电化学分析法快速测定烧烤类食品中的苯并(a)芘

冯亚净,张志业,李书国*

(河北科技大学生物科学与工程学院,河北 石家庄 050018)

摘 要:基于苯并(a)芘(benzo(a)pyrene,BaP)的电化学氧化还原特征,建立一种快速测定烧烤类食品中BaP含量的电化学分析方法,优化测定条件为乙腈-水(1∶3,V/V)作为溶剂、电解质LiClO4浓度0.15 mol/L、硫酸浓度0.1 mol/L、富集时间10 min,在此条件下,BaP的氧化峰电流随其浓度的增大而增大,而且浓度在0~100 nmol/L范围内呈线性关系,检测限为0.187 nmol/L(RSN=3)。该方法的稳定性和重复性较好,检测时间短,利用该法对烤羊肉串样品中的BaP进行检测,回收率为96.67%~101.56%,检测结果与高效液相色谱法基本一致,可用于烧烤类食品中BaP的快速检测。

关键词:苯并(a)芘;电化学分析方法;食品安全;烧烤类食品

苯并(a)芘(benzo(a)pyrene,BaP)是多环芳烃类中致癌性最强的一种物质[1-3],由5 个苯环构成,不溶于水,能溶于二甲基亚砜、乙腈等有机溶剂,碱性条件下稳定,而遇酸则不稳定[4-5],普遍存在于环境与食品中,可通过皮肤、呼吸、饮食等多种途径进入人体[6-8]。BaP是世界卫生组织确定的三大致癌物质之一,对此,各国对熏烤肉及其制品中BaP含量进行了严格的控制,其中,我国与欧盟国家的限量标准一致,均为5 μg/kg。因此,建立一种简便、快速、准确的BaP检测方法成为研究的重点。

目前,检测BaP的方法主要有荧光分析法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法及酶联免疫吸附法[9-22]等。上述方法虽被广泛应用,但均有其不足之处,荧光分析法的背景干扰和光谱重叠等问题严重;高效液相色谱法和气相色谱-质谱联用法存在仪器昂贵、操作繁琐以及检测时间长等问题;酶联免疫吸附法虽克服了上述问题,但其灵敏度不够。而电化学方法以其操作简便、低成本、速度快、灵敏度高等特点,受到了广大研究人员的青睐,同时也是食品安全快速检测技术方法的主要发展方向之一。

本实验基于BaP的电化学氧化还原性质,采用循环伏安法、线性扫描伏安法研究了其在裸玻碳电极表面的电化学性质,构建了一种烧烤类食品中痕量苯并芘的快速检测方法,并将其应用在实际食品样品中苯并芘的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

烤羊肉串购自石家庄市某烧烤摊。

BaP(纯度96%,CAS:50-32-8)、高氯酸锂 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙腈(分析纯) 天津市大茂化学试剂厂;丙酮(分析纯) 天津市津东天正精细化学试剂厂;二甲基亚砜(分析纯) 上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

LK98BⅡ型微机电化学分析系统 天津兰力科化学电子高技术有限公司;三电极系统、电解杯 上海CHI仪器公司;LC-10A型高效液相色谱仪 日本岛津公司;FA 2204型电子分析天平 上海菁海仪器有限公司;KQ2200型超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司;RE52CS-1型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;GZX-9070 MBE型电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;SZF-06A型快速提取仪 上海新嘉电子有限公司;85-2控温磁力搅拌器 金坛市恒丰仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 电极预处理

先将玻碳电极(glassy carbon electrode,GCE)用Al2O3粉末(粒径0.05 μm)打磨抛光,至电极表面成镜面,再依次于50%硝酸溶液、无水乙醇和去离子水中各超声处理3 min,然后在1 mol/L H2SO4溶液中采用快速循环伏安法(电位:-0.5~0.8 V;扫描速率:500 mV/s)扫描至稳定的循环伏安图,从而对GCE进行活化,最后用N2吹干,备用。

1.3.2 电化学分析系统及测定

电化学分析法的测定均采用三电极系统:Φ3 mm玻碳圆盘电极为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝电极为辅助电极,并采用线性扫描伏安法进行测定,测定条件如下:电位0.5~1.5 V,扫描速率50 mV/s。

电化学检测包含两部分:第1部分是BaP在电极表面的富集,将GCE在开路状态下浸没在含有BaP的乙腈-水溶液中,并用磁力搅拌器不断搅拌;第2部分是BaP的测定,将富集了BaP的GCE转移到乙腈-水的空白溶液(乙腈-水(1∶3,V/V),0.15 mol/L的LiClO4作为电解质,0.1 mol/L的H2SO4调节pH值)中,采用线性扫描伏安法进行测定,测定3 次,并记录相应的峰电流值,并取其平均值作为该BaP浓度所对应的氧化电流值Ip

