植物乳杆菌发酵对豆粕蛋白结构的影响

张莉丽1,崔 宪2,张功圣1,姜 帆1,刘容旭1,韩建春1,3,*

(1.东北农业大学食品学院,黑龙江 哈尔滨 150030;2.中国农业大学工学院,北京 100083;3.国家大豆工程技术研究中心,黑龙江 哈尔滨 150030)

摘 要:利用植物乳杆菌发酵降解低温豆粕乳,研究其中大豆蛋白结构的变化。随发酵时间的延长,样品水解度和体外消化率均呈升高趋势,可溶性蛋白粒径分布向低粒径方向移动,说明脱脂豆粕中大豆蛋白经发酵后有一定程度的降解。同时,发酵处理后提取的大豆蛋白与原始大豆蛋白和发酵0 h时提取的大豆蛋白相比,蛋白分子进一步展开,β-折叠含量升高,α-螺旋含量降低,荧光光谱中最大吸收波长发生红移,暴露巯基含量升高。另外,扫描电子显微镜观察结果表明大豆蛋白经发酵后表面不再光滑,出现腐蚀性孔洞。

关键词:植物乳杆菌;豆粕;蛋白结构;发酵

大豆是我国四大油料作物之一,低温脱脂豆粕是油脂加工中的副产物,富含大量蛋白质,其必需氨基酸含量十分接近联合国粮农组织/世界卫生组织推荐的比例,是十分优良的植物性蛋白质之一,同时不含胆固醇,易于消化,这一点优于动物性蛋白,因此被广泛应用于食品产业中。但在提取油脂和制备脱脂豆粕后,通过传统工艺提取大豆蛋白会造成大豆蛋白的部分变性,导致功能性质的降低[1]。要想得到具有良好功能特性的大豆蛋白,需对其改性。

大部分改性方法是将大豆蛋白提取制备后,通过物理法、化学法和酶法对蛋白质结构进行改性或修饰,以达到改善其功能性质的目的[2-4],但这些方法目前或多或少存在一些问题,例如化学试剂残留、安全性降低、生产成本高、改性效果不明显、产生不良风味、原料利用率低等问题[5]

前期研究发现,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)具有良好的发酵大豆乳的能力[6],并且通过其发酵可以改善豆粕蛋白的功能特性[7]。对于某些人来说,大豆球蛋白是重要的过敏源[8]。乳杆菌发酵可以分解大豆球蛋白从而降低其过敏性[9-10]。因此利用乳杆菌发酵大豆蛋白将是未来的一个研究热点。目前,虽然有一些关于发酵提高大豆蛋白营养价值的研究[11],但是鲜有关于乳酸菌发酵对其结构影响的相关报道。

本研究以脱脂豆粕为原料,通过L. plantarum液态发酵一定时间后,利用传统的碱溶酸沉法提取大豆蛋白后,测定其结构变化,研究L. plantarum发酵过程中大豆蛋白结构改变情况,为改善大豆蛋白功能性质提供新方法和一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

L. plantarum KLD1.0391,东北农业大学乳品科学教育部重点实验室保存。

液体MRS培养基用于菌种活化。

大豆乳培养基(豆与蒸馏水比例为1∶10(g/mL),磨成豆浆):用于菌种活化和发酵剂制备[12]

1.2 仪器与设备

PB-10型精密酸度计 德国赛多利斯公司;Ultrospec 1100 pro型紫外-可见分光光度计 美国通用电气公司;电泳仪 美国Bio-Rad公司;TU-1901双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;Kjeltec 8400型全自动凯氏定氮仪 丹麦Foss公司;F-4500荧光分光光度计、J-815CD Spectrometer圆二色光谱仪 日本Jasco公司;S-3400N扫描式电子显微镜 日本Hitachi公司;Zetasizer Nano粒度仪 英国马尔文仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆蛋白工艺流程

