表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Code and level of independent variables used for response surface methodology
赵 雯，腾军伟，张 健，赵 笑，姜云芸，杨贞耐*
（北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，食品质量与安全北京实验室，北京工商大学，北京 100048）
摘 要：针对1 株从传统酒曲中分离筛选得到的高产胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）解淀粉芽孢杆菌GSBa-1，采用单因素试验和响应面法确定了菌株的最优产EPS发酵条件：培养基组成为胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、蔗糖40 g/L、氯化钠10 g/L；发酵温度35 ℃、发酵时间36 h、摇床转速160 r/min、接种量4%，在此条件下EPS产量为326.45 mg/L。对EPS的流变特性进行研究，结果表明，该EPS溶液的黏度较低，具有浓度依赖性和剪切变稠的特性，随着温度升高，黏度降低。采用激光光散射仪辅助测量EPS的分子形态：得到EPS在水溶液中重均分子质量为4.993×105g/mol，回旋半径为48.34 nm，流体力学半径为64.62 nm，结构参数为0.748，该分子可能为紧密的球状结构。透射电子显微镜观察验证了EPS的球状结构。将该EPS加入到酸性乳饮料中，既不会增加其黏度，又具有良好的稳定特性，表明解淀粉芽孢杆菌GSBa-1 EPS可以作为一种新型的食品稳定剂，具有潜在的应用价值。
关键词：胞外多糖；流变特性；激光光散射；酸性乳饮料
胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是由微生物（细菌、真菌、微藻类和酵母）在其生长繁殖的过程中分泌到外界环境中的一种长链、高分子物质[1]。通常EPS具有良好的水溶性、稳定性、保水性、增稠性、凝胶性以及乳化特性，是潜在的食品稳定剂[2-3]。在食品中，EPS一方面可以作为增稠剂，赋予食品良好的口感，另一方面可以作为稳定剂，结合水并限制物料的脱水收缩[4]。此外，不同的微生物可形成不同类型的EPS，既具有不同的功能特性，也可以耐受更大范围的温度、pH值以及离子强度，可以适应不同的食品加工过程[5]。目前常见的微生物EPS有黄原胶、结冷胶、琥珀酰聚糖等。
微生物EPS的产量受其生长环境的影响显著。温度、压力、甚至是光照强度都会直接影响EPS的产量[6-7]。不同的氮源、碳源、无机盐离子以及pH值不仅会影响EPS的产量，甚至会影响其组成和理化性质。苛刻的外界环境可能会抑制微生物生长进而降低EPS产量，但也有可能刺激微生物分泌大量多糖以保护自身不受不良环境因素伤害。目前关于微生物EPS的报道中，多糖的产量从0.002 2 g/L到86.3 g/L不等[8]。
酸性含乳饮料因其清爽自然的口感以及较高的营养价值而颇受消费者欢迎，但是其加工过程的杀菌工艺和酸性环境，易导致料液组织状态不稳定，出现蛋白质沉淀、脂肪球上浮等现象[9]。通常情况下胶体系统的稳定性依赖于外界环境条件（pH值、温度、离子强度等）、蛋白质-多糖的比例和浓度。当外界环境条件相同时，多糖的类型便成为了决定体系均一的主要因素[10-11]。目前少有关于适用于酸性乳饮料中具有良好稳定性又不会增加浆料黏稠度的多糖类稳定剂的报道[12]。
本研究针对一株从传统酒曲中筛选得到的产EPS的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）GSBa-1，采用响应面优化其培养基的组成，旨在提高该菌株产EPS的能力。进一步研究其流变学特性，探讨其作为稳定剂应用于酸性乳饮料中的可行性，为EPS的产业化提供理论支持。
1.1 材料与试剂
解淀粉芽孢杆菌GSBa-1由本实验室分离纯化并冷冻保存。
胰蛋白胨、蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、氯化钠、氯化钙、氯化镁、碳酸钙、七水合硫酸镁、浓硫酸、重蒸酚、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、无水乙醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；果胶、羟丙基淀粉酯、羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMC）、大豆多糖河南千志商贸有限公司；实验用水为超纯水。
细菌基础培养基（LB培养基）：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、氯化钠10 g/L、琼脂粉20 g/L，于121 ℃高温灭菌20 min。
细菌基础发酵培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、氯化钠10 g/L，121 ℃高温灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
