变温发酵模式下豆瓣酱自然发酵过程中细菌多样性研究

周红丽1,2,李 莎1,张 灵1,蒋立文1,2,谭兴和1,2,*

(1.湖南农业大学食品科技学院,湖南 长沙 410128;2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南 长沙 410128)

摘 要:通过DNA提取,聚合酶链式反应扩增以及高通量测序技术对不同温度发酵模式下的豆瓣酱中的细菌进行多样性分析。结果表明:先低温后高温发酵模式下样品得到了2 081 个操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU),而在先高温后低温模式中为1 870 个OTU。在门类水平上,2 种发酵模式中的相对丰度值最高的均为厚壁菌门,分别为72.24%(先低温后高温)和43.84%(先高温后低温);属类水平上为葡萄球菌属,其相对丰度值分别为44.13%和32.52%。先低温后高温发酵模式下细菌物种的丰富度和多样性普遍高于先高温后低温的发酵模式。

关键词:温度模式;豆瓣酱;细菌;多样性

传统发酵豆瓣酱在我国具有悠久的历史,因为其独特的生产工艺,以及发酵过程中包含的多种微生物种类,赋予了传统发酵豆瓣酱特有的风味与功能。近年来,随着传统发酵豆制品生产的现代化和产业化以及消费者对食品安全的要求提高,传统发酵豆瓣酱中的微生物多样性逐渐成为研究热点。

随着科学技术的发展,分子生物学技术,如高通量测序技术在食品微生物多样性研究中的应用越来越广泛。利用分子生物学方法在分子水平上研究微生物的多样性,可以将不同微生物在食品发酵过程中的消长规律以及微生物的种群结构展示出来,同时真实客观地反映出传统食品中微生物群落的组成结构和功能[1-4]。研究发现,细菌、酵母菌和霉菌是豆瓣酱发酵过程中的主要菌种,其所占比例分别为细菌占38.46%、酵母菌占12.09%、霉菌占49.45%[5-10],可见细菌在豆瓣酱发酵过程中担当重要角色。但有些细菌的存在会影响豆瓣酱成品品质,具有潜在安全隐患,如枯草芽孢杆菌、粪链球菌以及微球菌等[11-16]

通过对不同发酵温度模式下不同发酵时期的豆瓣酱进行DNA提取,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增及高通量测序,研究不同发酵温度模式下豆瓣酱细菌种群结构多样性,从而为自然发酵条件下豆瓣酱的质量安全提供有效保证和改进措施。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蚕豆曲 湖南十三村食品有限公司。

Phusion High-Fidelity PCR Master Mix、DNA Library Prep Kit for Illumina(均为分析纯) 纽英伦生物技术(北京)有限公司;产物回收试剂盒、100 bp DNA Ladder 天根生化科技(北京)有限公司;三氯甲烷、Tris-饱和酚、异丙醇、异戊醇(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司;Trans 15K Marker 北京全式金生物公司。

1.2 仪器与设备

HC-1016高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;DZKW-D-2电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司;Qubit DNA定量仪 北京照生行仪器设备有限公司;7100梯度PCR仪 美国Bio-Rad公司;Hiseq2500高通量测序仪 美国Illumina基因测序仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 豆瓣酱的制作

采用不同的发酵模式,即传统先高温后低温发酵温度模式[16-18]和先低温后高温发酵温度模式。按照湖南特色豆瓣成熟瓣子制作工艺制作成熟瓣子:成曲→加盐水→拌曲→发酵→养护→成熟瓣子。2 组发酵所加盐水量、拌曲方式和养护措施都一致,唯一不同的是发酵温度模式不一样。将湖南十三村食品有限公司所提供的蚕豆曲6 kg,分成A、B两组,每组2 个平行,每个平行1 kg,将蚕豆曲与8%盐和30%水按比例混合,放入密闭的玻璃容器中进行发酵,用盐将容器口密封,每2 d将蚕豆曲混匀一次,整个发酵阶段为30 d。A组采取传统的先高温后低温发酵温度模式发酵:50 ℃ 10 d→40 ℃ 10 d→30 ℃ 10 d。B组采用先低温后高温模式发酵:30 ℃ 10 d→40 ℃ 10 d→50 ℃ 10 d。本实验取发酵第0、10、20、30天的4 个时间点的样品,并对其进行编号(表1)。