脱脂豆粕→粉碎研磨→过筛(100 目标准筛)→豆粕乳(按1∶12的固液比与水混合)→杀菌(95 ℃,10 min)→冷却→接入种子发酵剂→发酵至0、3、6、9、12 h→碱溶酸沉提取蛋白→透析除盐→冷冻干燥→大豆蛋白样品

1.3.2 水解度测定

采用王波等[13]的三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)法,略有改动。将一定量经发酵前后提取的大豆蛋白样品,添加15% TCA溶液定容至10 mL,混合振荡,静置10 min后,4 000×g离心15 min,取上清液,样品总氮和上清液中可溶性氮含量采用凯氏定氮法[14]测定。水解度根据公式(1)计算。

式中:N1为原始大豆蛋白溶液(添加15%TCA)中可溶性氮含量/(g/100 mL);N2为原始大豆蛋白中总氮含量/(g/100 mL);N3为经发酵后提取的大豆蛋白溶液(添加15% TCA)中可溶性氮含量/(g/100 mL)。

1.3.3 体外消化率测定

称量200 mg大豆蛋白样品,置于锥形瓶中,添加15 mL 0.1 mol/L HCl溶液(含1.5 mg胃蛋白酶)。将锥形瓶在37 ℃条件下水浴3 h后,添加3.3 mL 0.5 mol/L NaOH溶液和7.5 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液(pH 8.0,含4 mg胰酶),将混合液在37 ℃条件下水浴24 h后,添加10 mL 10% TCA终止反应,在室温下5 000×g离心20 min,得到上清液,通过凯氏定氮法测定上清液和样品中的含氮量。蛋白质体外消化率按公式(2)计算。

1.3.4 粒径分布测定

将大豆蛋白样品溶于0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0),室温下搅拌2 h,离心去除沉淀,上清液在4 ℃存放过夜以确保蛋白完全溶解,Lowry法[15]测定蛋白质量浓度,稀释成1 mg/mL蛋白质溶液,采用Zetasizer Nano粒度分布仪在25 ℃测定蛋白质样品中可溶性蛋白的粒径分布[16]

1.3.5 暴露巯基含量的测定

参照Beveridge等[17]的方法测定。

1.3.6 圆二色谱测定

本研究利用圆二色谱谱在远紫外区(260~180 nm)测定蛋白质二级结构[18]。空白为去离子水,所得数据用摩尔椭圆率表示。数据由Jasco公司提供的Yang’s程序来分析大豆蛋白的二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲所占的比率。

1.3.7 荧光光谱的测定

参考Bonomi[19]的测定方法。

1.3.8 扫描电子显微镜的测定

样品处理参照Ghosh等[20]的方法,样品的微观结构使用扫描电子显微镜进行观测,加速电压为5 kV。样品在观察前用离子喷射器在大豆分离蛋白粉表面喷15 nm的金箔[21]

2 结果与分析

2.1 发酵对豆粕蛋白的水解度和体外消化率的影响

在前期研究中发现发酵12 h后L. plantarum生长逐步进入生长平稳期,pH值下降缓慢,所产蛋白酶活力下降,所以在发酵0、3、6、9、12 h提取的大豆蛋白作为实验样品,以原始大豆蛋白为对照组,比较蛋白水解度、体外消化率的变化。研究在L. plantarum发酵过程中大豆蛋白降解的变化情况。

图 1L. plantarum发酵对大豆蛋白水解度和体外消化率的影响
Fig. 1 Effect of L. plantarum fermentation on in vitro digestibility and DH of soybean proteins

由图1可知,随着发酵时间的延长,大豆蛋白水解程度呈现发酵前期增加快速后期缓慢的趋势,这可能是随着发酵时间延长,发酵底物不断被消耗,质量浓度降低,所产蛋白酶也逐渐失活,乳酸菌产生的代谢物与酶以复合体形式存在,抑制蛋白酶的活力,所以发酵后期大豆蛋白水解程度缓慢增加,发酵12 h时提取的大豆蛋白水解度达到6.25%。这些结果表明L. plantarum所产蛋白酶、肽酶对大豆蛋白有一定降解作用,这与Aguirre等[22]的研究结果一致。随着发酵时间的延长,经发酵后提取的大豆蛋白体外消化率逐渐升高,主要是因为发酵后,蛋白质多降解为多肽、小肽及游离氨基酸等,这与刘海燕[23]研究结果一致。另外,王乃富[24]在研究中也得到类似结果,其利用乳酸菌发酵大豆粉时发现大分子蛋白质发生降解。