MLS-3750高压蒸汽灭菌锅 日本三洋公司；CR21GⅢ高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；HZQ-Q气浴恒温摇床 哈尔滨东联电子科技有限公司；Elx800型酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；S20型数显pH计瑞士梅特勒-托利多公司。
1.3 方法
1.3.1 种子液的制备
挑取-80 ℃冰箱中甘油管保藏的解淀粉芽孢杆菌GSBa-1，于LB固体平板划线活化，30 ℃培养箱中培养24 h。挑取少量单一菌落接种到细菌发酵培养基中，装液量30%，于30 ℃、120 r/min条件下摇床培养24 h作为种子液。
1.3.2 解淀粉芽孢杆菌GSBa-1产EPS的分离提取
EPS的提取方法参照Wang Ji等[13]稍作改动。解淀粉芽孢杆菌GSBa-1发酵结束后，100 ℃水浴加热15 min，以灭活可能会降解多糖的酶类。向发酵液中加入80% TCA，调节TCA质量分数至4%。室温振荡4 h后，4 ℃、10 000 r/min离心40 min，以除去破碎的细胞和蛋白质。向上清液中加入2 倍体积的无水乙醇置于4 ℃冰箱中过夜。4 ℃、10 000 r/min离心40 min，去上清液，用蒸馏水溶解沉淀，装入截留分子质量为8～14 kD的透析袋中，每8 h换一次水，透析48 h。
1.3.3 EPS含量的确定
采用苯酚-硫酸法测透析液中EPS含量，以葡萄糖为标准品，分别配制0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 mg/L的葡萄糖溶液，于490 nm波长处测吸光度。测得的葡萄糖标准曲线回归方程为：y＝0.008 78x+0.009 9，R2＝0.999 4。
1.3.4 解淀粉芽孢杆菌GSBa-1产EPS单因素试验设计
对影响EPS产量的主要因素进行单因素试验，分别选定氮源、碳源、蔗糖质量浓度、发酵温度、无机盐离子和初始培养基的pH值作为单因素。
1.3.4.1 碳源种类对EPS产量的影响
以1.1节中酵母浸粉为唯一碳源的基础上，分别添加果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉和葡萄糖，添加量为10 g/L，接种量4%，发酵温度35 ℃，发酵时间36 h，摇床转速120 r/min，分别测定EPS产量。
1.3.4.2 蔗糖质量浓度对EPS产量的影响
向1.1节基础发酵培养基中分别加入10、20、30、40、50 g/L的蔗糖，接种量4%，发酵温度35 ℃，发酵时间36 h，摇床转速120 r/min，分别测定EPS产量。
1.3.4.3 氮源种类对EPS产量的影响
在1.1节的基础上，分别选取蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、脱脂奶粉来替代基础培养基中的胰蛋白胨，添加量为10 g/L。接种量4%，发酵温度35 ℃，发酵时间36 h，摇床转速120 r/min，分别测定EPS产量。
1.3.4.4 发酵温度对EPS产量的影响
在1.1节的基础上，在接种量4%、摇床转速160 r/min的条件下培养24 h，测定不同的发酵温度（25、30、35、40、45 ℃）条件下EPS产量。
1.3.4.5 发酵时间对EPS产量的影响
在1.1节的基础上，在接种量4%、发酵温度35 ℃、摇床转速120 r/min的条件下，测定不同的发酵时间（12、24、36、48、60、72 h）条件下EPS产量。
1.3.4.6 无机盐离子对EPS产量的影响
在1.1节的基础上，分别选取氯化钠、硫酸镁、氯化钙、碳酸钙、氯化镁作为无机盐，添加量为10 g/L。接种量4%，发酵温度35 ℃，发酵时间36 h，摇床转速120 r/min，分别测定EPS产量。
1.3.4.7 初始培养基pH值对EPS产量的影响
在1.1节的基础上，调节初始培养基pH值分别为5、6、7、8、9。接种量4%，发酵温度35 ℃，发酵时间36 h，摇床转速120 r/min，分别测定EPS产量。
1.3.5 响应面试验
根据单因素试验结果，选取发酵温度、发酵时间和蔗糖质量浓度3 个因素，以EPS产量为响应值，根据Box-Behnken原理，设计三因素三水平响应面试验，每组试验重复3 次，结果见表1。通过Design-Expert 8.0.5b软件，分析该菌株产EPS最佳发酵条件，得到最优条件后，通过验证实验，证明模型的有效性。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Code and level of independent variables used for response surface methodology
1.3.6 流变学实验测定
分别配制0.3、0.5、1.0 mg/mL EPS溶液，使用流变仪（CC10号转子）分别测定其在不同的剪切速率（0～300 s-1）以及不同温度（0～70 ℃）条件下的流变学行为。
1.3.7 激光光散射测定
