张 浩1，陈伟鸿2，马方励2，王 珊1，谭开祥3，向极钎4，刘 卫1,*
（1.华中科技大学生命科学与技术学院，湖北 武汉 430074；2.无限极（中国）有限公司，广东 广州 510665；3.湖北思慧生物科技有限公司，湖北 恩施 445099；4.恩施州农业科学院，湖北 恩施 445099）
摘 要：研究富硒青钱柳多糖（selenium polysaccharide from Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja，Se-CPP）对糖尿病模型小鼠血糖、血脂和免疫力的影响。高脂饮食加腹腔注射链脲佐菌霉素建立小鼠糖尿病模型，以生理盐水、青钱柳多糖（Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja polysaccharide，CPP）、CPP＋亚硒酸钠、亚硒酸钠、Se-CPP低、中、高剂量（0.2、0.6、1.8 g/（kg·d））、消渴丸连续灌胃给药42 d。末次给药后检测小鼠葡萄糖耐量、血清总胆固醇（total cholesterol，TC）含量、甘油三酯（triglyceride，TG）含量、抗氧化酶活力、免疫器官指数及小鼠脾淋巴细胞转化指数。结果表明：连续给药42 d后，Se-CPP低、中剂量组小鼠血糖、血清TC和TG水平均低于CPP组和CPP＋亚硒酸钠组，Se-CPP较CPP具有更好的抗氧化活力和提高糖尿病小鼠免疫力的功效。
关键词：富硒青钱柳多糖；糖尿病小鼠；血糖；血脂；抗氧化；免疫力
张浩, 陈伟鸿, 马方励, 等. 富硒青钱柳多糖对糖尿病模型小鼠血糖、血脂和免疫力的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(17): 228-232. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717037. http://www.spkx.net.cn
ZHANG Hao, CHEN Weihong, MA Fangli, et al. Effect of selenium polysaccharide from Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja on blood glucose, serum lipid and immunity in diabetic mice[J]. Food Science, 2017, 38(17): 228-232. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717037. http://www.spkx.net.cn
青钱柳（Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja），又名摇钱树、青钱李，系双子叶植物纲胡桃科青钱柳属落叶乔木，为我国特有的单种属植物，分布于江西、湖北、湖南、贵州等省区[1]。研究表明，青钱柳叶富含多糖、黄酮、皂苷等次生代谢产物[1-2]，其中，青钱柳多糖（Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja polysaccharide，CPP）具有降血糖、降血脂等作用[3-4]。硒是人体必需的微量元素，具有抗氧化、提高免疫力等功效[5-6]。目前研究表明，硒多糖兼有硒与多糖的生物活性，具有降血糖、降血脂、抗氧化、提高免疫力、抗肿瘤等功效[6-8]。本课题组前期工作中采用有机硒肥喷施青钱柳叶，获得硒含量达到国家富硒茶叶标准（0.25～4.00 mg/kg）的富硒青钱柳叶[9]。本实验以富硒青钱柳叶为实验材料，提取分离获得富硒青钱柳多糖（selenium polysaccharide from Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja，Se-CPP），研究Se-CPP对高脂饮食加链脲佐菌霉素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病小鼠的血糖、血脂以及抗氧化、免疫力等生理功能的影响，为富硒青钱柳保健食品的研究与开发提供参考。
1.1 材料、动物与试剂
青钱柳叶和富硒青钱柳叶采集于湖北恩施某青钱柳种植基地。CPP和Se-CPP分别参照文献[10]方法提取制备。CPP和Se-CPP中硒元素含量采用氢化物原子荧光光谱法检测[11]，检测结果分别为0.11 mg/kg和3.30 mg/kg。
SPF级雄性C57BL/6小鼠120 只，体质量16～18 g，许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。实验动物、普通维持料及高脂饲料由湖北省疾病预防控制中心提供。
STZ、刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）、四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；消渴丸 广州白云山中一药业有限公司；罗康全活力型血糖试纸 罗氏诊断产品（上海）有限公司；亚硒酸钠片 上海天赐福生物工程有限公司；总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）检测试剂盒 南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