表1 样品编号
Table 1 Numbers of samples used in this study

1.3.2 不同发酵模式下不同发酵时期豆瓣酱微生物DNA的提取

吸取1 000 μL十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)裂解液至2.0 mL EP管里加入溶菌酶,将适量的豆瓣酱样品加入裂解液中,65 ℃水浴,倒置摇晃使其混合均匀,保证样品可以完全裂解。离心取上清液,加酚(pH 8.0)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1,V/V),颠倒使其混合均匀,12 000 r/min离心10 min。将氯仿-异戊醇(24∶1,V/V)加入上清液中,颠倒使其混合均匀,12 000 r/min离心10 mim。吸取上清液1.5 mL加入离心管里,加入异丙醇,上下摇晃,-20 ℃条件下沉淀。12 000 r/min离心10 min,将液体倒出,尽量避免倒出沉淀。用1 mL 75%乙醇溶液洗涤2 次。加入ddH2O溶解DNA样品,必要时可于55~60 ℃孵育10 min助溶。加RNaseA 1 μL消化RNA,在37 ℃放置15 min[19-21]。将适量的样品用无菌水稀释到1 ng/μL后放置于离心管中,用于检测样品DNA的浓度和纯度。

1.3.3 PCR扩增[22-23]

将稀释后的DNA上清液作为模版,使用带Barcode的特异引物对其进行PCR扩增,16S V4区引物为515F-806R;ITS1区引物为ITS5-1737F、ITS2-2043R。其PCR体系(30 μL)为:15 μL 2×Phusion Master Mix、 3 μL 6 μmol/L Primer、10 μL 1 ng/μL DNA、2 μL ddH2O。反应程序为:98 ℃预变性1 min;98 ℃ 10 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30 个循环;72 ℃ 5 min。

1.3.4 PCR产物的处理

对PCR扩增产物的浓度进行等浓度混样,在充分混合均匀后,使用2%的琼脂糖胶电泳对PCR扩增产物进行纯化,选择主带大小在400~450 bp之间的序列,割胶回收目标条带。

1.3.5 豆瓣酱样品测序

由天津诺禾致源生物信息科技有限公司测定。利用试剂盒构建文库,使用HiSeq对经过Qubit定量和文库检测合格的文库进行测序。

1.3.6 豆瓣酱细菌测序数据分析

通过Uparse等相关软件对结果进行分析[10-14],当豆瓣酱样品序列间的相似性大于97%时就可以判定为同样的操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)。根据OTUs聚类结果,一方面对每个OTU的代表序列做物种注释,从而得到相对应的细菌菌落物种信息,以及菌落物种的丰度分布情况。同时,通过计算分析OTUs丰度以及Alpha多样性,从而得到豆瓣酱样品内菌落物种的丰富度信息、不同样品之间或分组之间共有和特有OTUs信息等。另一方面,可以对OTUs进行多序列比对并构建系统发生树,并进一步得到豆瓣酱不同样品和分组的群落结构差异,通过主坐标分析(principal coordinate analysis,PCoA)和主成分分析(principal compoments analysis,PCA)、非度量多维尺度分析(non-metric multi-dimensional scaling,NMDS)等降维图和样品聚类树进行展示。

2 结果与分析

2.1 豆瓣酱微生物DNA提取及PCR扩增

图1 豆瓣酱微生物总DNA提取电泳图
Fig. 1 Electrophoretogram of total bacterial DNA extracted from soybean paste

图2 PCR扩增产物电泳图
Fig. 2 Electrophoretogram of PCR amplified products

图1 为不同发酵温度模式下不同发酵时间14 个豆瓣酱样品总DNA提取的电泳图,可以看出所提取DNA的纯度符合下一步PCR扩增模板的要求,可以进行下一步的扩增操作。以样品总DNA作为模板,使用16S rDNA引物进行扩增,结果如图2所示,PCR产物目的条带大小正确,条带明显,无拖尾片段,总量满足2 次或者2 次以上建库需要,可进行后续建库。

2.2 不同温度发酵模式下豆瓣酱细菌序列分析

图3 各样品的OTUs聚类和注释情况统计
Fig. 3 Statistics of OTUs clustering and taxonomic annotation for all samples

通过对V3~V4区域进行测序,所得到的14 个样品的拼接序列总数是688 937 条,有效Tags数目达到98.94%,总检测到OTUs数为3 645。每个样品的有效序列数量和OTU数量如图3所示。由图3可以看出,不管是在先高温后低温发酵模式下,还是先低温后高温发酵模式下,自然发酵的豆瓣酱中微生物种类较多,物种丰富,这给豆瓣酱风味的形成奠定了基础,但同时也可能存在安全隐患。

