豆酱微生物宏蛋白质组提取及分析

乌日娜1,2,薛亚婷1,张 平1,唐筱扬1,陶冬冰1,岳媛媛1,张鹏飞1,陈 卫2,*

(1.沈阳农业大学食品学院,辽宁 沈阳 110866;2.江南大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,江苏 无锡 214122)

摘 要:为了更进一步探索豆酱中微生物群体的功能,实验利用分步提取法,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳,建立了豆酱微生物宏蛋白质组表达谱,并利用液相色谱-质谱/质谱联用技术对蛋白质进行鉴定。结果显示,共鉴定出232 种蛋白质,可归为糖代谢60 种、核酸代谢57 种,蛋白质代谢48 种,能量代谢15 种,脂质代谢3 种,其他功能蛋白质49 种。来源于细菌的蛋白质数量几乎为来源于真菌蛋白质数量的3 倍,其中细菌来源以枯草芽孢杆菌、明串珠菌、粪肠球菌、肠膜明串珠菌和德氏保加利亚乳杆菌为主,真菌来源以酿酒酵母、裂殖酵母、链孢霉、白腐菌和棉阿舒囊霉为主。

关键词:豆酱;宏蛋白质组;蛋白质功能;微生物来源

豆酱营养丰富、香气馥郁,是东北很多家庭的必备食品,而且传承着冬季做酱的传统习俗。豆酱的品质和风味与其中的微生物组成密切相关,目前对豆酱中微生物研究已经由纯培养菌种特性研究,如乳酸菌[1-3]、酵母菌[4]、霉菌[5]等,转向利用变性梯度凝胶电泳技术、新一代测序技术等对其中微生物多样性进行研究[6-8],例如Nam等[9]利用454焦磷酸测序技术对韩国豆酱细菌多样性进行了分析,提供丰富的物种组成信息。

宏蛋白质组学的概念是在宏基因组学[10-11]概念的基础上提出的,他们有着共同的优点:将研究对象从单一微生物拓展到复杂的微生物群落,不再依赖于微生物培养[12-14],但宏基因组学存在诸多限制:如DNA提取较困难,纯度要求高,克隆表达效率低,需要筛选完整的功能基因组,构建大片段的基因组文库十分复杂[15];重复基因和基因表达的时空特异性也为研究增加了阻碍。转录也面临RNA易降解,萃取时产生的腐殖质难消除,即使相似的基因在不同群落的转录动力学也不同,RNA与相关蛋白质合成关联性低等问题[16]。宏蛋白质组学的兴起很大程度上弥补了这些缺陷。其对于所研究微生物群体的限制性较小,鉴定蛋白质时无需标记,可通过反向遗传学推测氨基酸序列获得相应的编码基因信息,追踪复杂环境中微生物群体的功能[17-18],对宏基因组学起到补充作用,将宏基因组数据和自然环境的生物过程联系在一起。宏蛋白质组学在蛋白质鉴定、种系发生以及微生物群体的功能性分析等方面都更具优势[19]。2004年Rodríguez-Valera[20]首次提出宏蛋白质组的概念,是指复杂环境微生物群落中所有生物的蛋白质组总和。孔令琼等[21]利用该技术鉴定了黄酒麦曲浸提液中所有可溶性蛋白质,为探索微生物与黄酒风味之间的关系奠定了基础。张武斌[22]利用宏蛋白质组学技术对清香白酒生产常用的3 种大曲进行分析,检测到酿酒酵母合成的乙醇-O-酰基转移酶,确认其为清香白酒酯化功能菌。豆酱中微生物宏蛋白质组还鲜有报道,它是指豆酱中所有微生物产生的全部蛋白质。豆酱微生物宏蛋白质组研究,可为发现功能蛋白质标记物、种系发生以及微生物群体的功能性分析提供依据,也为进一步揭示微生物与豆酱品质形成关系提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

采集自辽宁省沈阳市农家利用传统自然发酵方法制备的豆酱,用保温箱带回实验室,放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.1.2 试剂

