基于元素含量和稳定同位素比值的宁夏贺兰山东麓地区有机葡萄酒甄别

吴 浩1,周 昱2,陈靖博2,陈德启3,金晓蕾1,靳保辉1,谢丽琪1,林光辉4,5

(1.深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心,广东 深圳 518016;2.厦门出入境检验检疫局,福建 厦门 361000;3.宁夏德龙酒业有限公司,宁夏 银川 750100;4.清华大学深圳研究生院,广东 深圳 518055;5.清华大学地球系统科学系,地球系统数值模拟教育部重点实验室,北京 100084)

摘 要:对贺兰山东麓产区生产的有机和非有机葡萄酒的元素含量和稳定C、N同位素比值分布特征进行分析,并利用此数据对宁夏贺兰山东麓地区有机与非有机葡萄酒进行甄别。结果表明,有机与非有机葡萄酒在一些金属元素如Na、Mg、K、Al和Cu的含量上具有显著差异,而且有机葡萄酒的乙醇和丙三醇的δ13C值显著低于非有机葡萄酒,但δ15N显著高于非有机葡萄酒。利用C、N稳定同位素和一些金属元素含量,结合主成分分析,可对贺兰山东麓地区有机和非有机葡萄酒进行有效区分,为我国有机葡萄酒掺假检测以及该地区的葡萄酒产业发展提供技术支撑,具有重要的应用前景。

关键词:有机肥;葡萄;酒精饮料;矿质元素;食品鉴定

随着我国经济持续发展,人民生活水平和购买力不断提高,葡萄酒的消费量呈现快速增长趋势[1]。有机葡萄酒在种植技术、酿造工艺、生态可持续发展等方面具有明显优势,因此有机概念的引入也将葡萄酒的品质提升到了新的高度,同时满足了目前消费者追求安全饮食、健康饮食、绿色饮食的需求,具有很大的发展空间。有机葡萄酒是指获得“有机葡萄酿造”认证商标的葡萄酒,特指葡萄来自有机葡萄园,或采取有机种植法,一概不允许使用化学肥料和农药[2]。对于葡萄酒中农药残留的检测已有大量方法和标准[3-5],但对判断葡萄种植过程中是否使用化肥的研究鲜见报道。目前对市场上销售的有机葡萄是否为有机的研究较少[6]

稳定同位素技术的快速发展为有机和非有机葡萄酒的区分提供了可能。贺兰山东麓葡萄酒产区大部分为砂砾土壤,有机质含量少,肥力低,种植过程中必须施肥保证葡萄的产量[7]。土壤中N元素是影响植物体N稳定同位素变化的主要因素[8],因此利用N同位素比值能一定程度上对农产品N素来源进行追溯。其次,葡萄酒含有丰富的矿质元素,包括K、Ca、Na、Mg等常见元素,Fe、Cu、Zn、Mn等微量元素,以及Pb、Sr、Cr等痕量金属元素[1,9]。这些元素主要来自于葡萄种植土壤,所以利用矿质元素在葡萄酒中的含量分布特征可对葡萄酒的原产地进行溯源[10-13]。影响葡萄酒中元素含量变化不仅是产地差异,已有研究表明使用不同类型的肥料可能直接影响葡萄酒中微量元素含量[14-16]。因此通过分析特定元素含量的差异,也可以对葡萄酒是否有机进行区分。

为了揭示有机和非有机葡萄酒在稳定同位素和元素含量分布特征等方面的差异,探索利用稳定同位素和微量元素对有机和非有机葡萄酒进行精准区分的有效性,本实验选取宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区的有机葡萄园和非有机葡萄园作为研究对象,分析有机与非有机葡萄酒的元素含量和C、N稳定同位素比值,并利用多元统计模型对有机与非有机葡萄酒进行区分。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