ACCU-CHEK Active血糖仪 罗氏诊断产品（上海）有限公司；318C酶标仪 成都华衡仪器有限公司；BSA124S分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；BPN-150CRH二氧化碳培养箱 上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 分组及给药
参照文献[12-13]的方法，小鼠适应性喂养3 d，禁食12 h后测定小鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），按照FBG随机分组。分为空白组（生理盐水）、模型组（生理盐水）、CPP组（0.6 g/（kg·d），以体质量计，下同）、CPP＋亚硒酸钠组（CPP 0.6 g/（kg·d）、Na2SeO34.34 μg/（kg·d））、亚硒酸钠组（Na2SeO34.34 μg/（kg·d））、Se-CPP低、中、高剂量组（0.2、0.6、1.8 g/（kg·d）），另设消渴丸（0.514 g/（kg·d））作为阳性对照组，各组给药剂量参考文献[14]及预实验结果确定。分组后，空白组小鼠8 只，其余各组小鼠10 只。
分组后根据小鼠体质量灌胃给药，每天一次，连续42 d，以生理盐水配制受试样品。给药期间，除空白组外，各组小鼠给予高脂饲料喂养。
1.3.2 糖尿病小鼠模型的建立
参照文献[13]的方法，连续给药14 d后，小鼠禁食12 h，根据体质量腹腔注射剂量为40 mg/kg的STZ溶液（以0.1 mol/L、pH4.2的柠檬酸缓冲液为溶剂配制，现配现用），空白组小鼠注射等量溶剂，4 h后小鼠恢复进食。3 d后再次对小鼠腹腔注射等剂量STZ。
1.3.3 小鼠体质量和口服葡萄糖耐量的测定
每周定时记录小鼠体质量并观察小鼠生长状况。末次给药后进行口服葡萄糖耐量实验（oral glucose tolerance test，OGTT）：小鼠禁食12 h后尾静脉取血测定FBG作为0 h的血糖值，随后根据体质量灌胃给药，15 min后再灌胃2.5 g/kg葡萄糖溶液，分别等待0.5、1.0 h和2.0 h后测定小鼠血糖值，计算血糖曲线下面积（area under the curve，AUC）[15]。
1.3.4 小鼠血清生化指标的检测
末次给药后，所有小鼠普通维持料喂养2 d后禁食12 h，测定体质量后摘眼球取血。血液离心分离血清，检测血清TC、TG含量和SOD、GSH-Px活力，具体检测过程见试剂盒说明书。
1.3.5 小鼠免疫器官指数的检测
将取血后的小鼠脱臼处死，无菌取脾脏、胸腺后称质量，计算脏器指数[16]。
1.3.6 小鼠脾淋巴细胞转化实验
参照文献[17]的MTT法，以ConA刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，计算转化指数（实验孔与对照孔OD值之比）。
1.3.7 Se-CPP对正常小鼠血糖的影响
另取20 只小鼠，按照FBG随机分为空白组（生理盐水）和正常组（0.6 g/（kg·d）Se-CPP），每组小鼠9 只。分组后根据体质量灌胃给药，每天一次，连续42 d。实验期间，所有小鼠普通维持料喂养，末次给药后进行OGTT并计算AUC。
1.4 数据统计分析
采用SPSS 19.0软件对实验结果进行统计学分析。对实验数据进行方差分析，组间多重比较采用LSD法，结果以±s表示。
2.1 Se-CPP对糖尿病小鼠体质量和葡萄糖耐量的影响
实验期间，观察到模型组小鼠体质量低于其余各实验组，但无显著性差异；同时，模型组小鼠出现多食、多饮、多尿等糖尿病症状，各实验组小鼠糖尿病症状较模型组小鼠有所减轻。末次给药后进行OGTT，结果见表1。
表 1 小鼠血糖和AUC比较（x±
s
Table 1 Comparison of blood glucose and AUC in all groups of mice (x ±
s)
注：*.与空白组比较差异显著（P＜0.05）；**.与空白组比较差异极显著（P＜0.01）；#.与模型组比较差异显著（P＜0.05）；##.与模型组比较差异极显著（P＜0.01）；Δ.与阳性对照组比较差异显著（P＜0.05）；ΔΔ.与阳性对照组比较差异极显著（P＜0.01）；▲.与Se-CPP低、中剂量组比较差异显著（P＜0.05）。表2同。
由表1可知，模型组与空白组相比，小鼠口服葡萄糖后血糖值和AUC极显著升高（P＜0.01），表明小鼠高血糖模型建造成功。阳性对照组、各实验组与模型组比较，小鼠口服葡萄糖后血糖值均有显著下降（P＜0.05，P＜0.01），且AUC极显著降低（P＜0.01），表明阳性对照组和各实验组均表现出显著的降血糖作用。Se-CPP低、中剂量组与阳性药物组比较，AUC无显著性差异，表明低、中剂量的Se-CPP降血糖效果与消渴丸相当。Se-CPP低、中剂量组AUC均显著低于CPP组和CPP＋亚硒酸钠组（P＜0.05），表明低、中剂量的Se-CPP比CPP和CPP＋亚硒酸钠具有更好的降血糖效果。实验中低、中剂量组Se-CPP给药剂量与文献报道的恩施硒茶硒多糖降血糖给药剂量相当[18]。