配制0.4 mg/mL的EPS溶液，45 ℃水浴加热4 h，轻轻搅动至完全溶解，过0.22 μm的滤膜。置于无尘处理过的石英池（25 mm）中，通过静态和动态激光光散射仪在40 ℃、功率22 mW、波长632.8 nm条件下测定EPS流体力学半径（hydrodynamic redius，Rh）、重均分子质量（weight-average molecular weight，mw）和均方回转半径（ridus of gyration，Rg）。结合Rg和Rh，可以计算结构参数：ρ＝Rg/Rh。ρ是多聚体或胶体的重要特征参数，取决于高分子的链结构、构象和多分散性，与分子质量无关。
1.3.8 TEM观察
采用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）对EPS的分子形态进行观察。将EPS溶于无菌水中至终质量浓度0.5 mg/L，振摇4 h使其充分溶解，过0.22 μm滤膜。取一滴EPS溶液滴于覆有薄碳层的钢丝膜上，室温蒸发除水。200 kV条件下观察EPS形态。
1.3.9 EPS在酸性乳饮料中的应用
1.3.9.1 调制酸性乳饮料
巴氏杀菌奶3.6%，蔗糖5%，分别加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的EPS、果胶、CMC、羟丙基淀粉酯和大豆多糖，混合均匀后冷却到20 ℃以下，用10%柠檬酸调pH值至5.5。20 MPa均质后分装于牛奶瓶，100 mL/瓶，巴氏杀菌（75 ℃、15 min）后室温保存，通过测定其保水率来评估其稳定性[14]。
1.3.9.2 保水率测定
在有刻度的试管中，准确加入调制好的饮料20 mL，记录试管质量m0，加入样品后的质量m1。4 000 r/min离心20 min，弃去上清液，准确称量沉淀物质量m2，根据下式计算保水率：
1.3.9.3 黏度测定
用布氏流变仪测定各酸性乳饮料黏度。选用34号转子，剪切速率5 r/min，变量范围为0～120 s-1。测定其黏度变化。
2.1 单因素试验结果
2.1.1 碳源种类对EPS产量的影响
碳源一直是影响EPS产量的重要因素。不同的碳源种类对于同一菌株或者同一菌株对于不同的碳源，EPS产量都不相同。Polak-Berecka等[15]指出当使用乳糖作为碳源，Lactobacillus rhamnosus R的EPS产量相比于葡萄糖作为碳源会有大幅下降。
图1 碳源种类对EPS产量的影响
Fig. 1 Effect of carbon source on the yield of EPS
由图1可知，以蔗糖作为碳源时EPS产量最大，因此选择蔗糖作为培养基的碳源，此时最优产量为139.04 mg/L。
2.1.2 蔗糖质量浓度对EPS产量的影响
图2 蔗糖质量浓度对EPS产量的影响
Fig. 2 Effect of sucrose concentration on the yield of EPS
由图2可知，随着蔗糖质量浓度增加，可供菌体利用转化的糖类底物质量浓度增加，当蔗糖质量浓度为40 g/L时，EPS产量为176 mg/L。继续增加蔗糖质量浓度，则会对菌体产生渗透胁迫，抑制菌体生长，因此在本试验中选取40 g/L为最适的蔗糖质量浓度。
2.1.3 氮源种类对EPS产量的影响
生物量是影响EPS产量的一个主要因素。研究表明氮源的添加有益于细胞生长，增加菌体密度，促进菌体细胞将糖类物质转化为多糖[16]。De等[17]研究指出向MRS培养基中添加(NH4)2HPO4后，Rhzobium radiobacter CGMCC 12099产凝胶多糖是无氮源添加的2.1 倍。
图3 氮源种类对EPS产量的影响
Fig. 3 Effect of nitrogen source on the yield of EPS
由图3可知，胰蛋白胨作为氮源时，EPS产量最高，为226.24 mg/L。其次为大豆蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨和脱脂乳粉，因此，选择胰蛋白胨作为氮源进行下一步试验。
2.1.4 发酵温度对EPS产量的影响
图4 发酵温度对EPS产量的影响
Fig. 4 Effect of the fermentation temperatures on the yield of the EPS
由图4可知，在35 ℃时，EPS产量达到最大值214.11 mg/L。但是随着温度升高，EPS产量下降，可能是高温导致菌体合成多糖的酶活力下降。因此选择35 ℃为最适的发酵温度。
2.1.5 发酵时间对EPS产量的影响
图5 发酵时间对EPS产量的影响
Fig. 5 Effect of fermentation time on the yield of EPS
如图5所示，随着发酵时间的延长，EPS产量呈现先增加后降低的趋势，在36 h时，EPS的产量达到最大值243.62 mg/L。36 h后多糖的产量呈现大幅度下降，可能是由于酶解或者培养环境理化参数的改变[18]。发酵时间延长，菌体自溶，分解代谢多糖的酶分泌到胞外，进而降低EPS产量，因此在后续的试验中选取36 h为最佳发酵时间。
2.1.6 无机盐离子对EPS产量的影响
