蜂蜜中原蜜黄酮类化合物HPLC图谱比较分析

摘要：利用高效液相色谱比较分析不同蜂种、不同产地、加工与否以及不同蜜源蜂蜜中原蜜黄酮类化合物的种类及含量差异。结果表明，意大利蜜蜂油菜原蜜和中华蜜蜂油菜原蜜总峰数和峰形都比较相似，意大利蜜蜂油菜原蜜的总黄酮含量比中华蜜蜂油菜原蜜总黄酮含量高。不同产地的意大利蜜蜂油菜原蜜的图谱峰形整体相似，总黄酮含量和黄酮类化合物种类大致相同。加工后的商品蜜总黄酮含量减少，黄酮类化合物的种类也减少，商品蜜的高效液相色谱图显示其黄酮类化合物的出峰时间靠前，主要密集分布在水溶性的分离相中。3 个不同蜜源蜂蜜原蜜黄酮类化合物高效液相色谱图的总峰数和峰形都有较大差异，油菜原蜜、洋槐原蜜及柑橘原蜜的总峰数分别为65、58、 70 个，柑橘原蜜的总黄酮含量最高，达161.62 μg/100 g。单花蜂蜜原蜜黄酮类化合物的高效液相色谱图峰形具有一定的特异性，可以作为指纹图谱用于蜂蜜蜜源的鉴定。

关键词：油菜原蜜；高效液相色谱；意大利蜜蜂；中华蜜蜂；黄酮类化合物；蜜源

蜂蜜具有广泛的营养价值和生理调节功能[1]，营养价值和它的化学成分[2]相关，蜂蜜由于蜂种、蜜源、环境的不同，其化学组成存在差异[3]，蜂蜜中的黄酮类化合物既是重要的营养因子，又是药理因子，被认为是蜂蜜中一类具有药用活性的主要物质之一[4-6]，具有防癌抗癌[7-8]、抗肿瘤[9]、抗菌抗氧化[10-13]、抗抑郁[14]、类雌激素效应[15]等作用。黄酮类化合物的种类和含量可以在一定程度上评价蜂蜜营养价值。

蜂蜜黄酮类化合物的研究越来越受到各国学者的重视，卢焕仙等[16]测定了不同花期石榴花蜂蜜中总黄酮类化合物含量。孙崇臻等[3]用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定了8 种单花蜜中的脱落酸以及14 种多酚化合物。梁铖等[17]对云南地区5 种特色蜂蜜中芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇4 种黄酮化合物含量的差异进行比较。Schievano等[18]研究了意大利地区的洋槐蜜，发现白杨素可作为洋槐蜜的植物源标记物。Tomás-Barberán等[19]用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定了欧洲52 种单花蜂蜜，发现橙皮素可以作为柑橘的植物源标记物。已有研究表明黄酮类可作为蜂蜜的植物种属鉴定及真伪鉴别的标识物质[20]。不同蜂种单花蜂蜜黄酮类化合物有无差别，不同产地对单花蜂蜜黄酮类化合物的含量有无影响，蜂蜜原蜜和加工商品蜜黄酮化合物是否相同，鲜见此方面的研究文献，因此对蜂蜜中黄酮类化合物的研究还需进一步完善。

本研究通过HPLC法分析蜂蜜中芦丁、槲皮素、山柰酚[21]等10 种黄酮类化合物，研究不同蜂种、不同产地、天然和加工油菜原蜜以及不同蜜源蜂蜜之间的黄酮类化合物组分的差别，为油菜原蜜产品质量和成分检测提供参考依据。

1 材料与方法

油菜原蜜主要采集于重庆地区，其中N1为重庆市南川意大利蜜蜂油菜原蜜，N2和N3为重庆市南川中华蜜蜂油菜原蜜，T为重庆市潼南意大利蜜蜂油菜原蜜，GY为贵州省桐梓县意大利蜜蜂油菜原蜜，YY为重庆市云阳意大利蜜蜂油菜商品蜜，G为重庆市长寿意大利蜜蜂柑橘原蜜，Y为甘肃省意大利蜜蜂洋槐原蜜。除了商品蜜YY，其余蜂蜜为蜂农养殖场的自然原蜜，采集时间为2016年4月。

