小菜蛾moricin在毕赤酵母中的表达及抑菌活性分析

黄钦耿,梁 玲,陈巧红,吴松刚,黄建忠*

(福建师范大学生命科学学院,工业微生物教育部工程研究中心,福建 福州 350108)

摘 要:抗生素的过度使用给自然生态带来诸多不利影响,寻找合适的抗生素的替代物,从而减少抗生素的使用正成为当下的研究热点。以来自于小菜蛾的特异性抗菌肽moricin为研究对象,研究其酵母异源表达水平和抑菌性能及生化特性,为进一步的开发利用提供理论支持。根据已有的小菜蛾抗菌肽moricin特异性基因信息,采用聚合酶链式反应扩增其成熟肽基因mor-3,并克隆至pGAPZα A质粒中,构建组成型分泌表达载体pGAPZα A-mor3,线性化片段电转化导入毕赤酵母SMD1168菌株,高质量浓度Zeocin筛选获得高拷贝重组转化子。以yPD为培养基进行摇瓶发酵,重组蛋白获得高效表达,分子质量约为5 kD,与理论预测的基本一致;发酵60 h,上清液中重组蛋白表达量达248.98 mg/L,而且耐热性能良好,同时具备较强的耐强酸及强碱的能力,特别在强酸环境中活性保持稳定,体现了较好的机体内环境的适应性潜力;对部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有抑菌作用,特别是对革兰氏阴性菌具备特异性较强的抑制作用,对大肠杆菌的最低抑菌浓度为6.25 μg/mL,而对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度仅为124.49 μg/mL。独特的抑菌性能和理化特点,使其具备广阔的开发应用前景及良好的社会与环保效益。

关键词:抗菌肽;moricin;毕赤酵母;高效表达;抑菌活性;生化特性

抗菌肽是一类广泛存在于生物体内的天然免疫的重要介质,是宿主防御系统的重要组成部分,在生物体遭受外界异物刺激或病原微生物感染时能够快速产生的具有多种生物学活性的小分子多肽[1-2]。抗菌肽的来源非常广泛,而且种类繁多,功能多样,自1962年Kiss等[3]首次从铃蟾皮肤分泌物中分离出铃蟾抗菌肽以来,短短几十年中,在植物、微生物、昆虫、两栖类以及哺乳动物等中已发现和鉴定抗菌肽一千多种,其中昆虫来源的抗菌肽已经超过两百种[4-8]。抗菌肽对于细菌、真菌、原虫、病毒等具有非特异性的抑制作用,能抑杀癌变细胞,而且可作为免疫效应分子来启动、调节生物体的一系列免疫反应[2,4,9-10]。另外,抗菌肽杀菌机制与传统抗生素不同,多数抗菌肽通过细胞膜电荷的区别进行选择性杀伤,所以其对正常哺乳动物细胞几乎无毒性,而且由于细胞膜具有的高度保守性,故耐药的产生尤其困难甚至几乎不可能,被认为是一类天然的肽类抗生素[11-13]。也正是由于抗菌肽独特的抗菌机理、高效广谱的抑菌活性以及绿色安全的特性,使其成为最具开发前景的新型抗菌药物[14-15]。随着对抗菌肽作用机理及结构与功能关系研究的不断深入,在抗生素广泛及过度使用且已引起一系列不利情况的今天,抗菌肽越来越显示出了其在药物开发、食品工业、植物抗病及饲料科学等领域的独特应用价值[8,16-18],特别是在推行无抗养殖、保证食品健康的过程中,抗菌肽的应用研究更是备受青睐。

由于天然抗菌肽的表达量低、提取过程复杂,导致难以大量获得;而化学合成的成本高、价格昂贵,且对多数微生物宿主存在一定的毒性,这也导致抗菌肽的规模化生产应用一直受到制约。所以,选用合适宿主,利用基因工程手段进行抗菌肽异源表达的研究一直备受关注[19]。而酵母由于其背景清晰、蛋白翻译及后修饰功能完善以及便于培养等特点,使得其表达体系成为抗菌肽代谢工程研究中应用最为广泛和重要的表达体系之一[20-22]