丙烯酸胺、Tris、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、四甲基乙二胺(N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine,TEMED)、N,N-甲叉双丙烯酞胺、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA) 美国Sigma公司;尿素、硫脲、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、溴酚蓝、3-((3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基)-1-丙磺酸(3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio) propanesulfonate,CHAPS) 美国Bio-Rad公司;过硫酸铵(ammonium persulphate,AP)、苯甲基 磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、冰乙酸、无水乙醇、丙酮、考马斯亮蓝G-250 北京鼎国生物技术有限公司。

裂解液:称取尿素8.408 1 g,硫脲3.044 8 g,CHAPS 0.8 g,蛋白质酶抑制剂PMSF 0.003 5 g,DTT 0.2 g于20 mL容量瓶中,加入去离子水定容混匀,分装至2 mL离心管,-20 ℃条件下保存。

1.1.3 仪器与设备

Centrifuge 5418R小型台式冷冻离心机 德国Eppendorf公司;脱色摇床 上海华亭科学仪器厂;细胞超声仪 上海豫明仪器有限公司;分析天平 荣华仪器有限公司;CDS8000型UPV凝胶成像分析系统、Mini电泳系统、电泳仪 美国Bio-Rad公司;恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司;VS-1型涡旋仪 上海泸西分析仪器厂有限公司;Cary 50紫外-可见分光光度计 美国Varian公司;Q-Exactive质谱仪 美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物宏蛋白质组的提取

1)样品初步处理:取豆酱样品70 g放于500 mL离心桶中,加入200 mL磷酸盐缓冲液,放入直径1 cm的玻璃珠30 颗,涡旋仪振荡离心桶10 min。将玻璃珠取出,2 000 r/min离心20 min,取出上清液;沉淀中加入150 mL磷酸盐缓冲液摇匀,2 000 r/min离心20 min,取上清液;将收集的所有上清液2 000 r/min离心20 min后,收集上清液,弃去沉淀。

2)收集菌体沉淀,提取蛋白质:将所得上清液6 000 r/min离心20 min,将沉淀移至研钵中,利用液氮研磨辅助10% TCA/丙酮方法提取蛋白质,得到蛋白质粉末[23]

3)上清液中提取蛋白质:将6 000 r/min离心后所得的上清液12 000 r/min离心20 min,收集沉淀物,用5 mL磷酸盐缓冲液清洗后12 000 r/min离心20 min收集沉淀物并转移至2 mL离心管,每管加入1.5 mL丙酮清洗沉淀,放入-20 ℃冰箱静置2 h,12 000 r/min离心20 min,弃上清液,收集沉淀物,重复2 次,沉淀冰上风干得到胞外蛋白质粉末。

1.2.2 微生物宏蛋白质组的裂解

分别取适量沉淀和上清液蛋白质粉末于2 mL离心管中,按照0.1 g/mL加入裂解液,20%(26 W)功率超声助溶20 min,工作2 s停3 s,12 000 r/min离心1 h,取上清液。

1.2.3 蛋白质定量

配制10 mg/mL BSA母液,稀释至1 mg/mL,按照Bradford微量蛋白质测定法制作标准曲线,测定蛋白质样品的质量浓度[20]

1.2.4 SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测提取效果

利用SDS-PAGE对从豆酱中提取的微生物胞内和胞外宏蛋白质组进行检测。分离胶质量浓度为12g/100mL,浓缩胶浓度为5g/100mL。电泳程序为:80 V,15 min; 120 V至电泳结束。

1.2.5 液相色谱-串联质谱联用技术(liquid chromatographytandem mass spectrometry,LC-MS/MS)鉴定宏蛋白质组

将电泳后的蛋白质泳道切下,放入1.5 mL离心管中,加入1 mL灭菌的去离子水,利用LC-MS/MS进行蛋白质鉴定(北京华大蛋白质研究公司),使用Mascot 2.3.01进行数据搜索。

2 结果与分析

2.1 微生物宏蛋白质组定量结果

豆酱中微生物胞内宏蛋白质组蛋白质量浓度为5.45 mg/mL,胞外宏蛋白质组蛋白质质量浓度为5.12 mg/mL。胞内和胞外蛋白质样品的质量浓度均大于5 mg/mL,能够满足SDS-PAGE的需要。