1.3.3 烧烤类食品样品中BaP的测定

1.3.3.1 样品预处理

准确称取10 g绞碎的烤羊肉串,然后加入30 mL乙腈-水(9∶1,V/V)溶液,超声处理30 min后100 ℃提取1 h,过滤后将滤液冷藏,接着快速将沉淀除去。采用旋转蒸发仪将溶剂蒸发至10 mL,溶液经0.45 μm滤膜过滤后进行检测[23-24]

1.3.3.2 电化学分析法测定

按照1.3.2节的方法进行测定,记录其电化学响应电流,将3 次测定结果的平均值带入标准曲线中得到样品中BaP含量。

1.3.3.3 高效液相色谱法测定

色谱条件[25-26]:C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相乙腈-水(90∶10,V/V);流速1.0 mL/min;柱温35 ℃;进样量20 μL;激发波长384 nm,发射波长406 nm。

准确称取25 mg BaP标准品于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,保存于4 ℃条件下备用。依据需求将溶剂配成相应浓度梯度的标准溶液,取20 μL标准溶液进样,记录其高效液相色谱图谱,根据所得峰面积与对应的BaP浓度绘制标准曲线。分别取上述处理好的样品提取液20 μL,进行高效液相色谱检测,每个样品测定3 次,取3 次测定平均值作为该样品的图谱峰面积,依据上述标准曲线计算样品中BaP浓度,并与电化学检测方法的结果进行对比。

1.4 数据处理与统计分析

以上测定均为3 组平行实验,取平均值。运用SPASS 18.0软件进行数据统计分析,采用单因素方差分析进行显著性差异分析(P<0.05),实验数据图利用OriginLab Origin Pro v9.0软件绘制。

2 结果与分析

2.1 BaP在电极表面的电化学性质

采用快速循环伏安法,在含有LiClO4电解质的空白溶液中进行测定,探究了BaP在电极表面的电化学性质,结果如图1所示。在无酸无BaP的情况下是没有峰电流出现的;对BaP进行了富集后,在无酸的条件下出现了一个微小较缓的峰电流,随后在底液中添加0.05 mol/L的硫酸,发现峰电流显著增大变陡,电位明显向左移动,电流增大了约16%,电位减小了40 mV之多,这是由于硫酸为溶液提供了氢离子,使BaP更易于在电极表面发生氧化还原反应。图1中a与c、b与d相比较,可发现当BaP质量浓度增加时,响应电流的值也增加,说明峰电流是随着BaP质量浓度的增大而增大的。另外,由图1可知,BaP在电极表面只发生了氧化反应而没有发生还原反应,说明该反应是不可逆的。

图1 BaP在玻碳电极表面上的循环伏安曲线
Fig. 1 Cyclic voltammetry curve of BaP on the surface of glassy carbon electrode

2.2 测定条件的优化

2.2.1 溶剂的选择

图2 溶剂对BaP在电极表面上的线性扫描曲线的影响
Fig. 2 Effect of different solvents on the linear sweep curve of BaP on electrode surface

选择的溶剂应符合以下标准:BaP的溶解度要好;电极较大,有利于电子传递;能溶解电解质LiClO4。BaP在水溶液中更易发生氧化反应,并且蒸馏水可以降低BaP的氧化电位,而有机溶剂可以提高BaP的溶解度,所以有机溶剂-水溶液克服了纯蒸馏水和纯有机溶液所存在的问题[27]。BaP溶于多种有机溶剂,比如乙腈、正己烷、二甲基亚砜、苯、乙醚、丙酮等[28-29],由于正己烷、苯、乙醚等不溶于蒸馏水,所以探讨乙腈、二甲基亚砜以及丙酮的水溶液作为溶剂时响应电流的变化。有机溶剂与水的比例均为1∶1(V/V),其他条件均一致,采用线性扫描伏安法进行测定,结果如图2所示。乙腈作为有机溶剂时的电位与丙酮一致,但乙腈的峰电流明显高于丙酮;虽然二甲基亚砜作为有机溶剂的电位比乙腈要小,但乙腈的峰电流显著高于二甲基亚砜,这可能是由于二甲亚砜的电极比乙腈高影响了电子传递的结果。综合考虑,选取乙腈-水溶液作为溶剂。