本实验以蛋白酶缺陷毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株SMD1168为宿主,采用pGAPZα A质粒为模板构建真核表达载体,将特异性的小菜蛾抗菌肽moricin的成熟肽基因整合至毕赤酵母基因组中,利用GAP启动子及α-factor分泌信号肽进行组成型分泌表达,以期获得具有抗菌活性功能的重组蛋白,并对其相关抗菌性能及生化特性进行研究,为进一步开发特异性抗生素替代物的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株和质粒

大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10F’、E. coli CMCC44103、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923,由工业微生物教育部工程研究中心保存。

P. pastoris SMD1168、表达载体pGAPZα A 美国Invitrogen公司;pMD19-T Simple vector 日本TaKaRa公司;含特异性小菜蛾抗菌肽moricin完整基因序列的重组质粒pEASY-mor由福建农林大学应用生态研究所提供。

1.1.2 工具酶和试剂

pfu Taq DNA聚合酶、限制性内切酶AvrⅡ、EcoRⅠ、KpnⅠ、小牛肠碱性磷酸酶(calf intestine alkaline phosphatase,CIAP)、DNA ligation kit、DNA ladder Marker、预染低分子质量蛋白Marker 日本TaKaRa公司;博来霉素(Zeocin,pGAPZα A载体自带的选择性标记) 美国Sigma公司;质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、Tricine、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺、丙烯酰胺、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、胰蛋白胨、酵母粉 生工生物工程(上海)股份有限公司;Bradford蛋白浓度测定试剂盒 上海美季生物技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3 引物设计与合成

moricin成熟肽基因聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)上下游引物均带有酶切位点和保护碱基,而且上游引物中融合起始密码子ATG,具体如下:

mor3-F:5’-CGGAATTCCGGCGCCCAAGGTCAAC GTC-3’(划线部分为EcoRⅠ酶切位点)

mor3-R:5’-GGGGTACCCCCTACCCCTGGTTCCT-3’(划线部分为KpnⅠ酶切位点)

同时,合成一对验证引物:Alpha-F:5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’AOX1-R:5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’1.1.4 培养基

LB培养基:蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g,调pH值至7.0,蒸馏水定容至1 000 mL,固体培养基在此基础上添加20 g琼脂,121 ℃灭菌20 min。

LLB培养基:LB培养基NaCl添加量减半,调pH值至7.5。

YPD培养基:酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g,pH值自然,蒸馏水定容至1 000 mL,固体培养基在此基础上添加20 g琼脂,121 ℃灭菌20 min。

YPDS培养基:酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、1 mol/L山梨醇,pH值自然,蒸馏水定容至1 000 mL,固体培养基在此基础上添加20 g琼脂,121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

PCR仪 美国Applied Biosystems公司;电转化仪、光密度扫描仪 美国Bio-Rad公司;自动凝胶图像分析仪 上海培清科技有限公司;离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;核酸及蛋白电泳仪 北京市六一仪器厂;恒温培养箱、电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司;恒温摇床 上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 特异性抗菌肽moricin3成熟肽基因mor-3的扩增及纯化

采用mor3-F/R为引物对,以pEASy-mor质粒为模板,采用pfu Taq DNA聚合酶按如下体系进行PCR扩增:10×pfu Buffer 5 µL、mor3-F与mor3-R各2 µL、模板0.5 µL(约50 ng)、酶1 µL,加ddH2O补至50 µL。PCR扩增条件:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s,57 ℃退火40 s,72 ℃延伸25 s,30 个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃条件下保存。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,并将其目的条带割胶回收、纯化并进行测序验证。

1.3.2 重组表达载体pGAPZα A-mor3的构建

对PCR回收产物及抽提的pGAPZα A空载体分别进行EcoRⅠ与KpnⅠ双酶切,分别回收酶切的目的基因及载体片段,然后进行T4 DNA连接酶连接并将连接产物转化E. coli TOP10F’感受态细胞,采用LLB(含50 μg/mL Zeocin)平板进行抗性筛选,并用验证引物进行菌液PCR阳性重组子鉴定,送交上海生工测序验证。