2.2 发酵对可溶性大豆蛋白粒径分布的影响

本研究通过测定发酵前后可溶性大豆蛋白的粒径分布变化,以原始可溶性大豆蛋白作为对照组,研究L. plantarum对大豆蛋白降解作用的影响,结果如图2和表1所示。

由图2可知,所有样品的粒径分布均呈双峰分布,与原始可溶性大豆蛋白相比较,发酵0 h时提取的可溶性大豆蛋白的粒径主要分布区域向高粒径方向移动,是由于灭菌热处理导致大豆蛋白发生部分聚集,产生一些可溶性聚集体[25],但是平均粒子直径并无明显改变。原始可溶性大豆蛋白的双峰主要分布在10~100 nm和100~1 000 nm处,经过发酵后提取的可溶性大豆蛋白的双峰主要分布在1~10 nm和10~100 nm处,表明经过发酵后提取的大豆蛋白的粒径主要分布区域逐渐向低粒径方向移动。

图2 发酵前后可溶性大豆蛋白的粒径分布
Fig. 2 Particle size distribution of soybean proteins with different fermentation times

表1 发酵前后可溶性豆粕蛋白的平均粒径和多分散系数
Table 1 Average particle size and polydispersity index of soluble soybean proteins with different fermentation times

由表1可知,与原始可溶性大豆蛋白相比,经过发酵处理的可溶性大豆蛋白平均粒子直径,随着发酵时间延长逐渐降低。这可能是由于乳酸菌发酵可以有效的降解大豆蛋白[22],导致可溶性大豆蛋白的平均粒径的降低。

2.3 发酵对豆粕蛋白二级结构的影响

图3 原始和发酵后大豆蛋白样品的圆二光谱图
Fig. 3 Circular dichroism spectra of soybean proteins with different fermentation times

如图3所示,所测样品均在193 nm附近出现正峰;在219 nm附近出现负肩峰;在207 nm及222 nm处出现负卧槽;192 nm处出现的正峰及219 nm附近出现的负肩峰表示大豆蛋白结构中存在β-折叠结构,α-螺旋结构所引起的负科顿效应会使大豆蛋白在207 nm以及222 nm处形成负凹槽;220~230 nm之间出现的较弱小正峰表示大豆蛋白中有无规则卷曲的存在;β-转角在205 nm附近有一微小正峰。由此可以看出大豆蛋白处理前后二级结构中都包括α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲结构的。这与通过CD-PRO软件分析的结果(表2)一致。

表2 原始和发酵后大豆蛋白样品圆二色谱二级结构分析
Table 2 Secondary structure of soybean protein samples estimated from circular dichroism spectra

注:同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

由表2可知,发酵0 h时提取的大豆蛋白二级结构中β-折叠比原始大豆蛋白显著升高(P<0.05),这与大豆蛋白加热处理有关。研究表明大豆蛋白加热温度超过80 ℃时,亚基解离,分子结构展开,导致β-折叠含量增多,同时α-螺旋结构减少[26]。发酵至3、6、9、12 h时提取的大豆蛋白与原始大豆蛋白比较二级结构中β-折叠含量均显著升高(P<0.05);无规则卷曲含量均显著降低(P<0.05);α-螺旋结构含量呈现随发酵时间的延长先降低后升高。β-折叠是通过肽链间或肽段间的氢键维系,它的增多表示肽链间有更多的氢键形成,而β-折叠含量的增加有利于功能特性的改善[27]。所以,推断发酵后提取的大豆蛋白较未发酵的蛋白具有更好的功能性质,这与前期研究结果——发酵有助于改善大豆蛋白功能性质一致[7]。这些结果说明L. plantarum发酵使大豆蛋白分子内部氢键排列产生了改变,同时有更多氢键形成,导致大豆分离蛋白构象发生改变。