2.2 SDS-PAGE结果

图1 豆酱中微生物宏蛋白质组SDS-PAGE结果
Fig. 1 SDS-PAGE of metaproteome in fermented soybean paste

豆酱中微生物胞内和胞外宏蛋白质组的电泳结果如图1所示,胞外蛋白质条带集中分布在15~40 kD以及70~120 kD之间,胞内蛋白质可见11 条较清晰的蛋白质条带,这些蛋白质的分子质量在15~160 kD之间。在15~120 kD之间有8 条颜色较深的蛋白质条带,说明在这个分子质量区间的蛋白质数量较多,在120~160 kD之间有3 条颜色较浅的蛋白质条带,说明在这个分子质量区间的蛋白质数量较少。

2.3 微生物宏蛋白质组LC-MS/MS鉴定结果

利用LC-MS/MS对豆酱中微生物宏蛋白质组进行检测,搜索细菌和真菌数据库,其中蛋白质评分在38 分以上为可信(P<0.05)。在豆酱微生物宏蛋白质组中,共鉴定出232 种蛋白质,其中包括173 种细菌蛋白质,59 种真菌蛋白质,见表1、2。

表1 细菌蛋白质鉴定结果
Table 1 Identification of bacterial proteins

续表1

续表1

续表1

续表2

表2 真菌蛋白质鉴定结果
Table 2 Identification of fungal proteins

综合分析,在232 种蛋白质中,与糖代谢相关的蛋白质60 种,占25.9%,与核酸代谢相关的蛋白质57 种,占24.6%,与蛋白质代谢相关的蛋白质48 种,占20.7%,与能量代谢相关的蛋白质15 种,占6.5%,与脂质代谢相关蛋白质3 种,占1.3%,其他功能蛋白质49 种,占21.1%。

微生物通过糖代谢为机体供能,并继续进行糖类的合成和分解。在微生物宏蛋白质组中,检测到与糖代谢相关的蛋白质数量最多。而核酸与微生物生长密切相关,其数量次之。蛋白质的表达要经过起始、延伸和终止3 个步骤,每一步都需要各种蛋白质发挥作用[24],其中,与谷氨酸代谢相关的蛋白质数量占优势,可能与其风味相关。

2.4 基于宏蛋白质组微生物来源分析

宏蛋白质组来源于72 种细菌,23 种真菌。其中来自枯草芽孢杆菌的蛋白质有14 种,占6.0%,来自明串珠菌的蛋白质有13 种,占5.6%,来自粪肠球菌的蛋白质有11 种,占4.7%,来自肠膜明串珠菌和德氏保加利亚乳杆菌的蛋白质有7 种,各占3.0%,来自鲍曼不动杆菌、肠杆菌和大肠杆菌的蛋白质有5 种,各占2.2%,来自大肠杆菌O157:H7、恶臭假单胞菌、化脓性链球菌血清型M3、解淀粉芽孢杆菌、乳酸乳球菌、嗜盐四联球菌、植物乳杆菌的蛋白质有3 种,各占1.3%,来自其他细菌的蛋白质有85 种,占36.6%;来自酿酒酵母的蛋白质有17 种,占7.3%,来自裂殖酵母的蛋白质有8 种,占3.4%,来自链孢霉的蛋白质有4 种,占1.7%,来自白腐菌和棉阿舒囊霉的蛋白质有3种,各占1.3%,来自其他真菌的蛋白质24 种,占10.3%。

图2 基于宏蛋白质组微生物来源分布图
Fig. 2 Microbiota of fermented soybean paste based on metaproteomic analysis

豆酱微生物宏蛋白质组中,来源于细菌的蛋白质数量几乎为来源于真菌蛋白质数量的3 倍,其中细菌来源以枯草芽孢杆菌、明串珠菌、粪肠球菌、肠膜明串珠菌和德氏保加利亚乳杆菌为主,真菌来源以酿酒酵母、裂殖酵母、链孢霉、白腐菌和棉阿舒囊霉为主。