1.3.3 重组表达载体pGAPZα A-mor3转化毕赤酵母SMD1168

将获得的重组载体用AvrⅡ线性化并进行回收后,取20 μL线性化的载体与80 μL的毕赤酵母SMD1168感受态细胞混合,冰中放置30 min后,电转仪(电压2 000 V、电容25 μF)电击转化感受态细胞。将转化后的SMD1168细胞涂布含100 μg/mL Zeocin的YPDS平板,30 ℃条件下倒置培养至单菌落出现。单克隆出现后,采用煮沸-冻融法进行菌落PCR验证,筛选阳性克隆转化子。同时,采用含100~300 μg/mL的Zeocin的YPDS平板进行mor-3基因多拷贝整合的筛选,用于获得高效表达特异性抗菌肽moricin3的重组菌株。

1.3.4 重组菌目的蛋白的组成型表达

挑取抗高质量浓度Zeocin的克隆,于装有30 mL YPD液体培养基中进行种子培养,至OD600nm为3~4时,按20%移种量(10 mL种子液转接于40 mL YPD培养基中)转接,30 ℃、220 r/min培养60 h,收集上清液。采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定上清液中的总蛋白浓度。采用光密度扫描仪扫描十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)胶中目的条带所占总蛋白百分比,计算上清液中重组蛋白的表达量。采用Tricine-SDS-PAGE(16.5%分离胶、10%成层胶、4%积层胶)分析产物分泌表达情况。

1.3.5 重组菌发酵上清液的抗菌活性分析及最低抑菌浓度的测定

采用改良的琼脂孔穴扩散法[23]进行抗菌活性的分析。分别接种S. aureus ATCC25923和E. coli CMCC44103的斜面,并制备菌悬液,其OD600nm为10;然后,取0.4 mL菌悬液至70 mL、50 ℃左右的LB固体培养基内,迅速混匀后,倒入21 cm×14 cm×0.3 cm的玻璃平板的长方体槽内,静置冷却至完全凝固,放入白瓷盒内。用灭菌的打孔器(直径8 mm)打孔,每孔加入20 μL重组菌发酵表达上清液,同时加入等体积的pGAPZα A空载体转化的SMD1168细胞表达上清液和原始SMD1168细胞表达上清液为阴性对照,加入5 μL 100 mg/mL Amp为阳性对照,加样后,小心地将白瓷盒移入4 ℃冰箱放置2 h。将含有待测样品的玻璃平板转移至37 ℃培养箱培养,24 h后,观察并测量抑菌圈直径。采用管碟法测定重组菌表达上清液的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)[24]

1.3.6 重组菌发酵上清液的温度及酸碱敏感性分析

温度耐受性分析:将重组菌发酵上清液分别沸水浴处理10、20、30 min,以未处理为对照组,分别检测不同处理样品对E. coli CMCC44103抑菌活性。

酸碱敏感性分析:取相同体积的重组菌发酵上清液分别用1 mol/L的HCl或NaOH溶液处理10、20、30 min,作用结束后,分别用等体积1 mol/L的NaOH或HCl溶液进行中和,以未经处理的重组菌上清液为对照,测定不同处理方式、不同处理时间的样品对E. coli CMCC44103的抑菌活性影响。

2 结果与分析

2.1 成熟肽基因mor-3的克隆及鉴定

图1 成熟肽mor-3基因的PCR扩增
Fig. 1 PCR Amplification of mor-3 gene

以pEASY-mor质粒为模板,PCR扩增成熟肽基因mor-3,产物经电泳检测,获得大小约为100 bp的单一条带,与预测的条带大小(129 bp)基本一致(图1)。PCR产物的测序结果显示,成熟肽基因总长度129 bp(含终止密码子),可编码42 个氨基酸与从小菜蛾基因组中克隆的另外2 个moricin的成熟肽基因存在3 个氨基酸的突变,分别位于成熟肽的第10位(R10K)、14位(R14H)、17位(R17K),其与pEASY-mor完整基因的成熟肽序列完全一致,说明抗菌肽moricin3的成熟肽基因(mor-3)克隆成功。

2.2 表达载体pGAPZα A-mor3的构建与鉴定

图2 重组载体的菌落PCR验证
Fig. 2 Identification of recombinant plasmids by colony PCR

图3 表达载体pGAPZαA-mor3的酶切鉴定
Fig. 3 Identification of pGAPZ α A-mor3 by restriction enzyme digestion

