牡蛎酶解液美拉德反应体系优化及产物营养评价

刘海梅，安孝宇，陈静，王静，赵芹，郭青君，车欣欣，崔云

摘要：以牡蛎酶解液为氨基来源，与葡萄糖发生美拉德反应，以感官评分和褐变程度为指标，优化美拉德反应的工艺条件，并通过氨基酸评分、化学评分、必需氨基酸指数（essential animo acids index，EAAI）评价美拉德反应产物的营养品质。结果表明，葡萄糖美拉德反应的最佳工艺参数为葡萄糖添加量8%、反应温度110 ℃、pH 7.5、反应时间90 min；美拉德反应产物中18 种氨基酸齐全，必需氨基酸含量占总氨基酸含量的32.99%，EAAI为71.568，营养品质较高。鲜味氨基酸含量丰富，Glu含量最高。

美拉德反应是指羰基化合物（如还原糖、醛、酮）的羰基和氨基化合物（如氨基酸、肽、蛋白质）的氨基之间发生的复杂反应，美拉德反应产物种类繁多，对食品的风味、色泽、抗氧化性等品质有着至关重要的影响[1-6]。美拉德反应已广泛应用于肉味、海鲜调味料的制备[7-8]，如利用猪骨酶解液、鸡骨泥酶解液、鳕鱼皮蛋白与氨基酸制备肉味调料[9-12]；利用文蛤、虾头等海鲜酶解产物与还原糖组成美拉德反应体系，制备风味浓郁的海鲜调味料[13-15]。关于美拉德反应产物抗氧化性的研究也越来越受到关注。卢彬等[16]发现，温度对金带细鲹鱼肉美拉德反应产物的抗氧化性具有重要影响，120 ℃条件下获得的美拉德反应产物还原力和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率较100 ℃的大幅度提高，而羟基自由基清除率和Fe2+螯合能力明显下降。张陆霞等[17]也采用美拉德反应制备了鳕鱼排水解蛋白美拉德反应产物，产物具有较强的抗氧化能力。肖军霞等[18]采用木瓜蛋白酶水解牡蛎得到酶解液，与葡萄糖反应生成美拉德反应产物，该产物还原能力强。这些研究都是基于食品酶解后产生的游离氨基酸和小肽作为美拉德反应氨基来源。美拉德反应除了受温度、时间、pH值、还原糖种类影响外，反应体系中肽、游离氨基酸含量与种类是影响美拉德反应的重要因素，底物肽、氨基酸的产生与所使用的蛋白酶密切相关，不同的蛋白酶其酶解效力不同，生成的酶解产物也存在差异。因此，研究不同蛋白酶的酶解产物对美拉德反应产物的色泽、风味、抗氧化性等品质的影响具有重要的意义。

本实验通过复合蛋白酶水解牡蛎获得牡蛎酶解液，以牡蛎酶解液为研究对象，与葡萄糖组成美拉德反应体系，通过感官评定和褐变程度筛选美拉德反应的适宜工艺参数，并对美拉德反应产物进行营养品质评价，为后续美拉德反应产物抗氧化、降血压等生理功能研究提供理论基础。

1 材料与方法

太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）市购；复合蛋白酶Protamex（1.5 AU/g）诺维信忆诺联创生物科技（北京）有限公司；所用试剂均为分析纯。

721G可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司；DF-2集热式恒温磁力搅拌器（油浴锅）金坛市白塔金昌实验仪器厂；TDL-5-A离心机上海安亭科学仪器厂。

将复合蛋白酶按30 AU/kg的加酶量加入牡蛎肉匀浆（牡蛎肉与水质量比1∶5）中，自然pH值、50 ℃恒温酶解4 h，置于100 ℃沸水中灭酶15 min，酶解产物于5 000 r/min离心15 min，所得上清液即为牡蛎酶解液。

感官评定小组由10 人（5 男5 女）组成，对美拉德反应产物进行描述性感官鉴评，描述统计其色泽和风味[19-20]，评价标准见表1、2。

表1 美拉德反应产物风味评分标准
Table 1 Criteria for flavor evaluation of Maillard reaction products (MRPs)

表2 美拉德反应产物色泽评分标准
Table 2 Criteria for color evaluation of MRPs

依据单因素试验结果，设计正交试验L9（34），对美拉德反应条件进行优化，如表3所示。

表3 美拉德反应正交试验因素与水平
Table 3 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in orthogonal array design

样品用6 mol/L盐酸溶液在110 ℃水解24 h，调制上机浓度，用氨基酸自动分析仪测定除色氨酸外的17 种氨基酸[21]，色氨酸采用可见分光光度法[22]测定。

根据联合国粮食与农业组织（Food and Agriculture Organization，FAO）/世界卫生组织（World Health Organization，WHO）1973年建议的氨基酸评分（animo acids score，AAS）标准模式[23]和全鸡蛋蛋白质的氨基酸模式[24]分别按公式（1）～（3）计算化学评分（chemical score，CS）、AAS和必需氨基酸指数（essential animo acids index，EAAI）[25]。