培养基中的金属离子会影响菌体生长代谢相关的酶类。一方面直接影响与菌体糖代谢直接相关的酶类活性，另一方面调节培养基的渗透压、pH值、氧化还原电位等来影响EPS的生成[19]。当微生物生长缺乏微量元素时会导致细胞生长缓慢，但过量又会对微生物机体产生毒害作用。因此，需要控制培养基中无机盐离子的种类和比例。
由图6可知，氯化钙对EPS产量的影响最明显，添加量为10 g/L时，EPS产量为153.12 mg/L。
图6 无机盐离子对EPS产量的影响
Fig. 6 Effect of inorganic salt ions on the yield of EPS
2.1.7 初始培养基pH值对EPS产量的影响
每种菌株都有其最适的生长和产EPS pH值范围。pH值大小同样会影响微生物生长过程中代谢酶和产物生成酶的活性。只有在最适pH值范围内，才能最大程度提高酶促反应的速率，使微生物生长和代谢产物合成速率达到最大[20]。
图7 初始pH值对EPS产量的影响
Fig. 7 Effect of initial pH on the yield of EPS
由图7可知，随着pH值的不断升高，EPS产量呈现先增大后减小的趋势，最适pH值为7，此时EPS产量为176.99 mg/L，明显高于其他pH值条件。这与大多数研究结果相一致[21-22]。
通过以上单因素试验能够得出本试验的最佳培养基组成为：蔗糖40 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、氯化钠10 g/L。
2.2 响应面法优化发酵最佳条件
2.2.1 响应面试验结果
表2 Box-Behnken设计方案及结果
Table 2 Box-Behnken design with response values
根据Box-Behnken原理，设计三因素三水平的响应面分析试验。通过Design-Expert响应面设计软件分析，共有16 个试验点，以蔗糖质量浓度、发酵温度、发酵时间为自变量，以EPS产量为响应值，不同试验条件下所得的EPS产量如表2所示。
2.2.2 试验模型的建立及显著性分析
以EPS产量作为响应指标，利用Design-Expert 7.1.6软件对表进行二次多元回归拟合，得到EPS产量（Y）对编码自变量X1、X2、X3的二次多项回归方程：Y＝320.20+ 19.38X1+37.38X2-22.00X3+21.75X1X3-98.85X12-89.85X22-67.10X32。
表3 回归模型的方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
注：**.影响极显著（P＜0.01），*.影响显著（P＜0.05）。
由表3可知，在设计的水平内，模型的F值为106.46，影响显著。函数的相关系数R2为0.982 2，R2值越接近1说明误差的影响越小，表明该函数可以较好地模拟发酵过程。校正系数R2Adj为0.959 2，说明95.92%的响应值变化可以用该模型来表示。失拟项的F值为3.60，P＝0.213 6＞0.05，即失拟不显著，表明该函数关系可以充分的表现真实的发酵情况。通过比较各因素的F值，可以得出其对EPS产量的影响由大到小分别为：X2＞X3＞X1。其中，模型的一次项X2影响极显著，X1和X3对EPS产量影响显著，二次项X12、X22、X32极显著，交互项X1X3显著，其他交互项不显著。以上结果表明各影响因素对发酵条件的影响不是简单的线性关系。
2.2.3 响应面交互作用分析
由图8a可知，等高线近似圆形，表明蔗糖质量浓度和发酵温度交互作用不显著。将发酵时间控制为0 h时，蔗糖质量浓度设定为固定值，随着发酵温度的逐渐升高，EPS产量先增大后减小，在发酵温度25～45 ℃范围内，EPS产量达到最大。
由图8b可知，发酵时间和蔗糖质量浓度的等高线图呈椭圆形，说明二者交互作用显著。固定发酵温度为0 ℃时，固定发酵时间为一固定值，随着蔗糖质量浓度的升高，EPS产量提高。
由图8c可知，发酵温度和发酵时间的等高线图接近圆形，说明二者交互作用不显著。固定蔗糖质量浓度为零，当发酵温度一定时，随着发酵时间的延长，EPS的产量先增大后减少。
图8 各因素交互作用对EPS产量影响的等高线和响应面图
Fig. 8 Response surface and contour plots showing the effects of various factors on the yield of EPS
综上可知，响应值Y存在最大值，该值越大说明发酵水平越稳定，确定最大稳定点。因此发酵最佳条件为蔗糖质量浓度40 g/L、发酵时间36 h、发酵温度35 ℃。带入拟合的函数式，得到预测的EPS产量为327.594 mg/L。验证实验采用模型条件进行发酵，3 个平行实验取平均值，所得到的结果为326.45 mg/L，与预测结果基本一致，说明该模型适用于模拟实际情况。
2.3 EPS的流变特性
图9 不同质量浓度EPS溶液在不同剪切速率（A）和温度（B）条件下的黏度
Fig. 9 Viscosity of EPS solution as a function of shearing rate and temperature