儿茶素、杨梅素、芦丁、槲皮素、柚皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、黄芩素、白杨素标准品（HPLC级，纯度＞98%）重庆塞米克生物科技有限公司。

XAD-2大孔树脂美国Sigma公司；甲醇（色谱纯，纯度99.9%）美国Fisher公司；甲酸（色谱纯，纯度＞98%）美国Fluka公司；氢氧化钠（纯度99%）天津永大化学试剂有限公司；盐酸（纯度95.5%）重庆川东化工（集团）有限公司；其他试剂均为分析纯。

LC-20A型HPLC仪（包括SPD-20A紫外检测器、LC-20AT泵、自动进样器）日本岛津公司；KH-100B型超声波清洗器昆山禾创超声仪器有限公司；抽滤装置天津津腾实验设备有限公司；旋片真空泵台州正空泵业有限公司；ATSrese纯水仪重庆安特生环保设备有限公司；FA1004A电子天平上海精天电子仪器有限公司；TG16-W微量高速离心机德国Eppendorf公司；QL-866旋涡混合器海门其林贝尔仪器制造有限公司。

色谱分离柱：C18色谱柱（150 mm×4.6 mm， 5 μm）；流动相：流动相A为0.25%甲酸溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱[22-24]：0～8 min，20%～30% B；8～15 min，30%～45% B；15～25 min，45%～60% B；35～40 min，60%～75% B；40～45 min，70% B；45～47 min，70%～25% B；47～50 min，25% B。流速0.60 mL/min；进样量30 μL；色谱柱温度35 ℃；检测波长254 nm。

精密度：取混合标品原液稀释6 倍，按照HPLC条件，进样量10 μL，连续进样6 次，计算芦丁峰的相对峰面积，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.32%，仪器设备的精密度良好。

重复性：取混合标品原液稀释6 倍，平行制备6 份进样溶液，按照HPLC条件，进样量10 μL，计算芦丁的相对峰面积，RSD为0.21%，实验方法重复性良好。

稳定性：将提取的蜂蜜样品，分别于0、4、8、12、16、24 h进样，按照HPLC条件，进样量10 μL，计算3 个共有峰的相对峰面积，RSD分别为0.80%、0.74%、0.85%，进样溶液在24 h内稳定，达到色谱分析要求。

精密称取10 种黄酮类化合物标准品各20.00 mg，分别加入1 mL甲醇溶液配制成质量浓度为20 mg/mL的标准品原液。移取10 个标品原液各5 μL于1.5 mL离心管中，加入950 μL甲醇配制成0.2 mg/mL的标品混合液，置于4 ℃冰箱中避光储存备用。

精密移取标准品混合原液，加入甲醇，依次稀释成6、8、12、16、24、32 倍的一系列质量浓度标准品混合溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，依照色谱条件进样10 μL。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

分别精确称取8 种蜂蜜样品2.0 g，用10 mL蒸馏水充分溶解，3 000 r/min离心5 min，除去固体杂质，移取上清液，测量溶液的pH值，用NaOH和HCl调节pH值为4.0。上清液与10 mL的XAD-2[25-26]大孔树脂混合，充分搅拌混匀，将树脂液装入玻璃柱中，用10 mL蒸馏水漂洗柱子除去糖类物质及其他杂质，按洗脱液甲醇用量与树脂的体积比为1∶1，最后用10 mL 100%甲醇溶液[13]洗脱出黄酮类物质，收集甲醇洗脱液，置于4 ℃冰箱保存备用。

2.0 g蜂蜜用10 mL甲醇洗脱，进样液质量浓度为0.2 g/mL。精密移取100 μL洗脱液，用0.45 μm滤膜[27]过滤后作为进样液，进样量30 μL，重复3 次进样。

2 结果与分析

2.1 同一产地中华蜜蜂和意大利蜜蜂油菜原蜜黄酮类组分的比较分析

图1 南川中华蜜蜂和意大利蜜蜂油菜原蜜HPLC图谱
Fig. 1 Chromatograms of Chinese honeybee and Italy honeybee rape
honey from Nanchuan