分别回收EcoRⅠ与KpnⅠ双酶切的mor-3基因片段与空载体pGAPZα A,连接转化后,对抗性平板获得的单克隆以Alpha-F/AOX1-R为引物对进行菌落PCR验证,同时以空载体pGAPZα A转化的大肠杆菌为阴性对照(理论大小约为265 bp),阳性克隆大小约为400 bp,与理论预测大小(394 bp)基本一致(图2)。挑取阳性克隆进行质粒抽提,并进行EcoRⅠ单酶切及EcoRⅠ与KpnⅠ双酶切的验证,同时,以pGAPZα A质粒为阴性对照进行同样的酶切,电泳结果显示:阳性克隆双切出现大小分别为129 bp与3 100 bp的条带,单酶切出现约为3 200 bp单一条带,而pGAPZα A质粒单酶切和双酶切均只有一条带。结果说明,重组表达载体pGAPZα A-mor3构建成功(图3)。

2.3 重组菌酵母组成型表达及重组蛋白表达量的确定

图4 重组菌上清液的Tricine-SDS-PAGE分析
Fig. 4 Analysis of culture supernatant of recombinant P. pastoris by Tricine-SDS-PAGE

参考Tricine-SDS-PAGE说明书,重组菌的发酵上清液得到较好的分离,结果显示,在重组菌上清液中分子质量约为5.0 kD的蛋白获得表达,而且其与预测的抗菌肽蛋白分子质量(4.7 kD)基本一致,原始SMD1168菌株及线性化空载体pGAPZα A转化的SMD1168菌株在相应位置均无明显亮带。表明重组蛋白在毕赤酵母SMD1168成功获得表达(图4),以牛血清白蛋白质量浓度为横坐标,OD595nm为纵坐标绘制标准曲线,得标准曲线方程:y=0.020 4x+0.314 9(R2为0.996 7)。发酵60 h上清液样品,稀释20 倍,测得OD595nm为0.953,经光密度扫描仪扫描目的蛋白占总蛋白的比例为39.8%,计算得到重组moricin3蛋白的表达量为248.98 mg/L。

2.4 重组蛋白的抑菌活性分析及最低抑菌浓度测定

图5 重组菌上清液对E. coli CMCC44103(a)及S. aureus ATCC25923(b)的抑菌活性检测
Fig. 5 Antibacterial activity of culture supernatant of recombinant P. pastoris against E. coli (a) and S. aureus (b)

采用改良琼脂扩散法进行抑菌活性的检测,图5结果显示:重组菌表达的moricin3抗菌肽对革兰氏阴性菌——E. coli CMCC44103体现了非常好的抑菌活性,能够形成较大的、清晰明确的抑菌圈,发酵60 h,上清液抑菌圈直径最大,达到19.3 mm(图5a中5号孔);而对革兰氏阳性菌——S. aureus ATCC25923抑菌活性则较差,抑菌圈较小,而且抑菌圈边缘模糊,最大抑菌圈直径也为发酵60 h后的上清液,仅为5.3 mm(图5b中5号孔)。

采用管碟法测定重组菌上清液表达的抗菌肽moricin3对E. coli CMCC44103和S. aureus ATCC25923的MIC值。结果显示:抗菌肽moricin3对E. coli CMCC44103的MIC值为6.25 μg/mL,体现了较强的抑菌效果;抗菌肽moricin3对S. aureus ATCC25923的MIC值为124.49 μg/mL。

2.5 重组菌上清液中表达的抗菌肽moricin3对温度及酸碱的耐受特性分析

表1 高温及酸碱对重组菌发酵上清液抑菌活性的影响
Table 1 Effects of high temperature and acid-base on antibacterial activity of culture supernatant of recombinant strain

将重组菌表达上清液分别沸水浴和1 mol/L的HCl及NaOH溶液处理10、20、30 min,同时,以未处理的重组菌发酵上清液为阳性对照,采用改良的琼脂扩散法测定处理样品对E. coli CMCC44103的抑菌圈直径。结果显示:沸水浴处理对重组菌发酵上清液对E. coli CMCC44103的敏感性影响不大,抑菌圈直径无明显差别,表明重组菌上清液中表达的moricin3具有一定的耐高温性能,体现了较好的热稳定性。另外,1 mol/L HCl处理10、20、30 min对重组菌发酵上清液的抑菌活性基本没有影响,处理30 min,活性仍保持95%以上(表1),说明抗菌肽moricin3具有较好的耐酸能力,而且在酸性环境中较为稳定;不同的是,同样浓度的NaOH溶液处理10 min,moricin3的抑菌活性仍能保持近95%,达到94.8%,但当处理时间延长,其抑菌活性显著下降,处理20 min,抑菌圈直径减少2.6 mm,抑菌活性降低至86.5%,处理时间达到30 min,抑菌圈直径减少6.1 mm,抑菌活性大幅度降低,仅为未处理对照的68.4%(表1),说明重组菌上清液中的moricin3虽具备一定的耐受强碱性能,但在强碱性环境中的抑菌活性随处理时间呈明显下降趋势,说明在碱性环境中稳定性较差。