由图9A可知，1 mg/mL EPS溶液仍表现出了较低的黏度。0.3、0.5、1.0 mg/mL EPS溶液黏度随着剪切速率的升高而升高，表现出剪切增稠的现象。此现象在其他研究中也有报道[15-17]，随着剪切速率的增加可能会打破原本坚硬规则的结构，致使黏度增加。由图9B可知，随着温度的升高其黏度下降，这与大多数报道相符，高温会打破分子原本的规则结构使其呈现较为稀松的构象[23-25]，降低其分子间的接触频率。另一方面高温同样也会导致EPS内部的分子发生重排，打破其结构完整性[26]。
2.4 EPS的光散射测定结果
通过光散射测量高分子的mw、Rg以及第二维里系数（A2）；确定高分子的形状。
图10 0.4 mg/mL EPS溶液静态光散射的Zimm图
Fig. 10 Zimm plot of 0.4 mg/mL EPS solution
如图10所示，0.4 mg/mL的EPS溶液在小散射角度没有发生弯曲，说明该溶液中分子没有发生聚集。当只有一个质量浓度的光散射数据时，如果质量浓度足够低，该浓度下数据点成直线，该直线可以看做Zimm图中c为0的线，可以根据该直线的斜率与截距计算mw、Rg。EPS在水溶液中mw为4.993×105g/mol，Rg为48.34 nm。
通过光散射仪在90°测得的EPS在水溶液中的Rh为64.62 nm。经计算得ρ为0.748，对于单分散体系来说，ρ等于0.775为致密球体。ρ在1.5～1.8之间为柔性无规则卷曲的链状结构。ρ大于2为舒展的链结构[27]。因此推测该EPS可能为致密的球体结构。
2.5 EPS的TEM观察结果
图11 0.4 mg/mL的EPS溶液在TEM下的图像
Fig. 11 Transmission electron microscope images of 0.4 mg/mL EPS solution
如图11所示，EPS在水溶液中，40 000 倍放大观察，呈现黑色球体或椭圆形结构，在灰色背景下分子直径在30～150 nm范围内。这与Ren Wei等[28]TEM观察Paenibacillus bovis sp. nov BD3526的EPS结构相一致。这种球形结构在嗜热链球菌、变异链球菌和枯草芽孢杆菌EPS的结构解析中也曾有过报道[29]。这种球形结构可能是导致溶液低黏度的主要原因，相比于杆状或者片状的EPS，球状的EPS在水溶液中具有较低的溶胀特性，分子间相互作用较少，不易使溶液增稠[30-32]。
2.6 EPS在酸性乳饮料中的应用
图12 EPS溶液及常见稳定剂对酸性乳饮料保水性的影响
Fig. 12 Effect of EPS solution and several common stabilizers on the water retention of acid beverage
由图12可知，当EPS添加量为0.1%时，具有和大豆多糖、羟丙基淀粉酯相似的保水特性。随着EPS含量的增加，其保水率略有下降，当EPS含量超过0.3%时，其保水性下降幅度较大。可能是因为粗EPS样品中含有杂质，阻碍了其分子之间的相互作用[33-34]。
图13 不同含量的EPS和稳定剂添加对酸性乳饮料的黏度影响
Fig. 13 Effect of different concentrations of EPS solution and stabilizers on the viscosity of acid beverage
如图13所示，当含量超过0.4%时，CMC表现出了良好的稳定性。果胶虽然具有较为明显的稳定性优势，但是随着含量增加，果胶具有较为明显的增稠作用，同时羟丙基淀粉酯也会使料液黏度增加，羟丙基淀粉酯在0.1%的添加量情况下，溶液黏度达到30 Pa•s，而EPS只有12 Pa•s。随着EPS含量的增加，酸性乳饮料的黏度表现出了先下降后上升的趋势。
综上可知，大豆多糖具有较好的稳定性，并且随着含量的增加，不会改变料液的黏度。CMC含量大于0.4%时，可以在不增大料液黏度的前提下具有良好的稳定性。但与之相比，添加0.3%粗EPS可以具有与0.3% CMC相同的黏度，但是稳定性明显优于CMC，其中果胶和羟丙基淀粉酯会明显增加料液稠度，并不适合单独应用于酸性乳饮料。综合结果表明，该EPS具有低黏度以及良好的稳定性，具有作为新型食品稳定剂的潜力。
本研究针对一株从传统的江米酒酒曲中筛选得到的解淀粉芽孢杆菌GSBa-1，通过单因素试验和响应面试验对其产EPS的条件进行优化。得到最佳的发酵条件为：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、蔗糖20 g/L、氯化钙10 g/L、发酵温度35 ℃、发酵时间36 h、摇床转速160 r/min、接种量4%。在此条件下EPS产量为326.45 mg/L。经验证该模型可靠。
使用哈克流变仪对不同质量浓度的EPS溶液进行流变学测定，结果表明该EPS溶液具有较低的黏度，且其黏度随着质量浓度和剪切速率的增加而增加，随着温度升高而降低。根据光散射仪测定该EPS的流体流体力学半径和回旋半径，推测该EPS为紧密的球状分子。采用TEM对该EPS分子进行形态观察，验证了该EPS球状结构。
将提取得到的EPS作为稳定剂添加于酸性乳饮料中，该产品的稳定性与添加大豆多糖的酸性乳饮料相接近，其黏度高于大豆多糖，与添加CMC的酸性乳饮料相接近。综合研究表明解淀粉芽孢杆菌GSBa-1 EPS具有作为食品稳定剂的应用前景。
