图1 真空耦合超声波设备连接图Fig. 1 Schematic representation of the experimental setup used for ultrasonic-vacuum assisted extraction
田 莉1，李海萍2，袁亚宏1,*，岳田利1，魏建平1
（1.西北农林科技大学食品学院，陕西 杨凌 712100；2.咸阳市城市绿化管理处，陕西 咸阳 712000）
摘 要：在单因素试验基础上，采用响应面优化法建立基于真空耦合超声波提取苹果渣中多酚类物质的工艺条件优化，并通过高效液相色谱检测多酚组成且对抗氧化活性进行分析。结果表明，最佳提取工艺条件为乙醇溶液体积分数50%、提取温度50 ℃、真空度0.08 MPa、超声功率420 W、提取时间13 min、料液比1∶30（g/mL），在此条件下，苹果渣中多酚提取得率为6.46 mg/g。与超声波提取法相比，该方法可以明显缩短提取时间，获得多酚中表儿茶素及芦丁含量较高，并且具有较强的抗氧化活性。
关键词：苹果渣；多酚；真空耦合超声波；响应面法；高效液相色谱；抗氧化活性
我国有着丰富的苹果资源，也是浓缩苹果汁最大的生产国，2015年产量达4261.3万 t[1]，因而产生巨量的鲜果渣，这些果渣除少量用作饲料外，大部分被废弃。苹果多酚是一类具有生物活性的天然产物，主要集中在果皮和果籽中，在榨汁过程中随果皮进入果渣中，已被证实具有极强的抗氧化活性[2-6]，具有抗菌消炎[7-9]、预防冠心病[10]、抗肿瘤[11-12]、保肝[13]、抗癌[14]等多种药理功能。因此从苹果渣中提取多酚类物质是资源充分利用的科学举措。
目前，对苹果渣多酚的提取多采用超声波、微波[15]、生物酶解[16]、超高压、超临界等辅助方法，其中超声波提取技术利用其空化效应、机械效应和热效应增大介质穿透力，加速活性物质的溶出。因其操作较简单，提取率较高而应用较广，但缺点是用时较长。近几年又提出了减压提取法，主要应用于中药提取，减压提取法通过抽真空降低了热敏性活性物质随温度升高造成的氧化和降解，且使体系更活跃，从而加快提取速率[17-20]。因此，将超声波与减压2 种方法耦合，以提高天然活性物质的提取率并且保护活性物质不受破坏。目前，关于减压耦合超声波提取法，应用于茶多酚、枣皮多酚、高乌甲素等的研究[21-23]，而鲜见应用于苹果多酚提取报道。本研究主要采用陕西红富士苹果渣为原料，以乙醇溶液为溶剂，利用响应面法优化了真空（减压）耦合超声波提取苹果渣多酚的工艺，并通过高效液相色谱检测多酚组成且对抗氧化活性进行了分析，以期为更好、更系统地开发和利用苹果渣资源提供科学参考。
1.1 材料与试剂
苹果渣：市购陕西红富士苹果，鲜榨后于45 ℃烘干48 h，粉碎过60 目筛。
多酚标准品：没食子酸、儿茶素、绿原酸、香草酸、咖啡酸、表儿茶素、原花青素B2、阿魏酸、芦丁、根皮苷、槲皮素（均为色谱纯） 上海源叶生物科技有限公司；冰乙酸（色谱纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯） 美国天地有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海源叶生物科技有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine，TPTZ） 北京索莱宝科技有限公司；福林-酚试剂 上海荔达生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
KQ-700GVDV型三频恒温数控超声波清洗器 江苏省昆山市超声波仪器有限公司；UV-1240型紫外-可见分光光度计、LC-20AD高效液相色谱仪 日本岛津公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。
1.3 方法
1.3.1 真空耦合超声波提取苹果渣多酚
图1 真空耦合超声波设备连接图Fig. 1 Schematic representation of the experimental setup used for ultrasonic-vacuum assisted extraction
将苹果渣装入250 mL烧瓶内，按一定料液比加入乙醇，如图1所示，连接好提取设备，使烧瓶内样液液面低于超声仪中水的液面，开启真空泵形成负压，通过三通阀调节压力大小，使烧瓶中提取液保持微沸状态，再开启超声波在频率为45 kHz条件下进行提取，过滤收集苹果渣多酚提取液。
1.3.2 单因素试验
由于乙醇的低毒性与提取多酚的高效性[4]，本实验选择乙醇溶液作为提取溶剂。每次试验重复3 次，取平均值。
1.3.2.1 超声功率对提取得率的影响
在料液比1∶30（g/mL）、体积分数50%乙醇溶液、提取温度50 ℃、真空度0.08 MPa、提取时间10 min条件下，分别考察280、350、420、490、560 W的超声功率对苹果渣多酚提取得率的影响，确定最佳超声功率。