式中：aa为样品每克蛋白质中氨基酸含量/%；AA为FAO/WHO评分模式中同种氨基酸含量/%；n为比较的氨基酸个数；a、b、c、…、j为酶解液中的必需氨基酸含量/（mg/g）；ae、be、ce、…、je为全鸡蛋蛋白质的必需氨基酸含量/（mg/g）。

2 结果与分析

于牡蛎酶解液中依次加入不同质量分数的葡萄糖（2%、4%、6%、8%、10%），自然pH值、100 ℃加热60 min，冷却后于5 000 r/min离心15 min，取上清液，于波长420 nm处测定吸光度，品评其感官特性，如图1所示。还原糖（葡萄糖）添加量的增加提高了美拉德反应速度，美拉德反应产物生成量增加，褐变程度增加[26]，增强了MPRs的整体风味，但同时葡萄糖添加量过大也会使反应液产生焦糖味，掩盖了其他风味，而使整体的风味受到一定的影响。当葡萄糖添加量达到8%时，美拉德反应产物具有浓郁的糖香味，鲜味较浓，整体风味良好，且褐变程度增加趋势趋于平缓，褐变程度达到最大。因此，葡萄糖添加量为8%是参与牡蛎酶解液美拉德反应的适宜添加量。

图1 不同葡萄糖添加量条件下美拉德反应产物褐变程度、感官评分和感官评分雷达图
Fig. 1 Browning degree and sensory evaluation and sensory evaluation radar graph of MRPs obtained at different glucose concentrations

在一定的反应时间内，反应温度每升高10 ℃，美拉德反应速率提高3～5 倍[27]。反应温度的高低会促使美拉德反应沿着不同的反应途径进行，从而形成不同风味的产物[28]。研究表明，在80～120 ℃的反应温度范围内，褐变速率会随着反应温度的上升而增大，而超过120 ℃后，褐变速率下降[29]。调整牡蛎酶解液中葡萄糖添加量为8%，pH 7.0，分别在80、90、100、110、120 ℃条件下加热60 min，冷却后5 000 r/min离心15 min，取上清液，于波长420 nm处测定吸光度，品评其感官特性，如图2所示。反应温度低于100 ℃时，美拉德反应液的褐变程度较低，糖香味不足，鲜味较淡，且有明显的腥味和苦味，不易被接受；反应温度高于100 ℃时，美拉德反应液的褐变程度增强，褐变速率线性增加，且整体风味增强，感官评分增加，但当反应温度达到120 ℃时，出现焦糖味影响整体风味。因此，适宜的反应温度选择110 ℃。

图2 不同反应温度条件下美拉德反应产物褐变程度、感官评分和感官评分雷达图
Fig. 2 Browning degree, sensory evaluation and sensory evaluation radar graph of MRPs obtained at different temperatures

图3 不同pH值条件下美拉德反应产物褐变程度、感官评分和感官评分雷达图
Fig. 3 Browning degree and sensory evaluation and sensory evaluation radar graph of MRPs obtained at different pH values

pH值影响美拉德反应中某些途径的反应速率，从而改变风味物质形成的平衡。当pH值在3～10之间时，美拉德反应会随着pH值的升高而呈上升趋势[27]，色泽也会相对加深。在酸性条件下，美拉德初始反应产物N-葡萄糖胺易水解，而其是美拉德反应特征风味形成的前体物质[27]，因此，酸性条件下反应速率低。偏碱性的环境有利于美拉德反应的进行，且碱性越高，反应越强烈，速度越快[30-31]。调整牡蛎酶解液中葡萄糖添加量为8%、反应温度为110 ℃，并调节反应液pH值分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，冷却后于5 000 r/min离心15 min，取上清液，于波长420 nm处测定吸光度，品评其感官特性，如图3所示。随着pH值的升高，美拉德反应速率不断增大，且在pH 7.5时色泽和感官评分基本达到最大值，继续升高初始反应pH值，焦糖香气越来越明显，鲜味减弱，苦味增强，影响整体美拉德反应产物的风味。由此可见，pH值为7.5是适宜的反应pH值。

图4 不同反应时间条件下美拉德反应产物褐变程度、感官评分和感官评分雷达图
Fig. 4 Browning degree and sensory evaluation and sensory evaluation radar graph of MRPs obtained at different reaction times

调整牡蛎酶解液中葡萄糖添加量为8%，在pH 7.5、反应温度100 ℃条件下分别加热反应30、60、90、120 min和150 min，冷却后5 000 r/min离心15 min，取上清液，于波长420 nm处测定吸光度，并评价感官特性，如图4所示。随着反应时间的延长，反应液中的氨基酸和还原糖不断发生反应，形成大量类黑精色素和含氮杂环化合物[16]。反应初期，美拉德反应的褐变程度随反应时间的延长而增强，当反应时间达到120 min后，褐变程度基本趋于平缓。而反应时间达到90 min时，感官评分基本达到最高，继续反应，美拉德反应产物风味降低。因此，适宜的反应时间为90 min。