另外，实验发现高剂量组Se-CPP降血糖效果不如低、中剂量组，原因可能与低剂量兴奋效应有关[16,19]。低剂量兴奋效应是指机体在外来因素影响时，低剂量对机体产生兴奋效应而高剂量产生抑制效应。文献报道硒具有U型或倒U型剂量反应曲线，当给药剂量超过最适剂量后，其生物活性反而降低[19-20]。
2.2 Se-CPP对糖尿病小鼠血清血脂的影响
表 2 小鼠血清TC和TG含量比较
Table 2 Comparison of serum TC and TG levels in all groups of mice
连续给药42 d后检测小鼠血清TC和TG的含量结果见表2，Se-CPP各剂量组小鼠血清TC水平均低于空白组和模型组，且低、中剂量组与空白组和模型组比较差异显著（P＜0.05），TG水平较空白组和模型组有所升高。Se-CPP各剂量组小鼠血清TC和TG水平均低于CPP组和CPP＋亚硒酸钠组，Se-CPP各剂量组间小鼠血清TC和TG水平均为低剂量组＜中剂量组＜高剂量组，各组间无显著性差异（P＞0.05）。
2.3 Se-CPP对糖尿病小鼠抗氧化酶活力的影响
图 1 小鼠血清SOD和GSH-Px活力比较
Fig. 1 Comparison of serum SOD and GSH-Px activities in all groups of mice
SOD和GSH-Px是小鼠体内两种重要的抗氧化酶，连续给药42 d后检测小鼠血清SOD和GSH-Px活力。由图1可知，Se-CPP低、中剂量组小鼠GSH-Px活力高于CPP组和CPP＋亚硒酸钠组，且高于空白组、模型组与阳性对照组，但Se-CPP高剂量组小鼠GSH-Px活力较低。Se-CPP中、高剂量组小鼠SOD活力高于CPP组和CPP＋亚硒酸钠组，且高于空白组、模型组与阳性对照组。另外，Se-CPP中剂量组小鼠血清抗氧化酶活力优于高剂量组，其原因可能与降血糖实验一样，与硒的U型剂量反应曲线有关。
2.4 Se-CPP对糖尿病小鼠免疫能力的影响
2.4.1 Se-CPP对糖尿病小鼠免疫器官指数的影响
图 2 小鼠免疫器官指数比较
Fig. 2 Comparison of immune organ indexes in all groups of mice
胸腺与脾脏是小鼠体内重要的免疫器官，免疫器官指数可以间接反映出机体淋巴细胞水平[16]。由图2可知，与空白组和模型组比较，Se-CPP中、高剂量组小鼠胸腺指数显著升高（P＜0.05，P＜0.01），且高于CPP组和CPP＋亚硒酸钠组，但各实验组小鼠脾脏指数无显著性差异（P＞0.05）。
2.4.2 Se-CPP对糖尿病小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
图 3 小鼠脾淋巴细胞转化指数比较
Fig. 3 Comparison of spleen lymphocyte transformation rates in mice
淋巴细胞的增殖分化是机体免疫应答的重要阶段，检测淋巴细胞的增殖能力是评价细胞免疫功能的常用方法[21]。由图3可知，Se-CPP中、高剂量组小鼠转化指数显著高于空白组和模型组（P＜0.05，P＜0.01），表明一定剂量的Se-CPP可以增强糖尿病小鼠脾淋巴细胞增殖能力，从而提高糖尿病小鼠细胞免疫能力。
2.5 Se-CPP对正常小鼠血糖的影响
表 3 Se-CPP对正常小鼠血糖的影响（n=9）
Table 3 Effect of Se-CPP on blood glucose in normal mice (n= 9)
由表3可知，给葡萄糖前，空白组与正常组小鼠血糖无显著性差异；给葡萄糖后，空白组与正常组小鼠血糖变化趋势相同，即先升高，然后逐渐降低，且两者AUC无显著性差异，表明长期服用一定剂量的Se-CPP对正常小鼠的FBG和葡萄糖耐量无明显影响（P＞0.05）。
糖尿病是一种常见的以持续高血糖为主要临床特征的慢性内分泌紊乱疾病，近年来其发病率逐渐提高[22]。研究表明，糖尿病与人体内硒元素的缺乏具有一定的关系，适量补硒对于糖尿病的预防与治疗具有重要意义[23]。
目前，国内外关于硒与糖尿病的研究很多，以无机硒为主，较少涉及有机硒对糖尿病的影响[24]。本实验以我国特有植物青钱柳为原材料，采用人工施加有机硒肥的方式使青钱柳富集硒元素，探讨Se-CPP对糖尿病小鼠的影响，并与CPP及CPP＋亚硒酸钠的复配物作比较。实验结果表明，连续给药42 d后，一定剂量的Se-CPP具有与阳性药物消渴丸相当的降低糖尿病小鼠餐后血糖的作用，其降血糖效果明显优于CPP及CPP＋亚硒酸钠复配物。据文献报道，CPP可能通过修复受损的胰岛细胞、抑制α-葡萄糖苷酶的活性等机制发挥降血糖的作用[14,25]。Se-CPP降血糖机制是否与CPP相类似还需进一步研究。
除了血糖异常，糖尿病患者常出现血脂代谢紊乱的症状[26]。检测结果表明模型组与空白组TC和TG含量无显著性差异，原因可能与高脂饲养时间较短有关。Se-CPP各剂量组小鼠TC和TG水平均低于CPP组和CPP＋亚硒酸钠组，表明Se-CPP具有更好的降血脂作用。
