1.58×102CFU/mL的VP,有效增敏两个数量级,对新鲜海产品从前处理至信号读取的整个检测流程仅需4.5 h。

2.4 免疫传感器

利用抗原、抗体结合前后引发的质量、光学、热学及电化学等信号的变化,国内外研究者研发出多种免疫传感器用于食源性病原菌检测[69]

赵广英等[70-72]将VP抗体掺入Nafion、硫堇和纳米金、琼脂糖和纳米金、壳聚糖-SiO2杂化膜,吸附于电极表面制备免疫电极,连接循环伏安表征设备研制电化学免疫传感器。通过监测免疫反应前后电流信号的变化,上述传感器可特异、稳定、准确地检测VP,检测限为103~104CFU/mL。上述免疫传感器的研制仍停留在初步优化阶段,未测试其对实际食品样本的检测效力。近期,Sha Yuhong等[73]将化学发光试剂N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol,ABEI)和未标记的VP抗体固定于氧化石墨烯上制备电化学发光免疫传感器,可用于海水及海产品中VP的定性及定量检测,其线性定量范围宽(10~108CFU/mL),可检测染菌浓度低至5 CFU/g的水产品及5 CFU/mL的海水,远优于现有的电化学免疫传感器、PCR、LAMP及免疫荧光显微术等VP快检方法。石墨烯材料良好的电子传递能力及其二维结构保障的较大比表面积使得吸附于其上的ABEI充分发挥其电化学活性,从而大大提高了检测灵敏度。

2.5 免疫荧光显微术

以丫啶橙、异硫氰酸等荧光染料标记二抗,借助荧光显微镜,可实现食品中VP的免疫检测。如于光等[74]建立了适用于鱼贝类中VP检测的丫啶橙免疫荧光菌团培养-沉淀法,检测限为105CFU/mL,特异性强,对市售351 份海产鱼贝类样品中VP定性检测结果与常规培养法无显著性差异,全程可在27 h内完成,简便快速。以2 种外膜蛋白为抗原制备VP抗体,结合异硫氰酸标记二抗,Chen等[75]亦以IFM检测海蛎中的VP,经18 h预增菌后该方法可检出染菌浓度低至1.7 CFU/g的样品。此外,间接IFM还被用于检测活的非可培养状态VP[76]及凡滨对虾红体病病原检测[77]

2.6 其他免疫技术的应用

除了上述IMS、ELISA、ICA等主流免疫检测法外,还有诸如乳胶凝集反应[29,78-79]、免疫共沉淀[80]、流式细胞术[81]等基于抗原-抗体特异性结合反应的方法被用于VP的鉴定,方法灵敏度高、特异性强,检测效果与传统方法高度契合。后续随着抗体制备技术及免疫方法的不断发展,必将有更多免疫检测技术被引入以实现食源性VP更精准、快速的检测。

3 结 语

VP因其嗜盐性,主要污染各类海产品[82],但亦出现于肉类等产品中[83-84],甚至冷冻保存食品也成为传播致病性VP的媒介[85]。VP污染食品门类广,加之贸易全球化趋势不断加强,VP致食物中毒事件数量不断攀升,严重威胁人类健康。

当前食源性VP的检测仍主要依赖传统培养法,不仅操作冗繁,从增菌、分离至生化鉴定全程耗时3~5 d[86],而且因VP与其他弧菌在形态及生化性状上的相似性还可能导致结果误判[87-88]。近年来发展起来的以PCR为基础的分子检测技术具有快速、特异、灵敏等优点,为食品中VP的鉴定提供了可选方案,但其应用首先需制备样品DNA且扩增反应易受到食品基质的干扰,不适用于现场检测,且检测结果亦无法区分死活菌。而以特异性抗体为基础,借助抗原-抗体特异性识别反应进行检测的免疫学方法则不仅在检测效率、特异性上具有与分子学方法相媲美的优势,而且在现场适用性、免提取等前处理简便性、高通量等方面显现突出优势,有效弥补了传统培养法的不足,为食品中VP的快速鉴定、分型提供了理想平台。

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Recent Advances in Application of Immunological Methods in Detection of Foodborne Vibiro parahaemolyticus

XIE Xueqin1, LIU Zhou2,*
(1. Xiamen Products Quality Supervision & Inspection Institute, Xiamen 361004, China; 2. Depatment of Pharmacy, Xiamen Medical College, Xiamen 361008, China)

Abstract:The bacterial pathogen Vibrio parahaemolyticus (VP) can pollute a variety of foods, especially seafoods. Foodborne VP has surged as the primary pathogen in food safety incidents in China. Compared to traditional cultural methods and modern molecular techhniques, specific antigen-antibody recognition-based immunological identification and subtyping strategies exhibit superiority in efficiency, specificity, on-field applicability and simplicity of pre-treatment. In this paper, the category and preparation methods of anti-VP antibodies at present are outlined. Furthermore, we review the current applications of immunological methods such as immunomagnetic separation (IMS), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunochromatographic assay (ICA), immunosensor and immunomicroscopy in the detection of foodborne VP, which will provide useful references for rapid detection of VP.

Key words:foodborne Vibrio parahaemolyticus; immunomagnetic separation (IMS); enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); immunochromatographic assay (ICA); immunosensor; immunofluorescence microscopy (IFM)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713048

中图分类号:TS207.4

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)13-0299-07

引文格式:

谢雪钦, 刘舟. 免疫学方法在食源性副溶血性弧菌检测中的应用研究进展[J]. 食品科学, 2017, 38(13): 299-305. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713048. http://www.spkx.net.cn

XIE Xueqin, LIU Zhou. Recent advances in application of immunological methods in detection of foodborne Vibiro parahaemolyticus[J]. Food Science, 2017, 38(13): 299-305. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713048. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-05-26

基金项目:厦门市科技计划项目(3502Z20154086);福建省自然科学基金青年科技人才创新项目(2014J01118)

作者简介:谢雪钦(1982—),女,高级工程师,博士,研究方向为食品安全检测及风险评估。E-mail:cherryxie36@163.com

*通信作者:刘舟(1983—),男,副教授,博士,研究方向为食品安全检测及风险评估。E-mail:lau_joe@163.com