1.3.2.2 乙醇溶液体积分数对提取得率的影响
在料液比1∶30（g/mL）、超声功率420 W、提取温度50 ℃、真空度0.08 MPa、提取时间10 min条件下，考察体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液对苹果渣多酚提取得率的影响，确定提取液的最佳体积分数。
1.3.2.3 料液比对提取得率的影响
在体积分数50%乙醇溶液、超声功率420 W、提取温度50 ℃、真空度0.08 MPa、提取时间10 min条件下，考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）对苹果渣多酚提取得率的影响，确定物料与提取液的最佳料液比。
1.3.2.4 真空度对提取得率的影响
在超声功率420 W、提取温度50 ℃、体积分数50%乙醇溶液、料液比1∶30、提取时间10 min的条件下，考察真空度0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 MPa对苹果渣多酚提取得率的影响，确定最佳真空度。
1.3.2.5 提取温度对提取得率的影响
在料液比1∶30、提取时间10 min、体积分数50%乙醇溶液、真空度0.08 MPa、超声功率420 W条件下，考察提取温度30、40、50、60、70、80 ℃对苹果渣多酚提取得率的影响，确定最佳提取温度。
1.3.2.6 提取时间对提取得率的影响
在料液比1∶30、体积分数50%乙醇溶液、提取功率420 W、提取温度50 ℃、真空度0.08 MPa条件下，考察5、10、15、20、25 min的提取时间对苹果渣多酚提取得率的影响，以确定最佳提取时间。
1.3.3 响应面法试验设计
在单因素试验基础上，选择提取温度、提取时间、乙醇溶液体积分数、料液比4 个因素，应用Design-Expert V8.0.6软件，根据Box-Behnken原理设计四因素三水平的响应面试验，以多酚提取得率Y为响应值，利用响应面分析法对真空耦合超声波提取苹果渣多酚工艺进行优化，见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Variables and their coded and actual levels used in response surface design
1.3.4 多酚提取得率的计算
采用福林-酚法，以没食子酸为基准物质计算苹果渣提取液中多酚含量[24]。按公式（1）计算提取得率：
式中：c为多酚质量浓度/（mg/mL）；v为提取液体积/mL；m为原料样品质量/g。
1.3.5 高效液相色谱对多酚成分分析
高效液相色谱检测方法参考文献[25-28]。色谱柱：Agilent 5 TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流速0.8 mL/min；进样量20 μL；检测波长280、360 nm；流动相：A为2%冰乙酸溶液，B为含0.5%冰乙酸的乙腈-水（1∶1，V/V）溶液；线性梯度洗脱：0～50 min，10%～55% B；50～60 min，55%～100% B；60～65 min，100%～10% B；65～75 min，10%～10% B。
样品为多酚粗提液，用AB-8大孔树脂纯化后，过0.45 μm微孔滤膜。
1.3.6 抗氧化性测定
1.3.6.1 DPPH自由基清除率的测定
参照Shahidi等[29]的方法，将不同提取方法得到的多酚经纯化、冻干后，与抗坏血酸、芦丁配成相同质量浓度梯度样液，取样液2 mL，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，混合均匀，室温放置30 min后，于517 nm波长处测吸光度。DPPH自由基清除率按公式（2）计算：
式中：A0为用蒸馏水代替样品的吸光度；At为样品的吸光度；Ab为乙醇溶液代替DPPH溶液的吸光度。
1.3.6.2 亚铁还原能力法测定总还原能力
参照Bebzie等[30]建立的方法，原理：TPTZ可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出明显的蓝色，并于波长593 nm处具有最大光吸收，根据吸光度的大小计算样品抗氧化活性的强弱。
TPTZ工作液的配制参见文献[31]。
亚铁还原能力标准曲线的建立：1.8 mL TPTZ工作液加入0.2 mL不同浓度FeSO4溶液，于波长593 nm处测定吸光度。FeSO4浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，以浓度对吸光度绘制标准曲线。
样品还原能力的测定：取样液0.2 mL加入1.8 mL TPTZ工作液，37 ℃反应10 min，于波长593 nm处测定吸光度。每个样品重复3 次实验。
2.1 单因素试验结果
图2 超声功率（A）、乙醇溶液体积分数（B）、料液比（C）、真空度（D）、提取温度（E）及提取时间（F）对苹果渣多酚提取得率的影响