图4 大豆蛋白样品的荧光图谱
Fig. 4 Fluorescence emission spectra for soybean protein samples

表3 大豆蛋白样品荧光图谱结果
Table 3 Maximum fluorescence emission wavelengths of soybean protein samples fermented for different periods of time and corresponding fluorescence intensities

2.4 发酵对豆粕蛋白分子构象的影响本研究采用荧光光谱法测定蛋白质分子构象的变化,所得图谱主要是色氨酸作为发色基团的荧光光谱,用以表征色氨酸微环境的变化。由图4可知,发酵处理对大豆蛋白的荧光光谱形状无显著影响,但其最大吸收波长和荧光强度都发生改变。由表3可知,本实验所有样品的λmax都大于330 nm,表明色氨酸残基都位于蛋白质分子外部的极性环境中。与原始大豆蛋白相比,发酵至0 h时提取的大豆蛋白的λmax发生红移,目前已有研究证明,热处理后的大豆蛋白分子内部的疏水基团会暴露出来,导致构象改变[28-29]。发酵至3、6、9、12 h时提取的大豆蛋白样品的λmax较原始大豆蛋白的λmax红移更为明显,表明发酵处理可以促进色氨酸侧链转移到蛋白分子表面,导致蛋白质微环境极性的增加。同时发酵后大豆蛋白荧光强度降低,可能是由于发酵破坏了蛋白质结构,造成蛋白质折叠,使发色基团暴露到溶剂中,产生了溶剂猝灭作用,造成荧光强度的降低。这与圆二色谱分析中,经发酵后提取的大豆蛋白β-折叠含量增多的结果一致。

2.5 发酵对豆粕蛋白暴露巯基的影响

图5 发酵前后对大豆蛋白暴露巯基含量的影响
Fig. 5 Contents of free sulfhydryl groups of soybean protein with different fermentation times

巯基基团是大豆蛋白中重要的功能基团,巯基基团的含量与蛋白质变性有关,其他功能特性也相应发生变化,游离巯基可以分为埋藏于分子内部的巯基和暴露在蛋白质表面的巯基。由图5可以看出,各样品的暴露巯基含量的变化。与原始大豆蛋白相比,发酵0 h时(即经过热处理)提取的大豆蛋白巯基含量有所降低(P<0.05),结果与阮奇珺[30]的研究结果一致;而经过发酵处理后提取的大豆蛋白游离巯基含量显著升高(P<0.05),并随着发酵时间的延长,呈现持续上升趋势。L. plantarum在发酵过程中所产蛋白酶对大豆蛋白具有一定的降解作用,目前很多研究表明酶法改性可以提高游离巯基含量[31]。有研究表明,大豆蛋白水解物可以有效抑制巯基形成二硫键,具有较强的抗氧化性,阻止了游离巯基形成二硫键,所以游离巯基含量呈持续升高趋势,蛋白质变性程度加强[32]。这些结果表明,发酵处理可以破坏大豆蛋白分子的内部结构,造成部分结构展开,进而将隐藏于蛋白分子内部的巯基暴露到分子表面。

2.6 发酵对豆粕蛋白微观结构的影响

图6 大豆蛋白样品扫描电子显微镜图(×1 000)
Fig. 6 SEM images of soybean protein samples (× 1 000)