图4 细菌群稀释曲线
Fig. 4 Rarefaction curves of bacterial colonies

从图4可知,当测序量低于10 000时,每个样品的OTU数目呈显著上升的趋势,说明在此测序量上样品物种的多样性较高,也就是说还有较多的物种没有被检测到。但测序数量逐渐增加时,各豆瓣酱样品中细菌的OTU数目呈缓慢增加,最后在测序量达到40 000时达到一个较为饱和的状态,说明在此测序量上细菌群落结构的相对可信度比较高,可以较为真实地反映出豆瓣酱发酵过程中的细菌群落。

2.3 不同发酵温度模式下样品细菌类群分析

在不同的发酵温度模式下,不同发酵时期的样品之间的群落差异相对较大,通过在目、科、属水平上对细菌群落进行分析,从而了解不同时期豆瓣酱细菌群落之间的差异。

图5 目水平上物种的相对丰度柱形图
Fig. 5 Relative abundance of bacterial species at the order level

由图5可知,在先低温后高温发酵模式下,芽孢杆菌目(Bacillales)的相对丰度在发酵第10天达到了85.47%。随着温度的上升,芽孢杆菌目的相对丰度呈平缓的下降趋势,与此同时,乳杆菌目(Lactobacillales)的相对丰度逐渐升高,达到了32.18%。而在先高温后低温发酵模式下,乳杆菌目的相对丰度随着温度的降低而呈现下降的趋势,同时,肠杆菌目的相对丰度随着温度的变化逐渐升高至56.28%。假单胞菌目(Pseudomonadales)、放线菌目(Actinomycetales)、梭菌目(Clostridiales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、立克次体目(Rickettsiales)也在样品中存在。

图6 科水平上物种的相对丰度柱形图
Fig. 6 Relative abundance of bacterial species at the family level

从图6可知,随着发酵温度的逐渐上升,葡萄球菌科(Staphylococcaceae)在各样品中的相对丰度逐渐降低。而肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的相对丰度逐渐上升至17.71%。当温度逐渐下降时,肠杆菌科的相对丰度上升至56.29%。每个样品中还包括了肠球菌科(Enterococcus)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)。

由图7可知,在2 种发酵模式中,随着温度的上升,葡萄球菌属(Staphylococcus)的相对丰度呈下降趋势,但在先低温后高温的发酵模式下葡萄球菌属下降趋势更明显。而肠球菌属(Enterococcus)的相对丰度逐渐上升至28.54%。当温度逐渐下降时,欧文氏菌属(Erwinia)的相对丰度逐渐上升。肠球菌属、欧文氏菌属、不动杆菌属(Acinetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)均在各样品中存在相应的丰度。

图7 属水平上物种的相对丰度柱形图
Fig. 7 Relative abundance of bacterial species at the genus level

图8 多样品中特定物种分类树
Fig. 8 Classification tree of bacterial species in multiple samples

通过图8可知,在不同发酵温度模式下,不同发酵时期的豆瓣酱中细菌的菌种在门水平上主要分为3 种,即厚壁菌门(Phylum Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria),其相对丰度分别占细菌的62.61%、3.86%和33.53%。厚壁菌门又包括了芽孢杆菌纲和梭菌纲2 类,相对丰度分别为62.12%和0.49%。一类是梭菌纲、梭菌目、毛螺菌科、粪球菌属。而另一类是芽孢杆菌纲包括了芽孢杆菌目和乳杆菌目,其相对丰度分别为50.85%和11.28%。乳杆菌目又包括了肠球菌科、肠球菌和乳杆菌科、乳杆菌属、瑞特乳酸菌(Lactobacillus reuteri)。同时,在芽孢杆菌目中葡萄球菌科、葡萄球菌属、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)也占有一定的比例,而另一类则为芽孢杆菌科、芽孢杆菌属、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、黏琼脂芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。在放线菌门中的菌种为放线菌纲、放线菌目、棒状杆菌科、棒状杆菌属。而在变形菌门、γ-变形菌纲中,包括了2 类菌种,分别为肠杆菌目、肠杆菌科、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、欧文杆菌属、肠杆菌属和假单胞菌目、莫拉菌科、不动杆菌属、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)。

从图8可以看出,在先低温后高温的发酵模式中,不同发酵时期豆瓣酱中放线菌的比例要小于先高温后低温的发酵模式的,而在发酵后期,豆瓣酱中肠球菌、粪球菌属以及不动杆菌属的相对丰度的比例要大于先高温后低温的发酵模式的菌种的比例。在发酵中期,发酵温度达到了肠球菌、粪球菌属以及不动杆菌属的适宜温度,其相对丰度比例也就达到了最高,同时,肠杆菌的比例在先高温后低温模式发酵后期达到最多,这是由于此时的发酵温度最适宜肠杆菌的生长。