Fig. 2 Effect of ultrasound power (A), ethanol concentration (B), solvent-to-solid ratio (C), vacuum degree (D), extraction temperature (E) and extraction time (F) on the extraction yield of apple polyphenols
如图2A所示，多酚提取得率随超声功率的增大先增大，在490 W时达到最大值，继续增大超声功率时，多酚的提取得率略有下降。考虑到420 W后，提取得率增加幅度减小，且功率较大耗能多，所以选定超声提取功率为420 W。
如图2B所示，多酚的提取得率随乙醇溶液体积分数的增加而增大，当乙醇溶液体积分数达到60%时，提取得率达到最大，之后随乙醇溶液体积分数的增加，提取得率呈下降趋势。由于乙醇溶液体积分数过大时，可能存在醇溶性杂质的溶出，与多酚类物质竞争和溶剂的结合，从而使多酚提取得率下降。所以，选择体积分数50%、60%、70%乙醇溶液进行响应面试验。
如图2C所示，随着料液比的增加，多酚的提取得率逐渐增加，这是因为苹果组织中多酚与蛋白质、多糖、生物碱等物质以氢键等形式结合在一起，而有机溶剂和水的混合液能有效的抑制这种结合，因此提取液增多有利于苹果多酚的提取；当料液比达到1∶25以后提取得率略有下降，这是因为当提取液量过多时，在真空条件下较易损失，所以，选择料液比1∶20、1∶25、1∶30进行响应面试验。
如图2D所示，未到达提取温度对应的沸腾真空度（50 ℃对应0.08 MPa）前，随体系真空度的增大，提取得率也随之上升，在体系沸腾时提取得率达到最大值，但真空度继续增大，体系便剧烈沸腾，上升的蒸汽无法及时回流入体系内，造成了一定的损失，使得多酚提取得率下降。因此，本实验选定体系保持轻微沸腾状态时的真空度。
如图2E所示，由于在不同提取温度，体系达到微沸时所对应的真空度不同，所以在研究提取温度对多酚提取得率的影响之前，分别测了各温度所对应的体系微沸真空度，各提取温度及其所对应微沸真空度分别为30 ℃（0.092 MPa），40 ℃（0.086 MPa），50 ℃（0.08 MPa），60 ℃（0.075 MPa），70 ℃（0.071 MPa），80 ℃（0.066 MPa）。多酚提取得率随提取温度的升高而增加，在提取温度达到60 ℃时，提取得率达到最大，继续升高温度多酚提取得率略有下降，由于提取温度过高会引起酚类化合物的降解，同时容易造成溶剂挥发损失，所以，选择50、55、60 ℃进行响应面试验。
如图2F所示，传统的超声波辅助提取，随着提取时间的延长，提取得率逐渐增大，在25 min时最大提取得率为5.51 mg/g；而真空耦合超声波提取方法中，10 min时提取得率达到最大为5.57 mg/g，随着提取时间的延长，提取得率逐渐下降，提取得率下降是因为提取时形成负压，分子活动更快，10 min时可将大部分多酚类物质提出，但随着提取时间延长所提出的多酚可能会分解，由此可知，真空耦合超声波能明显缩短提取时间，从而提高提取效率。选定提取时间5、10、15 min进行响应面试验。
2.2 响应面试验结果
表2 响应面试验结果
Table 2 Experimental design and results for response surface analysis
由表2、3可知，该模型极显著，失拟项不显著，各因素影响大小依次是料液比＞乙醇溶液体积分数＞提取温度＞提取时间；一次项C、D极显著；二次项B2极显著，A2和C2显著；交互项AB、BC显著。
表3 回归方程系数显著性检验
Table 3 Significance test of regression equation coefficients
注：*.差异显著（P＜0.05）；**.差异极显著（P＜0.01）。
经回归拟合后，得到以苹果多酚提取得率（Y）为响应值的回归方程为：Y=5.96－0.26C＋0.32D－0.34AB－0.33BC－0.23A2－0.58B2－0.24C2。
回归方程的决定系数R2为0.864 1，调整决定系数R2Adj为0.728 3，说明该模型能够解释72.83%的响应值变化，因而模型的拟合度良好，可对不同提取条件下苹果多酚提取得率进行预测。
根据回归模型预测苹果多酚提取的最佳工艺条件为提取温度50.00 ℃、提取时间12.72 min、体积分数50.00%乙醇溶液、料液比1∶30.00。在此条件下，苹果多酚的理论提取得率达6.604 5 mg/g。
图3 两因素交互作用对苹果渣多酚提取得率影响的响应面分析
Fig. 3 Response surface plots showing the effects of four extraction parameters on the yield of apple polyphenols