表4 美拉德反应正交试验设计与结果
Table 4 Orthogonal array design with experimental results

采用正交试验L9（34），对美拉德反应条件进行优化，正交结果如表4所示。用极差法分析各因素对美拉德反应的影响。对吸光度而言，各因素对美拉德反应影响的大小顺序为葡萄糖添加量＞反应温度＞反应时间＞pH值。对感官评分而言，各因素对美拉德反应影响的大小顺序为反应温度＞葡萄糖添加量＞反应时间＞pH值。根据正交试验结果，综合4 种因素对美拉德反应产物的色泽与风味的影响，得出最佳工艺条件为葡萄糖添加量8%、反应温度110 ℃、pH 7.5、反应时间90 min。在此优化条件下，得到的美拉德反应产物感官评分为4.67，吸光度为0.798，感官评分高于正交试验所有组别，证明优化结果优于各正交试验组，所得产物腥味降低、口感醇厚、柔和，色泽为浅褐色。

表5 氨基酸组成
Table 5 Amino acid composition of MRPs

由表5可知，美拉德反应产物中存在18 种氨基酸，氨基酸种类齐全，其中必需氨基酸8 种（Lys、Trp、Phe、Met、Thr、Ile、Leu、Val）、半必需氨基酸2 种（Cys、Tyr）、非必需氨基酸8 种（Asp、Gly、Ala、Ser、Glu、Pro、Arg、His）。总氨基酸含量为873.956 mg/100 mL，其中必需氨基酸总量为289.322 mg/100 mL，占总氨基酸含量的32.99%；鲜味氨基酸含量最为丰富，总含量为365.119 mg/100 mL，5 种鲜味氨基酸（Asp、Glu、Gly、Ala、Arg）齐全，其中Glu含量最高，含量为126.317 mg/100 mL。

表6 美拉德反应产物中必需氨基酸的营养评价
Table 6 Nutritional evaluation of essential amino acids in MRPs

由表6可知，当以AAS为标准时，Trp评分最高，为标准的1.98 倍，其次为Tyr+Phe，为标准的1.25 倍，其余氨基酸的评分在60～89之间；当以CS为标准时，Trp评分最高，为标准的1.16 倍，其余氨基酸的评分在56～87之间。2 种评分标准下，第1、2限制性氨基酸相同，分别为Val和Leu。EAAI是评价蛋白质营养价值的常用指标之一，反映的是必需氨基酸与标准蛋白相接近的程度[14]。水解液EAAI为71.568，表明必需氨基酸含量丰富，营养价值较高。

3 结论

以牡蛎酶解液为氨基来源，与葡萄糖发生美拉德反应，优化得到美拉德反应条件为葡萄糖添加量8%、反应温度110 ℃、pH 7.5、反应时间90 min。美拉德反应产物的口感醇厚、柔和，色泽为浅褐色，腥味不明显。美拉德反应产物中18 种氨基酸齐全，必需氨基酸占总氨基酸含量的32.99%，鲜味氨基酸含量丰富，Glu含量最高，主要限制性氨基酸为Val和Leu，其EAAI为71.568，营养品质较高。

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Optimization of the Maillard Reaction Conditions of Enzymatic Hydrolysate of Oyster and Nutritional Evaluation of Maillard Reaction Products

LIU Haimei, AN Xiaoyu, CHEN Jing, WANG Jing, ZHAO Qin, GUO Qingjun, CHE Xinxin, CUI Yun
(School of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China)

Abstract：Oyster enzymatic hydrolysate and glucose were used to establish a Maillard reaction system. The reaction conditions were optimized based on sensory evaluation and browning degree, and the nutritional quality of Maillard reaction products was evaluated by amino acid score (AAS), chemical score (CS), and essential animo acids index (EAAI). The optimal reaction parameters were determined as follows: glucose concentration, 8%; temperature, 110 ℃; pH value, 7.5; and reaction time, 90 min. In the Maillard reaction products, 18 amino acids were detected with essential amino acids (EAAs) accounting for 32.99% of the total amino acids. EAA index (EAAI) was 71.568 indicating high nutritional quality. Umami amino acids, especially glutamic acid, were abundant.

Key words：oyster enzymatic hydrolyzate; Maillard reaction; glucose; nutritional evaluation

刘海梅, 安孝宇, 陈静, 等. 牡蛎酶解液美拉德反应体系优化及产物营养评价[J]. 食品科学, 2017, 38(16): 178-182. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716028. http://www.spkx.net.cn

LIU Haimei, AN Xiaoyu, CHEN Jing, et al. Optimization of the Maillard reaction conditions of enzymatic hydrolysate of oyster and nutritional evaluation of Maillard reaction products[J]. Food Science, 2017, 38(16): 178-182. (in Chinese with English abstract)

基金项目：山东省自然科学基金项目（ZR2014BP016；ZR2015PC002）；山东省科技发展计划项目（2012YD07013）

作者简介：刘海梅（1979—），女，教授，博士，主要从事水产品加工与综合利用研究。E-mail：hellen_79@aliyun.com

牡蛎酶解液美拉德反应体系优化及产物营养评价

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论