2.4 2 种发酵模式下发酵豆瓣酱细菌菌落的特征分析

PCoA是用来研究数据之间的差异性或相似性的一种可视化方法,通过分析PCoA可以观察出豆瓣酱中菌落个体或群体之间的差异。每一个点代表一个豆瓣酱样本,同一个分组的样本用相同的颜色来表示,2 个样本的群落构成差异越小在图上反映出来就是两点之间的距离越近。

图9 基于Weighted Unifrac距离PCoA
Fig. 9 PCoA based on Weighted Unifrac distance

从图9可知,在先高温后低温发酵模式下样品XJ3和XJ5距离最近,说明这2 个样品的群落构成差异较小,其微生物种类的相似性较高。同时,每组之内的2 个重复能够聚在一起,说明这几组样品内重复性好,群落结构存在一致性。在先低温后高温发酵模式下,XJ2与其他样品的距离较远,说明这组样品与其他样品的群落构成具有较大的差异。样品XJ4和XJ6均在一个象限内,所以其细菌菌落具有一定的相似性。

Alpha多样性用于分析样品内的微生物群落多样性,通过对单个样品的多样性进行分析可以反映出样品内的微生物群落的多样性和丰富度[24-30]。一般来说,在97%以上的序列一致性下聚类成为一个OTU的序列被认为可能是源自于同一个种的序列。因此,对不同样品在97%一致性阈值下的Alpha多样性分析指数进行统计如下(均一化时选取的数据量:临界值为39 950)。

表2 Alpha指数统计
Table 2 Alpha index statistics

从表2可知,在先低温后高温发酵模式中,样品物种总数是呈上升趋势,在发酵至第30天时,其物种总数达到最高,Chao1值为311.656。同时,其群落多样性也升高,Shannon-Wiener值由发酵10d的2.621升至4.153,由此可见在发酵末期豆瓣酱样品细菌的物种丰富度和群落多样性均高于发酵前期及发酵中期。

在先高温后低温发酵模式中,样品物种总数在发酵初期(0~10 d)呈上升趋势,Chao1值由287.824上升至325.398。但是,样品群落多样性逐渐降低,Shannon-Wiener值由最初的3.713降至3.379。当样品发酵至中期(10~20 d)时,样品物种总数逐渐降低,但其群落多样性逐渐升高至3.571。随后发酵至末期(20~30 d),样品物种总数逐渐下降至212.150,群落多样性也逐渐下降至2.816。

2.5 发酵豆瓣酱细菌菌落聚类分析

通过对不同发酵温度模式下不同发酵时期的豆瓣酱样品进行聚类分析,并将聚类结果与各样品在门水平上的物种相对丰度整合展示,从而了解不同发酵时期豆瓣酱样品间的相似性。

图10 基于Weighted Unifrac距离的UPGMA聚类树(先高温后低温)
Fig. 10 UPGMA clustering tree based on Weighted Unifrac distance

由图10可知,XJ3和XJ5处于同一个分支下,表明豆瓣酱中的细菌在这2 个时期间的相似度较高,同时,XJ7与XJ3、XJ5又处于同一分支下,即在先高温后低温发酵模式中,不同发酵时间所发酵的豆瓣酱中的细菌均具有一定的相似性。从图10可以看出,在这3 个发酵时期豆瓣酱细菌中的优势菌落均为厚壁菌门和变形菌门,其次为蓝藻细菌。但在发酵后期,即XJ7中,蓝藻细菌的相对丰度有所减少。在先低温后高温发酵模式中,XJ4和XJ6处于同一个分支下,其中的优势菌落均为厚壁菌门,XJ1与XJ4和XJ6处于同一个分支下,但又与XJ2具有一定的距离,优势菌种为厚壁菌门,但其相对丰度与XJ4和XJ6相比有所减少,而变形菌门的相对丰度有所增加。XJ2与XJ4和XJ6具有一定得距离,说明在整个发酵过程中,发酵初期与发酵中、后期的菌落种群的相似性略低,其优势菌种是厚壁菌门,但其相对丰度要高于其他发酵时期。

图11 基于Unweighted Unifrac距离的UPGMA聚类树(先低温后高温)
Fig. 11 UPGMA clustering tree based on Unweighted Unifrac distance