3 讨 论

一般生物体自然条件表达和分泌的抗菌肽的含量非常低,直接从体内获得天然抗菌肽的成本非常高昂,而且过程繁琐。化学合成的技术难度大,而且活性往往得不到保证。利用基因工程技术,采用细菌或酵母生产抗菌肽就体现了具大的优势,特别是酵母表达体系,其遗传背景清晰,便于利用基因工程手段对进行理性化的改造获得更具特性的抗菌肽产品,而且发酵条件简单,适合高密度发酵,非常适合工业化的生产、纯化或是制备含有独特抗菌机制抗菌肽的饲用酵母微生态制剂。moricin为强碱性抗菌肽,由42 个氨基酸组成,是一种双亲性α-螺旋结构的线性多肽,具有广谱的抗菌活性,最早由Hara和yamakawa于1995年在家蚕中发现[25],如今,moricin已经从其他多个鳞翅目昆虫中被发现[26-27]。在鳞翅目昆虫中,家蚕的天然免疫系统是研究最清楚的[28-30],在抗菌肽moricin方面也有比较多的报道,同样为鳞翅目昆虫,关于小菜蛾抗菌肽,特别是moricin抗菌肽的研究报道却比较少。

本研究在前期相关基因鉴定的基础上[27,31],从小菜蛾基因组中克隆到一个具有广谱抗菌活性的moricin家族抗菌肽moricin-3基因,其较从小菜蛾基因组中获得的此家族的另外两个抗菌肽moricin-1与moricin-2基因相比,其成熟肽基因有3 个氨基酸的突变,这些氨基酸差异直接导致了其在净电荷、等电点及疏水性等理化性质的不同,而这可能对其抗菌谱及抑菌性能都有影响。

抗菌肽分子作为一类多肽,宿主本身具备的蛋白酶对其表达量及稳定性都有较大影响[32-33],鉴于此,本研究采用蛋白酶缺陷型酵母SMD1168为宿主,以非诱导型分泌质粒pGAPZα A为载体,将moricin3成熟肽整合至宿主染色体中,并通过高质量浓度Zeocin(300 μg/mL)抗性筛选高拷贝重组菌,实现了目的基因的高效分泌表达,重组菌发酵上清液中表达量达248.98 mg/L。采用改良的琼脂扩散法,对重组菌发酵上清液进行了抑菌活性检测,对E. coli与S. aureus都有抑菌活性,实验室条件限制,未能进行更广泛的检菌测定,但其仍表现了较为广谱的抗菌潜力,特别是对于革兰氏阴性菌,其对E. coli的MIC值是对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌的近二十分之一。不仅如此,重组菌表达的小菜蛾抗菌肽moricin3具备非常好的热稳定性及酸性环境中的稳定性,这不仅对小菜蛾抗菌肽moricin3后续的动物实验、抗菌机理及小菜蛾自身免疫机制等研究具有重要意义,也使得其非常具有开发成为一类主抗革兰氏阴性菌抗菌药物或酵母制剂的潜力。特别在开发抗菌肽酵母制剂方面,较好的热稳定性使得其能耐受饲料制粒时的高温,而且在规模化生产、高温浓缩的时候保持抗菌肽活性而不造成工程菌的扩散导致环境生态问题;本身具备的独特抑菌及选择性杀伤机制,病原菌不易甚至不可能产生耐药性;良好的酸性环境中的稳定性,使其具备更好的机体内环境的适应性。moricin3抗菌肽具备的高效、独特的分子特性、绿色安全、不易产生耐药性的特点使得其可成为抗生素的替代物之一,从而能够减少抗生素和化学药物的使用及残留,减少对自然生态的危害,为人们提供健康食品的同时促进可持续发展,具备良好的社会效益及环境效益。