2.2.2 溶剂配比的影响在其他条件均一致的情况下,改变溶剂中乙腈和水的配比,观察BaP氧化响应电流的变化。如图3所示,随着水的比例越来越大,峰电流Ip越来越大,直到乙腈-水(1∶3,V/V)时,峰电流Ip达到最大。然后随着蒸馏水比例的增大,峰电流Ip越来越小,可能是由于蒸馏水的添加,降低了BaP在混合溶剂中的溶解度,从而影响BaP在电极表面的富集,所以选择乙腈与蒸馏水的配比为1∶3。也可以观察到随着蒸馏水比例的增加,氧化峰电位有轻微向左移动的现象。

2.2.3 电解质浓度的影响

图4 电解质浓度对BaP在电极表面上的线性扫描曲线的影响
Fig. 4 Effect of electrolyte concentration on the linear sweep curve of BaP on electrode surface

按照LiClO4浓度为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mol/L配制底液,其他条件均一致,待进行电化学测定时使用。如图4所示,初始阶段峰电流显著增加,当LiClO4浓度为0.15 mol/L时,再添加电解质,峰电流的变化不大,说明电子之间的传递达到了平衡,导电率达到了最大。所以选择电解质浓度为0.15 mol/L。

2.2.4 硫酸浓度的影响

图5 硫酸浓度对BaP在电极表面上的线性扫描曲线的影响
Fig. 5 Effect of sulfuric acid concentration on the linear sweep curve of BaP on electrode surface

在保证其他试验条件一致的情况下,只改变底液中硫酸浓度,分别为0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 mol/L,采用线性扫描伏安法进行BaP的测定,结果如图5所示。在无酸的条件下,峰电流的值很低。当添加了0.01 mol/L的硫酸后,峰电流迅速增大,这说明浓硫酸对峰电流的影响显著。当硫酸浓度达到0.1 mol/L时,峰电流的变化平缓,说明BaP的活跃性已达到最大,所以选取浓硫酸浓度为0.1 mol/L。

2.2.5 富集时间的影响

图6 富集时间对BaP在电极表面上的线性扫描曲线的影响
Fig. 6 Effect of enrichment time on the linear sweep curve of BaP on electrode surface

BaP的富集时间与电极表面吸附BaP的多少有关,影响着电化学传感器测定的准确性。配制相同BaP浓度的溶液,富集时间分别为5、10、15、20、25 min,在相同的底液中采用线性扫描伏安法进行测定,如图6所示。在5~10 min范围内峰电流随着富集时间的延长而增大,当富集时间达到10 min后,峰电流的变化较小,说明BaP在电极表面的富集达到了饱和状态。所以选择富集时间为10 min。

2.3 电化学分析方法测定BaP

分别配制0、20、30、40、60、80、100、200、400、600、800、1 000 nmol/L的BaP标准溶液,按照1.3节进行测定,每个浓度均测定3 次,取其平均值为该浓度的响应电流值,然后以所测不同浓度的峰电流值为纵坐标,BaP浓度为横坐标,绘制BaP的标准曲线,如图7所示。BaP的氧化反应电流Ip值随BaP浓度的增大而增大,且在BaP浓度范围为0~100 nmol/L时Ip值与CBaP之间的关系满足线性关系方程:IP= 0.016 3 CBaP+2.879 6,相关系数R2为0.994 8,其最低检测限为0.187 nmol/L(RSN=3)。Du Chunyan等[27]采用微分脉冲伏安法构建了乙腈-水(1∶1,V/V)二元介质中BaP直接氧化的电化学分析方法,其检测限为0.67 nmol/L;yardım等[30]用掺硼金刚石电极作为工作电极,采用吸附溶出伏安法测定添加表面活性剂的水溶液中BaP的电化学氧化性质,检测限为2.8 nmol/L。由此可见,本实验构建的电化学传感器具有较好的灵敏度,可作为一种快速测定BaP的分析方法。

图7 不同浓度的BaP在玻碳电极表面上的线性扫描曲线
Fig. 7 Linear sweep curves of BaP at different concentrations on glassy carbon electrode surface

2.4 电化学传感器的抗干扰性和重复性

探索了与BaP性质相同的脂溶性抗氧化剂(VE、TBHQ和PG)对BaP氧化响应电流的影响。配制0.1 mol/L的VE、TBHQ和PG溶液,溶剂为乙醇,在4 ℃保存备用。在其他条件相同的情况下,采用线性扫描伏安法测定空白的BaP标准溶液以及分别添加3 种抗氧化剂的BaP标准溶液的电化学氧化响应电流。发现3 种抗氧化剂的峰电流均在0.5~0.6 V之间,而BaP的峰电流在1.1 V左右,相差较远。不仅如此,在分别添加VE、TBHQ和PG后,BaP的氧化峰电流变化仅为5.79%、4.34%、3.72%。说明该电化学传感器的抗干扰性较好。