由图11可知,XJ2和XJ5处于同一分支下,说明在先低温后高温发酵模式下发酵初期的菌落种群和在先低温后高温发酵发酵模式下发酵中期的菌落种群具有一定的相似性。其中的优势菌种均为厚壁菌门。XJ3和XJ6处于同一分支下,说明这2 个阶段的菌落种群具有一定的相似性,其优势菌种为厚壁菌门,其次是变形菌门、拟杆菌门和放线菌。在先高温后低温发酵模式中,XJ1和XJ7处于同一分支下,说明这2 个阶段的菌落种群具有一定的相似性,而与MJ3、MJ5在聚类树上有一定得距离,说明在此发酵阶段,发酵后期与发酵初、中期的细菌菌落种群具有一定的差异性。而在先低温后高温发酵模式下,各发酵阶段的细菌菌落种群均具有一定的差异性。

3 结 论

通对不同发酵温度模式下不同发酵时期的豆瓣酱样品进行DNA提取、PCR扩增,运用通高通量测序技术过对不同发酵模式下不同发酵时期的豆瓣酱细菌进行了微生物多样性分析。研究了2 种发酵模式下豆瓣酱物种的丰富度及其类群分析,发现在先低温后高温发酵模式中,豆瓣酱细菌的物种丰富度相对高于传统发酵模式下的菌种的丰富度。

通过DNA提取,PCR扩增以及高通量测序技术对不同温度发酵模式下的豆瓣酱中的细菌进行多样性分析,得出了其中门纲目科属中最大丰度排名前10的物种在各样品中的分布情况。了解了主要物种在各样品中的分布情况,发现样品间的优势物种和各样品中优势物种间的差异。结果表明:先低温后高温发酵模式下样品得到了2 081 个OTU,而在先高温后低温模式中为1 870 个OTU。2 种发酵模式中的优势门均为厚壁菌门,其相对丰度值分别为72.24%(先低温后高温)和43.84%(先高温后低温);此外,在各样品中还发现了放线菌门、拟杆菌门、泉古菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门等。优势属为葡萄球菌属,其相对丰度值分别为44.13%和32.52%。同时,肠球菌属、欧文氏菌属、不动杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、棒杆菌属均在各样品中存在相应的丰度。先低温后高温发酵模式下细菌物种的丰富度和多样性普遍高于先高温后低温发酵模式的。但是,在样品物种分析中发现较为优势的物种包括了葡萄球菌属、肠杆菌属、变形菌属,这可能会对本研究中的发酵豆瓣酱安全性产生一定的影响。

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Bacterial Diversity during Natural Fermentation of Soybean Paste under Variable Temperature Conditions

ZHOU Hongli1,2, LI Sha1, ZHANG Ling1, JIANG Liwen1,2, TAN Xinghe1,2,*
(1. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha 410128, China)

Abstract:The diversity of the bacterial community in soybean paste fermented under variable temperatures was analyzed by DNA extraction, PCR amplification and high-throughput sequencing technology. The results showed a total of 2081 and 1 870 operational taxonomic units (OTU) were obtained from the samples fermented at low temperature first and then high temperature (mode 1) or at high temperature first and then low temperature (mode 2), respectively. Firmicutes was the most dominant phylum for both fermentation modes with an abundance value of 72.24% and 43.84%, respectively. Staphylococcus was the most dominant genus with an abundance value of 44.13% and 32.52% for modes 1 and 2, respectively. The bacterial diversity and abundance of mode 1 were generally higher than those of mode 2.

Key words:fermentation mode; soybean paste; bacteria; diversity

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714018

中图分类号:TS201.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)14-0120-07

引文格式:周红丽, 李莎, 张灵, 等. 变温发酵模式下豆瓣酱自然发酵过程中细菌多样性研究[J]. 食品科学, 2017, 38(14): 120-126.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714018. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Hongli, LI Sha, ZHANG Ling, et al. Bacterial diversity during natural fermentation of soybean paste under variable temperature conditions[J]. Food Science, 2017, 38(14): 120-126. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714018. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-09-14

基金项目:湖南省教育厅重点项目(14A072);湖南农业大学1515团队项目

作者简介:周红丽(1972—),女,副教授,博士,研究方向为农副产品综合利用研究、发酵食品研究与开发。

E-mail:xuanxuan310@126.com

*通信作者:谭兴和(1959—),男,教授,博士,研究方向为农产品加工与贮藏工程、食品安全。E-mail:xinghetan@163.com