参考文献：
[1] BERGILLOS-MECA T, CABRERA-VIQUE C, ARTACHO R, et al. Does Lactobacillus plantarum or ultrafiltration process improve Ca, Mg, Zn and P bioavailability from fermented goats’milk?[J]. Food Chemistry, 2015, 187: 314-321. DOI:10.1016/ j.foodchem.2015.04.051.
[2] SAIJA N, WELMAN A D, BENNETT R J. Development of a dairybased exopolysaccharide bioingredient[J]. International Dairy Journal, 2010, 20(9): 603-608. DOI:10.1016/j.idairyj.2010.03.011.
[3] KHATTAR J, JINDAL N. Isolation and characterization of exopolysaccharides produced by the cyanobacterium Phormidium valderianum[J]. Journal of Biotechnology, 2008, 136: 423-424. DOI:10.1016/j.jbiotec.2008.07.981.
[4] BULDO P, BENFELDT C, FOLKENBERG D M, et al. The role of exopolysaccharide-producing cultures and whey protein ingredients in yoghurt[J]. LWT-Food Science and Technology, 2016, 72: 189-198. DOI:10.1016/j.lwt.2016.04.050.
[5] JOLLY L, STINGELE F. Molecular organization and functionality of exopolysaccharide gene clusters in lactic acid bacteria[J]. International Dairy Journal, 2010, 11(9): 733-745. DOI:10.1016/S0958-6946(01)00117-0.
[6] 曹永强, 王辑, 赵笑, 等. 植物乳杆菌YW11生产胞外多糖的发酵条件研究[J]. 食品科学技术学报, 2016, 11(1): 42-49; 78.
[7] HAHN C, MULLER E, WILLE S, et al. Control of microgel particle growth in fresh cheese (concentrated fermented milk) with an exopolysaccharide-producing starter culture[J]. International Dairy Journal, 2014, 36(1): 46-54. DOI:10.1016/j.idairyj.2013.12.011.
[8] DONOT F, FONTANA A, BACCOU J C, et al. Microbial exopolysaccharides: main examples of synthesis, excretion, genetics and extraction[J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 87(2): 951-962. DOI:10.1016/j.carbpol.2011.08.083.
[9] BOELS I C, VAN KRANENBURG R, HUGENHOLTZ J, et al. Sugar catabolism and its impact on the biosynthesis and engineering of exopolysaccharide production in lactic acid bacteria[J]. International Dairy Journal, 2001, 11(9): 723-732. DOI:10.1016/S0958-6946(01)00116-9.
[10] BULDO P, BENFELDT C, CAREY J P, et al. Interactions of milk proteins with low and high acyl gellan: effect on microstructure and textural properties of acidified milk[J]. Food Hydrocolloids, 2016, 60: 225-231. DOI:10.1016/j.foodhyd.2016.03.041.