4 结 论

本研究利用组成型分泌表达策略在蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1168中成功表达了小菜蛾特异性抗菌肽moricin,利用抗性梯度筛选方法获得高拷贝的重组菌,并实现了外源抗菌肽基因在毕赤酵母宿主中的高效表达,同时,对表达的抗菌肽的抑菌活性及耐酸碱和热稳定性进行相关研究,得到如下结论:1)以载体pGAPZα A为基础,通过PCR、酶切、连接等技术手段,成功构建含有小菜蛾特异性抗菌肽成熟肽基因mor-3的组成型表达载体pGAPZα A-mor3;2)以蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1168为宿主,成功将mor-3基因整合至宿主染色体上,结合高质量浓度的Zeocin(300 μg/mL)获得mor-3基因多拷贝整合的工程菌株,并实现高效分泌表达,摇瓶发酵上清液抗菌肽moricin3表达量达248.98 mg/L;3)抑菌活性实验表明,重组菌表达上清液中的抗菌肽moricin3可能对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌都有抑菌活性,其中对E. coli CMCC44103和S. aureus ATCC25923的MIC分别达到6.25 μg/mL和124.49 μg/mL,显示了对革兰氏阴性菌有特异性较强的抑菌活性的潜力;4)重组菌上清液中表达的抗菌肽moricin3具有较好的热稳定性,沸水浴30 min,抑菌活性保持99%,体现了较好的耐高温性能;5)重组菌上清液中表达的抗菌肽moricin3具备较好的耐酸碱性能,而且在酸性环境中较为稳定,1 mol/L的HCl溶液处理30 min,活性仍保持95%以上;但在碱性环境中稳定性较差,在强碱性环境中的抑菌活性随处理时间呈明显下降趋势,1 mol/L的NaOH溶液处理30 min,抑菌活性仅为对照的68.4%,良好的酸性环境中的稳定性,使其具备更好的机体内环境适应性潜力。

参考文献:

[1] ZASLOFF M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms[J]. Nature, 2002, 415(6870): 389-395. DOI:10.1038/415389a.

[2] GANZ T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity[J]. Nature Reviews Immunology, 2003, 3(9): 710-720. DOI:10.1038/nri1180.

[3] KISS G, MICHL H. Uber das Giftsekret der Gelbbauchunke, Bombina variegata L.[J]. Toxicon, 1962, 1(1): 33-34. DOI:10.1016/0041-0101(62)90006-5.

[4] LAMBERTY M, ZACHARY D, LANOT R, et al. Insect immunity. Constitutive expression of a cysteine-rich antifungal and a linear antibacterial peptide in a termite insect[J]. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(6): 4085-4092. DOI:10.1074/jbc.M002998200.

[5] BULET P, STÖCKLIN R, MENIN L. Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates[J]. Immunological Reviews, 2004, 198(1): 169-184. DOI:10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x.

[6] BOULANGER N, BULET P, LOWENBERGER C. Antimicrobial peptides in the interactions between insects and flagellate parasites[J]. Trends in Parasitology, 2006, 22(6): 262-268. DOI:10.1016/ j.pt.2006.04.003.

[7] AVITABILE C, CAPPARELLI R, RIGANO M M, et al. Antimicrobial peptides from plants: stabilization of the γ core of a tomato defensin by intramolecular disulfide bond[J]. Journal of Peptide Science, 2013, 19(4): 240-245. DOI:10.1002/psc.2479.

[8] PAIVA A D, BREUKINK E. Antimicrobial peptides produced by microorganisms[M]. Basel: Springer, 2012. DOI:10.1007/978-3-0348-0541-4_3.

[9] FJELL C D, HISS J A, HANCOCK R E, et al. Designing antimicrobial peptides: form follows function[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2012, 11(1): 37-51. DOI:10.1038/nrd3653.

[10] HOSKIN D W, RAMAMOORTHY A. Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2008, 1778(2): 357-375. DOI:10.1016/j.bbamem.2007.11.008.

[11] HWANG P M, VOGEL H J. Structure-function relationships of antimicrobial peptides[J]. Biochemistry and Cell Biology, 1998, 76(2/3): 235-246. DOI:10.1139/o98-026.