目前已报道的豆酱中的优势细菌相关研究,包括明串珠菌、芽孢杆菌和肠杆菌等[25-28]。芽孢杆菌可协助真菌分解大豆中的蛋白质和淀粉,而明串珠菌则与豆酱中风味物质的形成相关。尤其是明串珠菌在其中占有优势,与本团队利用宏基因组技术进行的分析,结果一致。之前的研究都还未明确确定明串珠菌在豆酱发酵过程中的重要地位,因此,本团队将继续进行相关研究。此外,棉阿舒囊霉为豆酱中新发现的优势菌种。

除此之外,白色念珠菌、马链球菌、恶臭假单胞菌为条件致病菌,金黄色葡萄球菌为病原菌,希瓦氏菌为腐败菌,创伤弧菌可造成感染,蜡状芽孢杆菌、威氏李斯特菌血清型6b可引起食物中毒,耻垢分枝杆菌可引起皮肤和软组织感染,这些菌种可能来自于环境,也可能是发酵时产生的,它们对食用豆酱的安全性造成了威胁,因此对有害菌种的监控还需加强。

3 结 论

实验利用宏蛋白质组学技术,对豆酱中微生物组成和蛋白质功能进行了分析。其中,来源于细菌的蛋白质数量几乎为来源于真菌蛋白质数量的3 倍,说明了发酵过程中细菌逐渐取代真菌,占主导地位,而且明串珠菌可能在豆酱发酵过程中起到重要作用。从蛋白质功能角度,以糖代谢、核酸代谢和蛋白质代谢为主,其中的功能酶及与豆酱风味相关的酶类需要进一步研究。

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Metaproteomic Analysis of Traditional Fermented Soybean Paste in Northeast China

WU Rina1,2, XUE Yating1, ZHANG Ping1, TANG Xiaoyang1, TAO Dongbing1, YUE Yuanyuan1, ZHANG Pengfei1, CHEN Wei2,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract:In order to under the function of the microbial community in fermented soybean paste, we established a metaproteomic expression profile by stepwise extraction and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The proteins extracted were identified by liquid chromatography tandem mass spectrometry-mass spectrometry (LC-MS/MS). Results obtained were as follows: the number of proteins identified in fermented soybean paste was 232, including 60 proteins participating in sugar metabolism, 57 proteins involved in nucleic acid metabolism, 48 proteins involved in metabolism, 15 proteins related to energy metabolism, 3 proteins related to lipid metabolism and 49 other functional proteins. The number of proteins derived from bacteria was almost three times as large as the number of proteins derived from fungi. Bacterial proteins were mainly derived from Bacillus subtilis, Leuconostoc, Fecal streptococcus, Leuconostoc mesenteroides and Deshi Lactobacillus, while fungal proteins mainly came from Saccharomyces cerevisiae, Fission yeast, Alternaria, white rot fungi and Ashbya gossypii.

Key words:fermented soybean paste; metaproteomics; protein function; microbiota

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714003

中图分类号:TS201.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)14-0017-07

引文格式:乌日娜, 薛亚婷, 张平, 等. 豆酱微生物宏蛋白质组提取及分析[J]. 食品科学, 2017, 38(14): 17-23.

DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201714003. http://www.spkx.net.cn WU Rina, XUE Yating, ZHANG Ping, et al. Metaproteomic analysis of traditional fermented soybean paste in northeast China[J]. Food Science, 2017, 38(14): 17-23. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714003. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-06-29

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31471713);中国博士后科学基金项目(2014M560395);辽宁省农业领域青年科技创新人才培养计划项目(2014048);辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目(LR2015059);江苏省博士后科研资助计划项目(1402071C)

作者简介:乌日娜(1979—),女,副教授,博士,研究方向为食品生物技术。E-mail:wrn6956@163.com

*通信作者:陈卫(1966—),男,教授,博士,研究方向为食品生物技术。E-mail:chenwei66@jiangnan.edu.cn