[11] LANEUVILLE S I, TURGEON S, SYLVIE L, et al. Microstructure and stability of skim milk acid gels containing an anionic bacterial exopolysaccharide and commercial polysaccharides[J]. International Dairy Journal, 2014, 37(1): 5-15. DOI:10.1016/j.idairyj.2014.01.014.
[12] LI Y H, WANG W J, XU X J, et al. Short communication: changes in fluorescence intensity induced by soybean soluble polysaccharide-milk protein interactions during acidification[J]. Journal of Dairy Science, 2015, 98(12): 8577-8580. DOI:10.3168/jds.2015-9971.
[13] WANG J, ZHAO X, YANG Z N, et al. Characterization of an exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum YW11 isolated from Tibet Kefir[J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 125: 16-25. DOI:10.1016/j.carbpol.2015.03.003.
[14] GIENTKA I, BZDUCHA-WRÓBEL A, LIDIA S R, et al. The exopolysaccharides biosynthesis by Candida yeast depends on carbon sources[J]. Electronic Journal of Biotechnology, 22(8): 31-37. DOI:10.1016/j.ejbt.2016.02.008.
[15] POLAK-BERECKA M, CHOMA A, WAŚKO A, et al. Physicochemical characterization of exopolysaccharides produced by Lactobacillus rhamnosus on various carbon sources[J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 117: 501-509. DOI:10.1016/j.carbpol.2014.10.006.
[16] WANG K, LI W, CHEN X H, et al.Structural characterization and bioactivity of released exopolysaccharides from Lactobacillus plantarum 70810[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2014, 67: 71-78. DOI:10.1016/ j.ijbiomac.2014.02.056.
[17] DE P S, BASU P S. Extracellular polysaccharide production by a Rhzobium sp. from root nodules of Derris scandens[J]. Folia Microbiologica, 1996, 41(4): 368-372. DOI:10.1007/bf02814717.
[18] ALVESV D, FREITAS F, TORRES C A V, et al. Rheological and morphological characterization of the culture broth during exopolysaccharide production by Enterobacter sp.[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 81(4): 758-764. DOI:10.1016/j.carbpol.2010.03.048.
[19] CRUZ M, FREITAS F, TORRES C A V, et al. Influence of temperature on the rheological behavior of a new fucosecontaining bacterial exopolysaccharide[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 48(4): 695-699. DOI:10.1016/ j.ijbiomac.2011.02.012.
[20] JUMEL K. Molar mass determination of complex bioglycopolymers by size exclusion chromatography and light scattering detection[J]. Journal of Chromatography Library, 2002, 66: 305-345. DOI:10.1016/ S0301-4770(02)80034-3.
[21] TORRES C A, ANTUNES V S, RICARDO A R, et al. Study of the interactive effect of temperature and pH on exopolysaccharide production by Enterobacter A47 using multivariate statistical analysis[J]. Bioresource Technology, 2012, 119: 148-156. DOI:10.1016/j.biortech.2012.05.106.
[22] TORRES C A V, MARQUES R, SILVIA A, et al. Kinetics of production and characterization of the fucose-containing exopolysaccharide from Enterobacter A47[J]. Journal of Biotechnology, 2011, 156(4): 261-267. DOI:10.1016/j.jbiotec.2011.06.024.
[23] XU X F, GAO C X, LIU Z M, et al. Characterization of the levan produced by Paenibacillus bovis sp. nov BD3526 and its immunological activity[J]. Carbohydrate Polymers, 2016, 144: 178-186. DOI:10.1016/j.carbpol.2016.02.049.
[24] KAVITA K, MISHRA A, JHA B, et al. Extracellular polymeric substances from two biofilm forming Vibrio species: characterization and applications[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 94(2): 882-888. DOI:10.1016/j.carbpol.2013.02.010.
[25] SARDARI R R R, KULCINSKAJA E, RON E Y C, et al. Evaluation of the production of exopolysaccharides by two strains of the thermophilic bacterium Rhodothermus marinus[J]. Carbohydrate Polymers, 2017, 156: 1-8. DOI:10.1016/j.carbpol.2016.08.062.
[26] SALZILLO R, SCHIRALDI C, CORSUTO L, et al. Optimization of hyaluronan-based eye drop formulations[J]. Carbohydrate Polymers, 2016, 153: 275-283. DOI:10.1016/j.carbpol.2016.07.106.
[27] GIENTKA I, BZDUCHA-WRÓBEL A, STASIAK-RÓŻAŃSKA L, et al. The exopolysaccharides biosynthesis by Candida yeast depends on carbon sources[J]. Electronic Journal of Biotechnology, 2016, 22: 31-37. DOI:10.1016/j.ejbt.2016.02.008.