SOD和GSH-Px在机体抗自由基损伤中起着重要的作用[27]。检测结果表明，适宜剂量的Se-CPP具有增强糖尿病小鼠SOD和GSH-Px活力的功效。此外，小鼠的免疫器官指数和转化指数的检测结果表明，一定剂量的Se-CPP可以提高糖尿病小鼠胸腺指数和转化指数，从而增强糖尿病小鼠免疫力。研究表明，CPP具有较强的抗氧化活性并可提高小鼠免疫力[28-29]。本实验结果表明，Se-CPP抗氧化和增强小鼠免疫力的活性较CPP、CPP＋亚硒酸钠复配物均有所提升。机体免疫能 力与抗氧化活性密切相关[30]，Se-CPP具有比CPP更好的增强小鼠免疫力功效，可能与Se-CPP具有更好的抗氧化活性有关，Se-CPP提高小鼠免疫能力的详细作用机制还有待深入研究。
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Effect of Selenium Polysaccharide from Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja on Blood Glucose, Serum Lipid and Immunity in Diabetic Mice
ZHANG Hao1, CHEN Weihong2, MA Fangli2, WANG Shan1, TAN Kaixiang3, XIANG Jiqian4, LIU Wei1,*
(1. College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China; 2. The Infi nite (China) Co. Ltd., Guangzhou 510665, China; 3. Hubei Savant Biological Technology Co. Ltd., Ens hi 445099, China; 4. Enshi Academy of Agricultural Sciences, Enshi 445099, China)
Abstract:This work studied the effect of selenium polysaccharide from the leaves of Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja (Se-CPP) on blood glucose, serum lipid and immunity in diabetic mice. The diabetic mice induced by high-fat diet and intraperitoneal injection of streptozotocin were administrated with physiological saline, Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja polysaccharide (CPP), CPP + sodium selenite, sodium selenite, Se-CPP at low, middle and high doses (0.2, 0.6, 1.8 g/(kg·d)) and Xiaoke pill. After 42 d administration, the levels of glucose tolerance, serum total cholesterol (TC) and triglyceride (TG), the activities of antioxidant enzymes, immune organ index, and splee n lymphocyte transformation rate were measured. The results showed that blood glucose, serum TC and TG levels in the low- and middle-dose Se-CPP groups were lower than those in the CPP and CPP + sodium selenite groups. In addition, Se-CPP had better antioxidant activity and could more effectively improve immunity in diabetic mice than CPP.
Key words:selenium polysaccharide from Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja; diabetic mice; blood glucose; serum lipid; antioxidant activity; immunity
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717037
中图分类号：R587.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）17-0228-05引文格式：
收稿日期：2016-06-24
基金项目：湖北省科技支撑计划项目（2013BEC048）
作者简介：张浩（1992—），男，硕士研究生，研究方向为天然产物功效。E-mail：1479765099@qq.com *通信作者：刘卫（1966—），男，教授，博士，研究方向为生物制药。E-mail：wliu@hust.edu.cn