酶解脱脂蚕蛹蛋白过程中鲜味规律研究

杨 波1，刘小玲1，赵谋明1,2,*

（1.广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004；2.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640）

摘 要：以缫丝蚕蛹为实验材料，分析碱性蛋白酶和风味蛋白酶复配酶解脱脂蚕蛹蛋白规律。结果表明：酶解脱脂蚕蛹蛋白的最适底物质量浓度为8 g/100 m L、酶解温度为50 ℃、总酶添加量为1 g/100 g（以脱脂蚕蛹粉计）、酶解时间为9 h；酶解过程中促进了糖的释放，可溶性氮主要是以肽氮形式存在，酶解产物的分子质量主要集中在小于1 kD；在酶解产物中主要的游离氨基酸分别为苏氨酸、组氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、半胱氨酸，占总游离氨基酸含量的60%左右，对酶解液的滋味产生一定的影响；在酶解产物中肽类氨基酸主要是鲜甜味氨基酸，占总肽类氨基酸的50%左右，其中亲水性氨基酸与碱性氨基酸含量的比值约为1；通过对酶解产物鲜味的相关性分析，肽类氨基酸的含量与酶解产物的鲜味有较好的线性相关性。

关键词：缫丝蚕蛹；酶解；鲜味肽；氨基酸；呈味规律

我国的蚕蛹资源非常丰富，年产干蚕蛹量可高达10×104～20×104t，约占世界总产量的80%[1]。缫丝蚕蛹作为蚕桑产业中的蚕茧缫丝后副产物，具有较好的开发价值。干蚕蛹中粗蛋白质量分数约为48%～60%[2]，蚕蛹中氨基酸种类齐全，人体必需的8 种氨基酸大约占总氨基酸的38%，其中鲜味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）占总氨基酸的20%左右[3]，是一种优质的昆虫蛋白资源。目前缫丝蚕蛹主要是用于饲料加工，附加值低。

蛋白质通过蛋白酶作用，将蛋白降解为肽或者更小分子质量的氨基酸[4]。蛋白酶解是提高蛋白价值的有效途径，而且酶解产物营养价值较高并呈现一定的滋味。目前关于酶解缫丝蚕蛹蛋白的研究主要是集中在工艺优化以及酶解产物的功能特性。张海祥[5]采用响应曲面法优化动物蛋白酶对脱脂蚕蛹蛋白的酶解工艺。酶解蚕蛹制备抗氧化肽[6]、血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽[7]、免疫活性肽[8]、抗疲劳肽[9]及风味前体肽[10]。而研究酶解缫丝蚕蛹蛋白的酶解规律较少，对于酶解蛋白规律的研究是合理利用酶解产物的前提[11]。蛋白酶解程度可由蛋白质水解度反映，影响蛋白酶解产物的功能特性及其营养价值，有必要对酶解产物中的一些诸如氮的存在形式、氨基酸种类等宏观指标进行宏观的分析，再结合酶解产物的功能特性，以找出酶解产物功能特性与酶解产物之间的关联。对于研究酶解产物呈味特性规律，目前已经有很多文献对其作出报道。唐胜等[12]研究发现小麦面筋蛋白深度酶解过程中，总酸含量先增加后趋于平缓，酶解液甜苦味不断下降，小分子肽含量逐渐增加。赵阳等[13]研究紫贻贝蛋白酶解过程中呈味物质释放规律，发现游离呈味氨基酸含量逐渐增加，肽类呈味氨基酸的含量先增加后减少，总糖含量没有明显的变化，大分子肽逐渐降解为小分子肽。张恒[14]研究鸡骨酶解过程中的呈味特性与氨基酸的释放规律，发现风味蛋白酶酶解鸡骨过程中，鲜味不断地增强并且鲜味氨基酸含量也逐渐增加。周绪霞等[15]研究鲣鱼酶解后产物动态变化，发现酶解过程中游离氨基酸含量逐渐增加，其中鲜味氨基酸大幅度增加，大分子蛋白和肽类逐渐减少而小分子肽类逐渐增多。以上研究都阐明了氨基酸的释放与酶解液的滋味有显著相关性，但没有说明氨基酸含量影响酶解液的鲜味的相关性大小以及不同因素影响酶解液鲜味的方式。本研究以缫丝蚕蛹蛋白为实验对象，对其进行酶水解，探讨在酶解过程中，总糖、肽分子质量分布、游离和肽类氨基酸含量的变化，结合酶解液的感官评价，来阐述酶解过程中呈味物质的释放规律与鲜味之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

缫丝蚕蛹 宜州市宏基茧丝有限公司；风味蛋白酶（14 000 U/g）、碱性蛋白酶（100 000 U/m L）丹麦诺维信公司；乙腈（色谱纯） 美国Sigma公司；肽分子质量标准品为细胞色素C（mw=12 500 D）、抑肽酶（mw=6 500 D）、谷氨酰胺（mw=1 355 D）、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（mw=189 D）、甘氨酸（mw=75 D）美国Sigma公司；味精（食品级） 广东汇香源生物科技股份有限公司；其他常用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱 美国Waters公司；A 300全自动氨基酸分析仪 德国曼默博尔有限公司；EL204电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PHS-25数显pH计 上海精密科学仪器有限公司；k DN-103F型定氮仪 上海纤检仪器有限公司；DHG-9070A水浴恒温振荡器 上海申贤恒温设备厂；ST16R高速冷冻离心机赛默飞世尔科技公司；Tim840自动电位滴定仪 雷迪美特中国有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脱脂蚕蛹蛋白酶解