为了避免由于产地背景引起的元素和同位素比值的差异,有机和非有机葡萄酒选自同一产地。有机葡萄酒样品采自宁夏德龙十万亩有机葡萄产业园,位于贺兰山东麓葡萄园产区。该葡萄园获得中国有机认证(认证号:CHC11010178R1M-1)和美国USDA有机认证(认证号:7327CN100(NOP))。管理过程中实现全程有机,种植过程中不使用任何农药和化肥,以家畜粪肥作为有机肥料(主要为牛羊粪肥)。非有机葡萄酒采自贺兰山东麓非有机种植葡萄酒厂,具体样品信息见表1。所有葡萄品种均属于欧亚葡萄品种(Vitis vinifera)。

表1 葡萄酒样品品种信息
Table 1 Information about grape varieties for the selected wines

元素分析标准物质:Ca、K、Na、Mg、B、Al、Cr、Mn、Fe、Cu、Zn、Rb、Sr、Ba元素标准品采用国家单元素标准(质量浓度10~1 000 mg/L),购于国家钢铁材料测试中心。

同位素标准物质:除乙醇外,其他挥发性成分标准品均没有相应的同位素标准物质,因此香气成分的C稳定同位素比值测定以乙醇作为质控标准品。乙醇同位素标准物质为BCR-656由欧洲标准物质中心提供,δ13CV-PDB=(26.91±0.07)‰,纯度96%;氮稳定同位素标准物质采用国际原子能机构IAEA-600咖啡因标准,δ15N=(1.0±0.2)‰。

其他标准物质:乳酸乙酯(纯度99.5%)购于天津光复精细化工研究所;2-甲基丁醇(纯度98%)购于美国Sigma公司;乙酸、丙三醇(纯度98%)(均为优级纯)购于天津科密欧化学试剂有限公司。以上标准品仅作为挥发性成分在气相色谱-稳定同位素质谱法的定性。所有标准品待测前均用超纯水稀释10 倍。超纯水由Millpore公司制造的Milli-Q系统制备。He(纯度99.999%,载气)、CO2(纯度99.999%,参考气)、N2(纯度99.999%,参考气)购于美国Air Products公司。

1.2 仪器与设备

HP-INNOWAX色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)美国安捷伦公司;Xseries2电感耦合等离子质谱仪、DELTA V advantage同位素质谱主机(配备Trace GC气相色谱仪、GC-Isolink气相色谱接口、Flash EA 1112元素分析仪) 美国赛默飞世尔公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

元素分析前处理:取葡萄酒样品0.5 mL,加入0.5 mL浓硝酸,常温消解过夜,稀释至15 mL备测。

挥发性成分C同位素分析前处理:葡萄酒开瓶后摇匀,一次性注射器(5 mL)吸取葡萄酒样,用0.22 μm水系滤膜过滤至1.5 mL样品瓶中,待测。

N稳定同位素分析前处理:取葡萄酒样品5 mL,冷冻干燥,取干燥后样品2 mg左右,置于锡杯中,包裹严密待测。

1.3.2 分析方法

元素分析:元素含量分析采用王丙涛等[13]分析方法。浓硝酸与葡萄酒样品以1∶1的体积比混合消解后,利用电感耦合等离子质谱仪分析元素含量。质谱条件:功率1 400 W;雾化器流速0.85 mL/min;冷却气流速14.2 L/min;辅助气流速0.8 L/min;采样深度150 mm;脉冲电压3 380 V;模拟电压1 800 V。其中K、Ca、Na、Mg检出限为0.5 mg/L,Al为0.2 mg/L,其他元素为0.01 mg/L。为了获取更准确的分析结果,将K、Ca、Na、Mg和其他元素分开测定。