如图3a、d所示，响应面显示坡度较陡，表明提取温度和提取时间及提取时间和乙醇溶液体积分数之间交互作用显著。如图3b、c、e、f所示，等高线为圆形可知交互作用不显著。
2.3 模型的验证
考虑到实际操作的可行性，将提取条件在回归方程得到的理论值基础上修正为：提取温度50 ℃，提取时间13 min，体积分数50%乙醇溶液，料液比1∶30（g/mL）。在以上优化条件下进行验证实验，共进行5 次，所得到的提取得率平均值为6.46 mg/g。理论值与实验值的相对偏差为2.2%，说明采用响应面法优化提取条件是可行的，所得提取条件具有实际应用价值。
2.4 高效液相色谱分析苹果渣多酚的组分
如图4所示，对比样品的色谱图，结果显示苹果渣多酚中儿茶素、绿原酸、表儿茶素、芦丁（360 nm检测波长）及根皮苷含量较高，占所检测得到多酚含量80%以上。如表4所示，真空耦合超声波提取的多酚中芦丁含量是超声波提取的5.9 倍，而没食子酸、绿原酸及槲皮素相对较少，具体原因还待进一步探究。因此，通过体外抗氧化实验进一步研究真空耦合超声波提取对苹果渣多酚抗氧化生物活性的影响。
图4 11 种多酚标品在280 nm波长处色谱图
Fig. 4 Chromatograms of mixture of 11 polyphenol standards with DAD detected at 280 nm
表4 不同提取方法的苹果渣多酚各成分含量
Table 4 Contents of polyphenols components from apple pomace determined by
different extraction methods
注：—.未检出。
2.5 苹果渣多酚的抗氧化性
2.5.1 DPPH自由基的清除作用
图5 不同提取方法提取的苹果渣多酚对DPPH自由基的清除率
Fig. 5 DPPH radical scavenging effect of apple polyphenols extracted by different extraction methods
由图5可知，质量浓度在2～25 μg/mL范围内，2 种提取方法提取的苹果渣多酚、抗坏血酸及芦丁对DPPH自由基清除率均随着质量浓度的增加而增强；当质量浓度为25 μg/mL时，清除率均达90%以上，都具有较强的DPPH自由基清除能力。经分析得，抗坏血酸、芦丁、真空耦合超声波多酚提取液、超声波多酚提取液对DPPH自由基清除率IC50值依次为4.350 8、3.661 2、4.310 0、4.775 3 μg/mL，则DPPH自由基清除能力大小依次是：芦丁＞真空耦合超声波多酚提取液＞抗坏血酸＞超声波多酚提取液；由于芦丁具有较强的清除DPPH自由基的能力，所以真空耦合超声波提取的多酚比超声波提取的多酚具有较高清除DPPH自由基的能力，可能是因为含有较多芦丁。
2.5.2 亚铁还原能力法测定还原能力
图6 亚铁还原能力法测定不同物质的还原力
Fig. 6 Ferric reducing antioxidant power (FRAP) of apple polyphenols extracted by different methods and other antioxidants
采用1.3.6.2节方法进行实验，得到还原力测定标准曲线，硫酸亚铁在0.2～1.0 mmol/L浓度范围内，于波长593 nm处测定吸光度在0.281 7～1.111 2范围成良好线性关系。方程为y=1.040 9x+0.074 9，决定系数R2为0.999 5。因此，以波长593 nm处的吸光度换算成多酚的FeSO4当量浓度的方法是可行的。
由图6可知，质量浓度在5～50 mg/L范围内，还原能力随各物质质量浓度的增大而增加，2 种方法提取的苹果渣多酚还原力多介于芦丁和抗坏血酸之间；当质量浓度为50 mg/L时，抗坏血酸、芦丁、真空耦合超声波多酚提取液、超声波多酚提取液吸光度分别为1.177、0.743、1.227、0.864，即还原能力大小依次是：真空耦合超声波多酚提取液＞抗坏血酸＞超声波多酚提取液＞芦丁。研究表明，表儿茶素相比于酚类物质显出更高的抗氧化能力[5]，真空耦合超声波提取的苹果渣多酚含有较高表儿茶素，因此具有更高的还原力。
通过单因素试验和响应面试验确定了真空耦合超声波提取苹果渣多酚的最佳工艺条件为超声功率420 W、提取温度50 ℃（真空度0.08 MPa）、提取时间13 min、乙醇溶液体积分数50%、料液比1∶30（g/mL），此条件下苹果渣多酚粗提物中多酚物质的提取得率为6.46 mg/g（相对于1 g干果渣）。
对真空耦合超声波提取的苹果渣多酚及超声波提取的果渣多酚经高效液相色谱分析，结果显示，真空耦合超声波提取的苹果渣多酚中表儿茶素和芦丁含量较高，儿茶素及绿原酸含量略低，而没食子酸未检出。
通过清除DPPH自由基和FRAP法对不同提取方法提取苹果渣多酚的抗氧化活性研究，结果显示，真空耦合超声波法比超声波法提取的苹果渣多酚具有更高的抗氧化能力。