[28] REN W, XIA Y J, WANG G Q, et al. Bioactive exopolysaccharides from a S. thermophilus strain: screening, purification and characterization[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 86: 402-407. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2016.01.085.
[29] AI L, GUO Q, DING H, et al. Structure characterization of exopolysaccharides from Lactobacillus casei LC2W from skim milk[J]. Food Hydrocolloids, 2016, 56: 134-143. DOI:10.1016/ j.foodhyd.2015.10.023.
[30] KŠONŽEKOVÁ P, BYSTRICKÝ P, VLČKOVÁ S, et al. Exopolysaccharides of Lactobacillus reuteri: their influence on adherence of E. coli to epithelial cells and inflammatory response[J]. Carbohydrate Polymers, 2016. 141: 10-19. DOI:10.1016/ j.carbpol.2015.12.037.
[31] LIU J, WANG X C, PU H M, et al. Recent advances in endophytic exopolysaccharides: production, structural characterization physiological role and biological activity[J]. Carbohydrate Polymers, 2017. 157: 1113-1124. DOI:10.1016/j.carbpol.2016.10.084.
[32] BADEL S, BERNARDI T, MICHAUD P. New perspectives for Lactobacilli exopolysaccharides[J]. Biotechnology Advances, 2011, 29(1): 54-66. DOI:10.1016/j.biotechadv.2010.08.011.
[33] DUBOC P, MOLLET B. Applications of exopolysaccharides in the dairy industry[J]. International Dairy Journal, 2001, 11(9): 759-768. DOI:10.1016/S0958-6946(01)00119-4.
[34] LAWS A P, MARSHAL L V M. The relevance of exopolysaccharides to the rheological properties in milk fermented with ropy strains of lactic acid bacteria[J]. International Dairy Journal, 2001, 11(9): 709-721. DOI:10.1016/S0958-6946(01)00115-7.
Production of Exopolysaccharide by Fermentation with Bacillus amyloliquefaciens GSBa-1, Its Rheological Characterization and Application
ZHAO Wen, TENG Junwei, ZHANG Jian, ZHAO Xiao, JIANG Yunyun, YANG Zhennai*
(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)
Abstract：The present study was carried out to optimize the fermentation conditions for exopolysaccharide (EPS) production by Bacillus amyloliquefaciens GSBa-1, isolated and screened from the traditional rice wine starter. The optimal fermentation conditions obtained by single factor experiments and response surface analysis were as follows: the culture medium consisted of peptone 10 g/L, yeast extract powder 5 g/L, sucrose 40 g/L, and NaCl 10 g/L and the fermentation was performed for 36 h at 35 ℃ with an inoculum size of 4% at a shaking speed of 160 r/min. The maximal production of EPS of 326.45 mg/L was obtained under the above conditions. The results of rheological studies indicated that the aqueous solution of the EPS had low viscosity, which increased with increasing its concentration and shearing rate. Measurement of molecular parameters by multi-angle laser light scattering showed that the weight-average molecular mass (mw) of the EPS was 4.993 × 105g/mol, the radius of gyration (Rg) 48.34 nm, hydrodynamic radius (Rh) 64.62 nm, and Rg/Rhratio (ρ) 0.748, indicating that the EPS molecule may be present as compact spheres. This was also confirmed by transmission electron microscope. The application of this EPS in acid milk beverage showed that the use of the EPS could improve the stability of the beverage without increasing its viscosity, indicating that the EPS from Bacillus amyloliquefaciens GSBa-1 can be potentially used as a novel food stabilizer.
Key words：exopolysaccharide; rheological characterization; laser light scattering; acid milk beverage
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201716001
中图分类号：TS201.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）16-0001-09
引文格式：
赵雯, 腾军伟, 张健, 等. 解淀粉芽孢杆菌GSBa-1胞外多糖的发酵制取、流变学特性和应用[J]. 食品科学, 2017, 38(16): 1-9. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716001. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-10-06
基金项目：国家自然基金科学面上项目（31371804）
作者简介：赵雯（1994—），女，硕士研究生，研究方向为乳品生物技术。E-mail：13614317400@163.com
*通信作者：杨贞耐（1965—），男，教授，博士，研究方向为乳品科学及加工技术。E-mail：yangzhennai@th.btbu.edu.cn
ZHAO Wen, TENG Junwei, ZHANG Jian, et al. Production of exopolysaccharide by fermentation with Bacillus amyloliquefaciens GSBa-1, its rheological characterization and application[J]. Food Science, 2017, 38(16): 1-9. (in Chinese with English abstract)
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201716001. http://www.spkx.net.cn