[12] SITARAM N, NAGARAJ R. Interaction of antimicrobial peptides with biological and model membranes: structural and charge requirements for activity[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1999, 1462(1/2): 29-54. DOI:10.1016/S0005-2736(99)00199-6.

[13] YEAMAN M R, YOUNT N Y. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance[J]. Pharmacological Reviews, 2003, 55(1): 27-55. DOI:10.1124/pr.55.1.2.

[14] KOCZULLA A R, BALS R. Antimicrobial peptides: current status and therapeutic potential[J]. Drugs, 2003, 63(4): 389-406. DOI:10.2165/00003495-200363040-00005.

[15] LI Y, XIANG Q, ZHANG Q, et al. Overview on the recent study of antimicrobial peptides: origins, functions, relative mechanisms and application[J]. Peptides, 2012, 37(2): 207-215. DOI:10.1016/ j.peptides.2012.07.001.

[16] HASSAN M, KJOS M, NES I F, et al. Natural antimicrobial peptides from bacteria: characteristics and potential applications to fight against antibiotic resistance[J]. Journal of Applied Microbiology, 2012, 113(4): 723-736. DOI:10.1111/j.1365-2672.2012.05338.x.

[17] MARCOS J F, MUÑOZ A, PÉREZ-PAYÁ E, et al. Identification and rational design of novel antimicrobial peptides for plant protection[J]. Annual Review of Phytopathology, 2008, 46: 273-301. DOI:10.1146/ annurev.phyto.121307.094843.

[18] JUNG D, POWERS J P, STRAUS S K, et al. Lipid-specific binding of the calcium-dependent antibiotic daptomycin leads to changes in lipid polymorphism of model membranes[J]. Chemistry and Physics of Lipids, 2008, 154(2): 120-128. DOI:10.1016/ j.chemphyslip.2008.04.004.

[19] PARACHIN N S, MULDER K C, VIANA A A, et al. Expression systems for heterologous production of antimicrobial peptides[J]. Peptides, 2012, 38(2): 446-456. DOI:10.1016/j.peptides.2012.09.020.

[20] CHUMNANPUEN P, KOCHARIN K, VONGSANGNAK W. Yeast expression systems for industrial biotechnology[M]. Switzerland: Springer International Publishing, 2016. DOI:10.1007/978-3-319-27951-0_9.

[21] MACAULEY-PATRICK S, FAZENDA M L, MCNEIL B, et al. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system[J]. Yeast, 2005, 22(4): 249-270. DOI:10.1002/yea.1208.

[22] LI L, WANG J X, ZHAO X F, et al. High level expression, purification, and characterization of the shrimp antimicrobial peptide, Ch-penaeidin, in Pichia pastoris[J]. Protein Expression and Purification, 2005, 39(2): 144-151. DOI:10.1016/j.pep.2004.09.006.

[23] 张国只, 陈林海, 杨天佑, 等. 琼脂扩散法测定乳链菌肽效价的优化[J]. 食品科学, 2007, 28(3): 175-178. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2007.03.040.

[24] 伊守亮, 肖林, 顾正华, 等. 管碟法测定Nisin效价[J]. 无锡轻工大学学报, 2004, 23(4): 41-45. DOI:10.3321/j.issn:1673-1689.2004.04.011.

[25] HARA S, YAMAKAWA M. Moricin, a novel type of antibacterial peptide isolated from the silkworm, Bombyx mori[J]. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(50): 29923-29927. DOI:10.1074/ jbc.270.50.29923.

[26] OIZUMI Y, HEMMI H, MINAMI M, et al. Isolation, gene expression and solution structure of a novel moricin analogue, antibacterial peptide from a lepidopteran insect, Spodoptera litura[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2005, 1752(1): 83-92. DOI:10.1016/ j.bbapap.2005.07.013.

[27] XIA X, YU L, XUE M, et al. Genome-wide characterization and expression profiling of immune genes in the diamondback moth, Plutella xylostella (L.)[J]. Scientific Reports, 2015, 5: 9877. DOI:10.1038/srep09877.

[28] CHENG T C, ZHAO P, LIU C, et al. Structures, regulatory regions, and inductive expression patterns of antimicrobial peptide genes in the silkworm, Bombyx mori[J]. Genomics, 2006, 87(3): 356-365. DOI:10.1016/j.ygeno.2005.11.018.