通过HPLC分析10 种黄酮类化合物的混合标准品溶液，制定标准曲线，蜂蜜样品的分析结果，根据标准品相对保留时间选取样品峰，用外标法统计分析各个黄酮类化合物的含量。如图1所示，统计样品重复3 次进样后的平均总峰数，南川意大利蜜蜂油菜原蜜N1、南川中华蜜蜂油菜原蜜N2和南川中华蜜蜂油菜原蜜N3的总峰数为分别为65、67、65 个，3 种油菜原蜜的总峰数相近，峰形整体相似，黄酮类化合物的种类也大致相同。但中华蜜蜂油菜原蜜在保留时间12.5、41.2 min有出峰，意大利蜜蜂油菜原蜜却没有。意大利蜜蜂油菜原蜜在保留时间为15.0 min有一个中华蜜蜂油菜原蜜没有的峰。

同一产地中华蜜蜂和意大利蜜蜂油菜原蜜中黄酮化合物的HPLC图谱相似，黄酮类化合物的种类大致相同，在总黄酮和单个黄酮化合物的含量上有一定差异。如表1所示，意大利蜜蜂油菜原蜜的总黄酮含量比中华蜜蜂油菜原蜜高，意大利蜜蜂油菜原蜜中芦丁含量约是中华蜜蜂油菜原蜜的2.5 倍，儿茶素含量也比中华蜜蜂油菜原蜜高近一倍，另外意大利蜜蜂油菜原蜜比中华蜜蜂油菜原蜜含有更丰富的山柰酚、黄芩素、杨梅素和白杨素。中华蜜蜂油菜原蜜的柚皮素含量比意大利蜜蜂油菜原蜜高，中华蜜蜂油菜原蜜中检测出微量的芹菜素，意大利蜜蜂油菜原蜜中均未检测出。中华蜜蜂油菜原蜜黄酮类化合种类比意大利蜜蜂油菜原蜜丰富。这可能与蜜蜂的采蜜习惯相关，意大利蜜蜂喜欢采集大量集中的蜜源，而中华蜜蜂除了采集大量蜜源外，还喜欢就近采集零星的蜜源，所以中华蜜蜂蜂蜜的黄酮类化合物的种类有可能比意大利蜜蜂采集蜂蜜稍多一些。意大利蜜蜂的生产能力较中华蜜蜂强，且扇去蜂蜜水分的能力也较中华蜜蜂强，所以相同情况下意大利蜜蜂蜂蜜的含水量比中华蜜蜂蜂蜜低，总黄酮含量比中华蜜蜂蜂蜜高。

表1 南川油菜原蜜10 种黄酮类化合物含量（n=3）
Table 1 The contents of 10 flavonoids in raw rape honey from Nanchuan (n=3)

注：ND.未检出。下表同。

图2 不同产地意大利蜜蜂油菜原蜜HPLC图谱
Fig. 2 Chromatograms of Italy honeybee rape honey samples from different producing areas

a.贵州桐梓意大利蜜蜂油菜原蜜GY；b.潼南意大利蜜蜂油菜原蜜T；c.南川意大利蜜蜂油菜原蜜N1。

重庆南川、重庆潼南和贵州桐梓的意大利蜜蜂油菜原蜜在254 nm波长处的HPLC图谱的总峰数分别为65、66、64 个，3 个产地的意大利蜜蜂油菜原蜜的峰形整体相似，如图2所示，表明黄酮类化合物种类大致相同。

表2 意大利蜜蜂油菜原蜜10 种黄酮类化合物含量（n=3）
Table 2 The contents of 10 flavonoids in Italy honeybee rape honey (n =3)

3 个产地意大利蜜蜂油菜原蜜总黄酮的含量差别小，但单个黄酮化合物的含量却有一定的差异，如表2所示。油菜原蜜中含量最丰富的儿茶素和芦丁因产地不同含量有所不同，贵州桐梓意大利蜜蜂油菜原蜜儿茶素含量最丰富，达到了（55.73±1.32）μg/100 g，南川意大利蜜蜂油菜原蜜的芦丁含量最高（39.99±2.84）μg/100 g，100 g原蜜的芦丁含量比贵州桐梓意大利蜜蜂油菜原蜜的芦丁含量高了0.35%。潼南意大利蜜蜂油菜原蜜中槲皮素和山柰酚含量比南川和贵州桐梓高，潼南意大利蜜蜂油菜原蜜含有柚皮素是重庆南川和贵州桐梓地区的1.5 倍。而贵州桐梓意大利蜜蜂油菜原蜜比其他产地原蜜有更丰富的儿茶素，但槲皮素和山柰酚含量较少，3 个产地的意大利蜜蜂油菜原蜜均未检测出芹菜素。黄酮含量与蜜源产地有关，蜜源植物的生长土壤、气温、地势地形和蜜源植物品种[28]等都会影响原蜜中黄酮类化合物的含量。