本研究利用扫描电子显微镜观察大豆蛋白微观结构的变化,电子显微镜扫描结果见图6,原始大豆蛋白(图6A)呈现较大的片状结构,且表面十分完整,光滑。而发酵0 h表面不再光滑,而有褶皱出现;随着发酵时间的延长,蛋白表面褶皱更为明显,且已经形成蜂窝状的孔洞,随后变成较大的凹坑,并出现一些蛋白残片,这与蛋白向粒径减小方向移动的规律一致。发酵12 h后,大豆蛋白表面结构已经破坏殆尽,几乎都是被腐蚀的孔洞(图6F)。这些结果表明,在液态发酵的过程中,微生物所产的蛋白酶对大豆蛋白的酶解作用明显。发酵前期乳酸积累量较小时,乳酸菌合成的大量蛋白酶可以降解蛋白质,形成小分子的蛋白,分子结构变得更加简单、伸展,更易暴露。后期蛋白酶活力降低,乳酸积累量较大时,相对而言蛋白分子发生部分聚集。

3 结 论

乳酸菌具有良好降解大豆蛋白的能力。随着L. plantarum发酵低温脱脂豆粕乳的时间延长,样品水解度和体外消化率均呈升高趋势,可溶性蛋白粒径分布向低粒径方向移动,说明豆粕中大豆蛋白经发酵后有一定程度的降解。其次,通过发酵处理后蛋白分子结构发生了变化。发酵至3、6、9、12 h时提取的大豆蛋白与原始大豆蛋白相比,蛋白质分子进一步展开,β-折叠含量升高,同时暴露巯基含量升高。最后,扫描电子显微镜观察结果表明大豆蛋白经发酵后表面不再光滑,出现腐蚀性孔洞,并且随着发酵时间延长,孔洞更加均匀、致密。这些结果表明,经L. plantarum发酵后,豆粕蛋白的结构发生了改变,因而其功能特性得以提高。

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Effects of Lactobacillus plantarum Fermentation on the Structure of Soybean Meal Proteins

ZHANG Lili1, CUI Xian2, ZHANG Gongsheng1, JIANG Fan1, LIU Rongxu1, HAN Jianchun1,3,*
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 3. The National Research Center of Soybean Engineering and Technology, Harbin 150030, China)

Abstract:In the present study, the structural changes of soybean proteins in aqueous suspension of skimmed soybean meal after being fermented by Lactobacillus plantarum were studied. With the extension of fermentation time, the degree of hydrolysis and in vitro digestibility of fermented samples were increased, and the particle sizes of soluble proteins became smaller. These results indicated that soybean proteins were degraded to a certain degree after fermentation. Simultaneously, the molecular structure of proteins in fermented samples was further unfolded, resulting in an increase in beta-sheet content and a decrease in alpha-helix content, as compared to the original soybean proteins and those sterilized at 0 h of fermentation. A red shift in the wavelength of maximum fluorescence emission was observed for the fermented soybean proteins. More sulfhydryl groups were exposed after fermentation. In addition, scanning electron microscopy (SEM) analysis showed that the surface of fermented soybean proteins was not as smooth as that of the original ones, with corrosion pores appearing.

Key words:Lactobacillus plantarum; soybean meal; protein structure; fermentation

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714012

中图分类号:TS214.2

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)14-0078-06

引文格式:张莉丽, 崔宪, 张功圣, 等. 植物乳杆菌发酵对豆粕蛋白结构的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(14): 78-83.

DOI:10.7506/

spkx1002-6630-201714012. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Lili, CUI Xian, ZHANG Gongsheng, et al. Effects of Lactobacillus plantarum fermentation on the structure of soybean meal proteins[J]. Food Science, 2017, 38(14): 78-83. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714012. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-09-13

基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2013AA102208);国家自然科学基金青年科学基金项目(31301545);

中国博士后基金项目(2014M560244);黑龙江省博士后基金项目(LBH-Z13042);

省级科研院所基本科研业务费支持项目;中国博士后基金国际交流项目(20150082);

东北农业大学青年才俊项目(14QC42)

作者简介:张莉丽(1981—),女,副教授,博士,研究方向为蛋白质和发酵工程。E-mail:lilizhang2011@163.com

*通信作者:韩建春(1973—),男,教授,博士,研究方向为蛋白质和发酵工程。E-mail:hanjianchun@hotmail.com