挥发性成分C稳定同位素分析:不同挥发性组分C稳定同位素分析方法参考文献[17]。对葡萄酒样品中的挥发性成分乙醇、丙三醇、2-甲基丁醇、乳酸乙酯和醋酸分别测定各自的C稳定同位素比值。由于以上挥发性成分在葡萄酒中的含量差异较大,不能同时保证每种成分的同位素质谱信号强度在其线性范围内,将极大影响分析准确性。为了保证样品分析准确,本方法将按照不同组分在葡萄酒中的质量浓度进行分开测试。

乙醇气相色谱条件:HP-INNOWAX色谱柱(30 m× 0.25 mm,0.25 μm);进样量0.1 μL;进样口温度250 ℃;载气高纯He;流速1.5 mL/min;分流比200∶1。程序升温:初温40 ℃,保留1 min,50 ℃/min升温至220 ℃,保留3 min。

丙三醇气相色谱条件:HP-INNOWAX色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);进样量0.2 μL;进样口温度270 ℃;载气高纯He;流速1.5 mL/min;分流比20∶1。程序升温:初温80 ℃,保留1 min,15 ℃/min升温至240 ℃,保留2 min。

其他组分气相色谱条件:HP-INNOWAX色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);进样量0.5 μL;进样口温度250 ℃;载气高纯He;流速1.5 mL/min;分流比10∶1。程序升温:初温80 ℃,保留1 min,15 ℃/min升温至240 ℃,保留6 min。

气相色谱接口条件:燃烧管温度1 000 ℃,切入质谱时间200 s。

元素分析仪条件:氧化炉960 ℃;柱温60 ℃;O2流速175 mL/min;充氧时间3 s;载气流速110 mL/min。

质谱条件:离子源电压2.97 kV;真空度1.4× 10-6mBar;电子能量120.8 eV。

1.4 数据处理

Thermo Electron Isodat version 3.0软件用于同位素值的计算和数据获取。独立样本t-检验和主成分分析(principal component analysis,PCA)采用SPSS 19.0软件进行分析。绘图软件采用Origin 8.5软件进行数据图绘制。

2 结果与分析

2.1 矿质元素含量测定结果

表2 有机和非有机葡萄酒元素含量比较
Table 2 Comparison of elemental contents between organic and non-organic wines mg/L

注:*.在95%置信区间差异显著(P<0.05)。图1同。

如表2所示,贺兰山产区有机和非有机葡萄酒的元素含量总体分布趋势一致,但Ca、K、Mg和Na含量远高于其他元素。t-检验分析显示有机和非有机葡萄酒样品中仅K、Mg、Na、Al和Cu相对大量元素有显著差异(P<0.05),而微量元素没有显著差异。有机葡萄酒中K、Na和Cu含量显著高于无机葡萄酒,而Mg、Al则相反。有机葡萄酒中各元素变异范围为14.77%~55.56%,而非有机葡萄酒中各元素变异范围较大,为7.71%~114.29%,较大的变异可能与葡萄酒的年份和品种差异有关。

影响葡萄酒中元素含量变化的并不仅是产地差异。已有研究表明,耕作方式的差异可直接影响葡萄酒中微量元素含量[14-15]。有机和非有机葡萄的种植和生产地较为接近,土壤中元素背景含量理论上应一致,因此葡萄酒中元素含量差异来源可能与肥料种类和使用量有关[11]。长期使用有机肥料可导致土壤中某些元素的富集[18-19],其次也可能引入一些土壤中原来没有或者含量很少的微量元素,同时也可能降低一些元素的有效性和可利用性[20]。本实验结果可以看出,有机肥料的使用增加了葡萄酒中K、Na和Cu的含量。由于我国北方土壤中一般不缺K[21],因此葡萄园几乎不使用K肥,有机葡萄中较高的K含量一方面可能与有机肥中含有一定量的K有关,另一方面可能是有机肥料对土壤的改良作用促进了K的吸收和利用[22]。无机肥料的使用增加了葡萄酒中Mg和Al的含量,说明化肥使用可能引入了Mg和Al[23],或者由于化肥的使用引起土壤性质的改变[16],提高了Mg和Al可利用性,从而引起葡萄中Mg和Al含量增加。因此,可通过元素含量追踪种植方式的差异,实现对同一产区的有机和非有机葡萄酒的有效鉴别。