2.3 意大利蜜蜂油菜原蜜和加工商品蜜的黄酮类组分的比较分析

图3 意大利蜜蜂油菜原蜜和云阳商品蜜的HPLC图谱
Fig. 3 Chromatograms of raw Italy honeybee rape honey from Tongnan and commercial rape honey from Yunyang

a.潼南意大利蜜蜂油菜原蜜T；b.南川意大利蜜蜂油菜原蜜N1；c.商品蜜YY。

如图3所示，意大利蜜蜂商品蜜峰形与油菜原蜜存在较大的差异，商品蜜的黄酮类物质的出峰时间靠前，主要密集分布在水溶性的分离相中。南川意大利蜜蜂油菜原蜜和潼南意大利蜜蜂油菜原蜜总峰数为65 个和66 个，而商品蜜YY的总峰数只有60 个，其中黄酮类化合物的种类比原蜜少，商品蜜缺少保留时间在12.1、24.9、28.4、30.3、36.5、37.0、39.6、40.2、43.6、44.0 min处的峰。其中保留时间在24.9、28.4、30.3 min对应的物质分别是柚皮素、山柰酚和黄芩素，其他保留时间峰为未知的黄酮类化合物。

表3 油菜原蜜和商品油菜蜜10 种黄酮类化合物含量（n=3）
Table 3 The contents of 10 flavonoids in raw rape honey and commercial rape honey from Yunyang (n=3)

如表3所示，意大利蜜蜂油菜原蜜的总黄酮含量比商品蜜丰富，检测结果表明商品蜜不含有柚皮素、山柰酚和黄芩素。商品蜜中槲皮素、木犀草素和白杨素的含量也比油菜原蜜少，但杨梅素的含量比原蜜更丰富。

加工后的商品蜜黄酮类化合物的种类减少，含量降低，这与黄酮各类成分的稳定性相关，黄芩素和白杨素的结构使它的化学性质不稳定，山柰酚在水溶液中的稳定性差，蜂蜜的加工[29]过程对蜂蜜中的活性物质破坏极大，可能使黄酮类化合物[30]受到破坏和转化。应在蜂蜜的商品化过程中改进加工方法，尽量保持原蜜的品质，发展高品质的有机蜜。

图4 油菜原蜜、洋槐原蜜和柑橘原蜜HPLC图谱
Fig. 4 Chromatograms of raw rape honey, acacia honey and citrus honey

如图4所示，意大利蜜蜂油菜原蜜、洋槐原蜜及柑橘原蜜的总峰数和峰形都有较大的差异，油菜原蜜、洋槐原蜜及柑橘原蜜的总峰数分别为65、58、70 个。油菜原蜜在保留时间为12.1、15.6、18.0、20.1、29.0、30.3、32.0、39.6、40.2、43.6、44.0 min有特有峰。洋槐原蜜的特有峰保留时间为10.0、35.0、42.0 min，柑橘原蜜的特有峰保留时间为14.0、19.0、22.6、31.2、39.7、43.8、44.3 min。特有峰在HPLC图谱中的保留时间不相同，表明不同蜜源蜂蜜中黄酮类化合物种类不同。

表4 不同蜜源原蜜10 种黄酮类化合物含量（n=3）
Table 4 The contents of 10 flavonoids in raw honey samples from different floral sources (n=3)