[29] TANAKA H, YAMAKAWA M. Regulation of the innate immune responses in the silkworm, Bombyx mori[J]. Invertebrate Survival Journal, 2011, 8(1): 59-69.

[30] WAN J, ZHOU X, ZHOU X. A review of innate immunity of silkworm, Bombyx mori[J]. African Journal of Agricultural Research, 2013, 8(20): 2319-2325. DOI:10.5897/AJARx11.079

[31] YOU M, YUE Z, HE W, et al. A heterozygous moth genome provides insights into herbivory and detoxification[J]. Nature Genetics, 2013, 45(2): 220-225. DOI:10.1038/ng.2524.

[32] CARMONA G, RODRIGUEZ A, JUAREZ D, et al. Improved protease stability of the antimicrobial peptide Pin2 substituted with D-amino acids[J]. Protein Journal, 2013, 32(6): 456-466. DOI:10.1007/ s10930-013-9505-2.

[33] MONCLA B J, PRYKE K, ROHAN L C, et al. Degradation of naturally occurring and engineered antimicrobial peptides by proteases[J]. Advances in Bioscience and Biotechnology, 2011, 2(6): 404-408. DOI:10.4236/abb.2011.26059.

High-Level Expression and Antibacterial Properties of Antimicrobial Peptide Moricin in Pichia pastoris

HUANG Qingeng, LIANG Ling, CHEN Qiaohong, WU Songgang, HUANG Jianzhong*
(Engineering Research Center of Industrial Microbiology, Ministry of Education, College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China)

Abstract:The excessive use of antibiotics has brought about many adverse effects to natural ecology. Finding suitable alternatives to antibiotics to reduce the use of antibiotics is becoming a research hotspot. The aim of this study was to highly express the antimicrobial peptide moricin derived from the diamondback moth Plutella xylostella in Pichia pastoris, and study its antibacterial properties and biochemical properties. The mature peptide gene mor-3 of moricin from Plutella xylostella (L.) was amplified by PCR, and then cloned into the pGAPZα A vector, and an expression plasmid of pGAPZα A-mor3 was constructed. The linearized plasmid pGAPZα A-mor3 was transformed into P. pastoris SMD1168 by electroporation, and the high copy recombinant transformants were screened out by using high concentration of Zeocin. The molecular mass of the recombinant protein expressed in P. pastoris SMD1168 was approximately 5 kD, corresponding to the theoretical molecular mass of this target peptide. Up to 248.98 mg/L recombinant protein in the supernatant after 60 h fermentation was obtained. The recombinant protein in the supernatant showed obvious antibacterial activity against several microorganisms detected by an improved agar diffusion method, including Escherichia coli and Staphylococcus aureus. The minimum inhibitory concentration (MIC) against E. coli CMCC44103 was 6.25 μg/mL, while that against S. aureus ATCC25923 was only 124.49 μg/mL. It showed potent antibacterial activity against both Gram-positive and Gramnegative bacteria, especially Gram-negative bacteria. In addition, the recombinant protein also had good thermal stability, and strong resistance to acid and alkali. In particular, the antimicrobial activity was maintained in an acidic environment, and so it had good adaptability to the animal intestinal environment. Due to these unique antibacterial properties and biochemical characteristics it has a broad development and application prospect with good social and environmental benefits.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716006

中图分类号:Q812

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)16-0036-07

收稿日期:2016-10-20

基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2015AA021005)

作者简介:黄钦耿(1984—),男,高级工程师,博士研究生,研究方向为微生物生化及食品微生物工程。E-mail:quenyhuang@163.com *通信作者:黄建忠(1966—),男,教授,博士,研究方向为微生物工程及其工程化。E-mail:hjz@fjnu.edu.cn

引文格式:

黄钦耿, 梁玲, 陈巧红, 等. 小菜蛾moricin在毕赤酵母中的表达及抑菌活性分析[J]. 食品科学, 2017, 38(16): 36-42. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716006. http://www.spkx.net.cn

HUANG Qingeng, LIANG Ling, CHEN Qiaohong, et al. High-level expression and antibacterial properties of antimicrobial peptide moricin in Pichia pastoris[J]. Food Science, 2017, 38(16): 36-42. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201716006. http://www.spkx.net.cn

Key words: antimicrobial peptides; moricin; Pichia pastoris; efficient expression; antimicrobial activity; biochemical characteristics