2.2 挥发性成分C稳定同位素比值

图1 有机(n=10)和非有机(n=9)葡萄酒中5种挥发性成分的
C比较
Fig. 1 Comparisons of the mean carbon stable isotope ratios (δ13C) of several volatile components between organic (n = 10) and non-organic (n = 9) wines
δ13

如图1所示,对2 种葡萄酒中5种挥发性组分的C稳定同位素比值分析表明,有机和非有机葡萄酒乙醇的δ13C值分别为-(26.71±0.25)‰和-(25.77±0.56)‰,而丙三醇的δ13C值分别为-(31.53±0.41)‰和-(29.85±0.47)‰。由此可见,有机与非有机葡萄酒之间在乙醇和丙三醇的δ13C值上具有显著差异(P<0.05)。乙醇和丙三醇为葡萄酒主要发酵产物,其C同位素比值取决于葡萄浆果的C稳定同位素比值。植物体C稳定同位素比值与种类[24]和种植方式有关,如肥料的使用[25]。同时土壤N素与植物C同位素比值也存在着一定相关性[26],可以推测有机和非有机葡萄酒之间乙醇和丙三醇δ13C的显著差异与肥料的使用有关。相反,2-甲基丁醇、乳酸乙酯和醋酸等次生发酵产物与肥料使用关系不大,与发酵工艺过程关系更密切[17],因此其同位素比值差异不显著。

2.3 N稳定同位素特征

图2 非有机(n=9)和有机(n=10)葡萄酒中δ15N的比较
Fig. 2 Comparison of the mean nitrogen stable isotope ratios (δ15N) between non-organic (n = 9) and organic (n = 10) wines

葡萄酒中有机质的N同位素主要来自于土壤中氮肥。如图2所示,非有机和有机葡萄酒中有机质的δ15N值分别为(2.20±0.40)‰和(4.36±0.58)‰,因此有机葡萄酒N稳定同位素极显著高于非有机种植葡萄酒(P<0.01)。N稳定同位素分析技术已被广泛应用于有机与非有机农作物的区分[27-29]。由于化学合成氮肥(如尿素、碳酸氢铵)是由空气中的N2在高温高压条件下合成的,并没有发生N同位素分馏,因此δ15N值与N2很接近。有机肥多来源于植物不可食用部分和人畜粪便等经过堆沃、发酵、杀虫、灭菌等过程形成[30],这些过程都会使有机肥料中的15N出现富集。Bateman等[31]研究发现,化学肥料中15N的丰度变化范围小,80%的样品中δ15N值为-2‰~2‰,98.2%的样品δ15N值低于4‰,其平均值为0.1‰;而有机肥料(如堆肥、粪肥和鱼粉等)中δ15N值变化范围大,在0.2‰~36.2‰之间波动,其平均值为8.2‰。由此可见,有机肥料使用比例对葡萄酒中N稳定同位素会显著影响,因而可作为区分有机与非有机葡萄酒的关键指标。

2.4 有机和非有机葡萄酒的区分

图3 有机和非有机葡萄酒中元素含量和稳定同位素比值的PCA
Fig. 3 PCA plot of elemental contents and stable isotope compositions of organic and non-organic wines