如表4所示，3 种不同蜜源蜂蜜的总黄酮含量有明显差异，柑橘原蜜的总黄酮含量最高，达到161.62 μg/100 g。柑橘原蜜除了山柰酚含量偏低，其他单个黄酮含量整体都比较高，其中木犀草素含量约为油菜原蜜的2.7 倍，并且检测出含有芹菜素，洋槐原蜜和油菜原蜜都未检出芹菜素。柑橘原蜜未检测出黄芩素。洋槐原蜜和油菜原蜜相比，杨梅素、木犀草素含量较高，其他单个黄酮和总黄酮含量都偏低，洋槐原蜜未检测出山柰酚。

蜜蜂采集蜜源植物的花蜜酿制蜂蜜，蜂蜜黄酮类化合物的种类和含量存在差异，这种差异可以反映出蜂蜜是由何种蜜源植物花蜜酿造的。本研究结果表明意大利蜜蜂油菜原蜜、洋槐原蜜及柑橘原蜜黄酮化合物HPLC图谱存在差异，蜂蜜中黄酮类化合的种类和含量与蜜源相关性大，单花蜂蜜黄酮类化合物的HPLC图谱具有一定的特异性，可以作为特征图谱用于蜜源种类的鉴别。

3 结论

同一产地中华蜜蜂和意大利蜜蜂油菜原蜜黄酮类化合物的HPLC图谱相似，存在一定差异，不同蜂种的HPLC图谱存在明显的特有峰，特有峰可作为中华蜜蜂和意大利蜜蜂油菜原蜜的区分标记。意大利蜜蜂油菜原蜜中总黄酮含量高，但中华蜜蜂油菜原蜜黄酮的种类更丰富。不同产地意大利蜜蜂油菜原蜜的黄酮化合物HPLC图谱具有一致性，总黄酮含量大致相同，单个黄酮化合物含量有一定差异，油菜原蜜中黄酮类化合物的种类受产地差异影响小。商品油菜原蜜中黄酮类化合物的峰主要集中在HPLC图谱前部，它与油菜原蜜HPLC图谱相似性低。不同蜜源蜂蜜原蜜的黄酮类化合物的HPLC图谱具有特异性，在含量和种类上的差别极大。

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WANG Qin, LI Zhi, DANG Xiaoqun, ZHOU Zeyang, WANG Linling*
(College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China)

Abstract：In this study, by using high performance liquid chromatography (HPLC), we compared the flavonoid composition and contents of raw honey from different honeybee species, different geographic origins and different floral sources and commercial processed honey. The results showed that Chinese honeybee (Apis cerana cerana) and Italy honeybee (Apis mellifera ligustica) rape honey were similar in terms of total peak number and peak shape, but the total flavonoids content of Italy honeybee rape honey was higher than that of its Chinese counterpart. Italy honeybee rape honeys from different producing areas had a high similarity in the HPLC profiles, and they were almost identical with respect to the number and amount of flavonoids identified. The number and amount of flavonoids detected in processed honey were reduced as compared to the raw one. The HPLC profile of processed honey indicated that the chromatographic peaks of flavonoids occurred earlier, which were intensively distributed in the water-soluble phase. Considerable differences in total peak number and peak shape were found among raw honey from different floral sources; a total of 65, 58 and 70 flavonoid peaks were identified from rape honey, acacia honey and citrus honey, respectively, and citrus honey had the highest flavonoid content (161.62 μg/100 g). The HPLC peak shape of flavonoids in monofloral honey showed some specificity, providing a characteristic fingerprint for the identification of honey species.

Key words：rape honey; high performance liquid chromatography (HPLC); Apis mellifera ligustica; Apis cerana cerana; flavonoids; nectar source

引文格式：王琴, 李治, 党晓群, 等. 蜂蜜中原蜜黄酮类化合物HPLC图谱比较分析[J]. 食品科学, 2017, 38(14): 164-169.

WANG Qin, LI Zhi, DANG Xiaoqun, et al. Comparative HPLC analysis of flavonoids from different raw honeys[J]. Food Science, 2017, 38(14): 164-169. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714025. http://www.spkx.net.cn

基金项目：重庆市社会民生科技创新专项（cstc2015shmszx80031）；教育部留学回国人员科研启动基金项目

作者简介：王琴（1991—），女，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail：wqin0408@163.com

*通信作者：王林玲（1969—），女，教授，博士，研究方向为生物化学。E-mail：wanglinling2005@163.com

蜂蜜中原蜜黄酮类化合物HPLC图谱比较分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论