配制3 批不同浓度的BaP标准溶液,每批为两瓶相同浓度的BaP标准溶液,采用线性扫描伏安法测定其氧化响应电流,结果显示,第1批标准溶液的两组氧化峰的变化为0.84%;第2批为1.4%;第3批仅为0.42%。说明该电化学传感器的重复性较好。

2.5 样品中BaP的测定及加标回收实验

按照1.3.3.1节方法处理样品,得到样品提取液,分别采用电化学传感器法和高效液相色谱法检测样品中BaP的含量,并进行加标回收实验,计算其平均值和相对标准偏差。如表1所示,本法测得样品中BaP含量为25.78 nmol/L,而高效液相色谱法测得25.85 nmol/L,二者相差仅0.27%;在分别加有5、10、20 nmol/L的BaP标准品后,本法的回收率在96.67%~101.56%之间,高效液相色谱法则在97.77%~100.31%之间;另外,两种方法的相对标准偏差均在1.14%~2.05%之间。所以二者基本一致,免疫传感器法快捷方便。测得市售的烤羊肉串中BaP含量约为54 μg/kg,超出国家限量标准(5 μg/kg)10 倍左右,所以建议尽量少吃甚至不吃路边摊售卖的烤羊肉串,减少BaP对身体的伤害。

表1 烤羊肉串样品中BaP回收率测定的结果
Table 1 Recovery of BaP added to shish kebab

3 结 论

BaP具有致癌、致畸、致突变的性质,对身体的危害极大。基于BaP的电化学氧化还原性质,构建了一种速度快、特异性强、灵敏度好的电化学传感器,并对其检测条件进行了优化。发现最优的检测条件为溶剂乙腈-水溶液(1∶3,V/V)、电解质浓度0.15 mol/L、硫酸浓度0.1 mol/L、富集时间10 min。该电化学传感器达到了0.187 nmol/L(RSN=3)的检测限,此外,具有抗干扰性强、稳定性好、检测时间短的特点,在食品中苯并芘的快速检测中应用潜力巨大。在选定乙腈-水(1∶3,V/V)电解质溶液中,BaP在玻碳电极上的循环伏安图表明,其在电位为1.05 V处发生氧化反应,其氧化电流与BaP的浓度呈正比,而且该反应不可逆;采用线性扫描伏安技术,构建了一种快速、方便、灵敏的BaP电化学分析方法,并应用于烧烤类食品中BaP的含量测定。本实验还对其分析测定条件进行优化,确定了数学模型、线性范围、检测限等参数,实现了BaP的快速、准确、现场检测。此外,该传感器抗干扰性强、稳定性好、检测时间短、制作过程简单,在食品中苯并芘的快速检测中的开发前景广阔、应用潜力巨大。

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Electrochemical Analysis for Rapid Determination of Benzo(a)pyrene in Barbecued Foods

FENG Yajing, ZHANG Zhiye, LI Shuguo*
(College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China)

Abstract:Based on the electrochemical redox properties of benzo(a)pyrene (BaP), a rapid electrochemical method for the determination of BaP in barbecued foods was established. The optimum conditions for the method were established as follows: using acetonitrile-water (1:3, V/V) as solvent, LiClO4concentration (as electrolyte) 0.15 mol/L, sulfuric acid concentration 0.1 mol/L, and enrichment time 10 min, where the response current linearly increased with increasing BaP concentration in the range of 0–100 nmol/L. The limit of detection (LOD) of the proposed method was 0.187 nmol/L (RSN= 3). Excellent stability and reproducibility of the method were observed. The recovery of the analyte added to shish kebab was in the range of 96.67%–101.56%. The results were in agreement with those obtained by high performance liquid chromatography (HPLC). Consequently, the electrochemical method was useful for rapid determination of BaP in barbecued foods.

Key words:benzo(a)pyrene (BaP); electrochemical analysis method; food safety; barbecued food

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716032

中图分类号:TS225.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)16-0205-05

引文格式:

冯亚净, 张志业, 李书国. 电化学分析法快速测定烧烤类食品中的苯并(a)芘[J]. 食品科学, 2017, 38(16): 205-209. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716032. http://www.spkx.net.cn

FENG Yajing, ZHANG Zhiye, LI Shuguo. Electrochemical analysis for rapid determination of benzo(a)pyrene in barbecued foods[J]. Food Science, 2017, 38(16): 205-209. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716032. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-09-12

基金项目:国家自然科学基金面上项目(20876165);河北省食品药品安全科技项目计划项目(ZD2014011)

作者简介:冯亚净(1993—),女,硕士研究生,研究方向为食品安全技术。E-mail:614147861@qq.com

*通信作者:李书国(1969—),男,教授,博士,研究方向为食品安全技术。E-mail:shuguolee@126.com