目前对有机与非有机葡萄酒进行区分的研究有近红外[6]、有机组分含量[32-33]等方法,从区分的准确率和稳定性来看并不理想。C、N稳定同位素比值以及元素含量由于与耕作方式密切相关,因此可提供较为准确和稳定的判别能力。本研究结合PCA法对K、Na、Mg、Al、Cu、δ13C乙醇、δ13C丙三醇以及δ15N等差异显著的指标值进行PCA。将所有数据标准化后,利用SPSS 19.0软件进行统计分析。PCA提取的3 个主成分可解释82.59%的方差,利用所获得的主成分得分值可对贺兰山东麓产区有机与非有机葡萄酒实现有效区分,如图3所示。有机葡萄酒数据点分布较为分散可能与样本中有机葡萄酒的葡萄品种多样化有关,但总体上有机与非有机种植引起的差异要大于葡萄品种不同产生的差异。从本研究结果来看,C、N稳定同位素显示了较好的应用前景。虽然本研究采集样品仅针对贺兰山东麓产区,所获的结论可以推广到全国其他葡萄酒主产区。通过更多产区样本的分析,建立我国不同产地有机葡萄酒数据库,可实现对我国有机和非有机葡萄酒的区分。

3 结 论

本研究通过分析葡萄酒中相对大量的元素含量、挥发性成分C稳定同位素以及干物质N稳定同位素比值,对有机和非有机葡萄酒进行了鉴别。结果表明,有机和非有机葡萄酒由于种植模式和肥料使用的差别,导致稳定同位素以及元素含量发生显著变化,因此通过分析葡萄酒中C、N稳定同位素以及元素含量,可以实现对有机和非有机葡萄酒的精确区分。与其他研究有机葡萄酒鉴别方法相比,利用稳定同位素和元素含量对有机葡萄酒进行鉴别,具有准确性高、稳定性好的优点。本研究结果对该地区乃至全国的有机葡萄酒产业发展和掺假鉴定提供重要的参考依据。

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Differentiation between Organic and Non-Organic Wines from Helan Mountain East Region Based on Elemental Contents and Stable Isotope Ratios

WU Hao1, ZHOU Yu2, CHEN Jingbo2, CHEN Deqi3, JIN Xiaolei1, JIN Baohui1, XIE Liqi1, LIN Guanghui4,5
(1. Food Inspection Center of CIQ-Shenzhen, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518016, China; 2. Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361000, China; 3. Ningxia Daylong Wine Co. Ltd., Yinchuan 750100, China; 4. Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University, Shenzhen 518055, China; 5. Key Laboratory for Earth System Modeling, Ministry of Education, Department of Earth System Science, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

Abstract:In this study, we analyzed elemental contents and stable isotope ratios of carbon (C) and nitrogen (N) in organic and non-organic wines from Helan mountain east region in Ningxia of China and then used the obtained data to distinguish between the two wines. Our results showed that there were significant differences in the contents of several metal elements including Na, Mg, K, Al and Cu between the organic and non-organic wines and that the δ13C ratios of ethyl alcohol and glycerol in the organic wine were much lower than those in the non-organic one, but the N stable isotope ratios were significantly higher than those in the non-organic one. Thus, C and N stable isotopes and the contents of selected metal elements could be used to effectively distinguish between organic and non-organic wines by principal component analysis. This method has a great potential to be applied for organic wine authentication and therefore can provide a technical support for the development of the wine industry in this region.

Key words:organic fertilizer; grape; alcoholic beverage; metal element; food authentication

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716040

中图分类号:TS262.6

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)16-0251-05

引文格式:

吴浩, 周昱, 陈靖博, 等. 基于元素含量和稳定同位素比值的宁夏贺兰山东麓地区有机葡萄酒甄别[J]. 食品科学, 2017, 38(16): 251-255. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716040. http://www.spkx.net.cn

WU Hao, ZHOU Yu, CHEN Jingbo, et al. Differentiation between organic and non-organic wines from Helan mountain east region based on elemental contents and stable isotope ratios[J]. Food Science, 2017, 38(16): 251-255. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716040. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-10-10

基金项目:中国博士后科学基金项目(2014M562196);深圳出入境检验检疫局科技计划项目(SZ2014208;SZ2015103)作者简介:吴浩(1984—),男,高级工程师,博士,研究方向为稳定同位素生态学。E-mail:whakyo@foxmail.com