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Optimization of Ultrasound-Vacuum Assisted Extraction of Polyphenols from Apple Pomace
TIAN Li1, LI Haiping2, YUAN Yahong1,*, YUE Tianli1, WEI Jianping1
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Urban Greening Management Office of Xianyang City, Xianyang 712000, China)
Abstract：One-factor-at-a-time method and response surface methodology were used in combination to optimize the ultrasound-vacuum assisted extraction of polyphenols from apple pomace. At the same time, antioxidant assays in vitro were also carried out on the polyphenols and the polyphenol composition was analyzed by HPLC. The optimal extraction parameters that provided the maximum yield of polyphenols of 6.46 mg/g were determined as follows: 50% ethanol as extraction solvent, a solid-to-solvent ratio of 1:30 (g/mL), an extraction time of 13 min, an extraction temperature of 50 ℃, an ultrasound power of 420 W, and a vacuum degree of 0.08 MPa. Compared with traditional ultrasonic assisted extraction, the extraction time was considerably shortened by using ultrasound-vacuum assisted extraction while yielding polyphenol extracts containing more epicatechin and rutin and having stronger antioxidant activities.
Key words：apple pomace; polyphenol; ultrasound combined with vacuum treatment; response surface methodology; HPLC; antioxidant activity
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201714036
中图分类号：TS209
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）14-0233-07
引文格式：田莉, 李海萍, 袁亚宏, 等. 真空耦合超声波提取苹果渣多酚的工艺优化[J]. 食品科学, 2017, 38(14): 233-239.
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714036. http://www.spkx.net.cn
TIAN Li, LI Haiping, YUAN Yahong, et al. Optimization of ultrasound-vacuum assisted extraction of polyphenols from apple pomace[J]. Food Science, 2017, 38(14): 233-239. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714036. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-10-18
基金项目：农业部“948计划”项目（310715501）；国家自然科学基金面上项目（31171721）
作者简介：田莉（1991—），女，硕士研究生，研究方向为天然产物、功能食品和安全。E-mail：lilytian77@sina.com
*通信作者：袁亚宏（1971—），女，教授，博士，研究方向为食品高新技术及食品发酵工程。E-mail：yuan324@msn.com