缫丝干蚕蛹进行分拣，粉碎，然后过80 目筛，取蚕蛹粉置于8 倍体积的石油醚中，60 ℃的水浴摇床中浸提4 h，除去溶剂后，80 ℃烘箱烘干，得脱脂蚕蛹粉（蛋白质量分数73.14%，油脂质量分数4.57%，总糖质量分数3.63%）。

探讨的因素包括底物质量浓度（5、7、8、10、13、17、25 g/100 m L）、总酶的添加量（0.2、0.5、1、1.6、 2 g/100 g脱脂蚕蛹粉）、酶解温度（40、45、50、55 ℃）、酶解时间（1、3、5、7、9、12 h）。在探讨的因素基础上，其他条件恒定不变，分别为：底物质量浓度8 g/100 m L、加酶量1 g/100 g（风味蛋白酶与碱性蛋白酶1∶1添加[16]，以脱脂蚕蛹粉计）、pH值为7.0、酶解温度45 ℃、水浴酶解5 h，分别测定酶解液的水解度和鲜味评分。

1.3.2 脱脂蚕蛹蛋白酶解规律

氮的存在形式和总糖回收率：取6 份脱脂蚕蛹粉8 g配制成100 m L悬浊液，总酶添加量为1 g/100 g（0.5 g/100 g风味蛋白酶＋0.5 g/100 g碱性蛋白，以脱脂蚕蛹粉计），pH值为7.0，置于50 ℃水浴分别酶解1、3、5、7、9、12 h，分别测定酶解液中总糖、氨基态氮、可溶性氮和肽基氮含量。

酶解液肽分子质量分布：取6 份脱脂蚕蛹粉8 g配制成100 m L悬浊液，总酶添加量为1 g/100 g（0.5 g/100 g风味蛋白酶＋0.5 g/100 g碱性蛋白酶，以脱脂蚕蛹粉计），pH值为7.0，置于50 ℃水浴分别酶解1、3、5、7、9、12 h，分别测定酶解液的分子质量分布。

氨基酸释放规律：取6 份脱脂蚕蛹粉8 g配制成100 m L悬浊液，总酶添加量为1 g/100 g（0.5 g/100 g风味蛋白酶＋0.5 g/100 g碱性蛋白酶，以脱脂蚕蛹粉计），pH值为7.0，置于50 ℃水浴分别酶解1、3、5、7、9、12 h，分别测定酶解液的游离氨基酸、总氨基酸组成及含量。

酶解液的鲜味相关性分析：采用最小二乘法进行线性拟合，研究酶解1、3、5、7、9、12 h后酶解产物的鲜味和氨基酸及肽分子质量之间的关系。

1.3.3 指标测定

采用甲醛电位滴定法[17]测定酶解液的游离氨态氮含量（以氮计），以蒸馏水为空白对照，取2 g酶解液，加入蒸馏水至80 g，以0.1 m o l/L的NaOH溶液滴定至pH 8.2，加入10 m L甲醛，继续滴定至pH 9.2，得样品组和空白对照组加入甲醛后消耗的NaOH溶液体积V及V0。

酶解液总糖的测定采用苯酚-硫酸法[18]，采用总糖回收率表示：

酶解液可溶性氮质量分数测定：采用凯氏定氮法[18]测定酶解液上清液中总氮质量，以占酶解液上清液总质量百分比表示。

肽基氮质量分数测定：水解产物中肽基氮的质量分数=可溶性氮质量分数－氨基态氮质量分数。

游离氨基酸和总氨基酸组成及含量采用全自动氨基酸分析仪测定。游离氨基酸样品前处理方法如下：取400 μL样品，与100 μL的100 g/L磺基水杨酸溶液混匀，置于4 ℃冰箱静置60 m in后，10 000 r/m in（4 ℃）离心15 m in，取上清液，采用pH值为5.0的乙酸锂缓冲液稀释5倍，将最后的稀释样品经0.22 μm水系膜后经氨基酸自动分析仪测定；总氨基酸样品前处理方法如下：取1 m L酶解液加入6 mol/L的盐酸5 m L于水解管中，酒精喷灯封管后置烘箱中于110 ℃水解24 h，将水解样品过滤定容于25 m L或50 m L容量瓶中，吸取定容后的样品1～2 m L于干燥皿中放入烘箱干燥（60 ℃），底部留有少许固体或痕渍为止。加入1～2 m L样品缓冲液，通过0.22 μm过滤器过滤后，上机分析。肽类氨基酸的含量为总氨基酸含量和游离氨基酸含量的差值。

感官评价：参照Su Guowan等[19]的方法稍加修改进行感官评价。评定小组由15 位经训练的专业人员组成，对酶解液进行感官评定，评定成员每评定一个样品前用蒸馏水漱口，取待评定样品2～3 m L置于口中，10 s后吐出，漱口之后取参比液品尝，鲜味参比样为谷氨酸钠溶液，其中设定参比液的3 种质量分数（0.1%、0.2%、0.3%）对应的分值分别为4、6、8。根据酶解液的鲜味与参比样接近程度评分。

1.3.4 肽分子质量分布的测定

采用凝胶过滤色谱法测定。色谱条件：高效液相色谱，TSK gel G2000SWXL分析柱（300 mm×7. 8 mm，25 μm）；流动相：V（0.1%三氟乙酸）∶V（乙腈）= 80∶20；流速0.5 m L/m in；进样体积10 μL；检测波长220 nm。肽标准品分子质量对数值与洗脱时间拟合直线方程为y=－3.232x＋29.98（R²=0.998，其中y为标准肽分子质量的对数；x为洗脱时间/m in）。

1.4 数据分析

每个数据均为3 次测定的平均值，采用SPSS 21.0统计分析软件分析实验数据，采用±s表示，用M icrosoft Excel进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 酶解脱脂蚕蛹蛋白条件分析

图1 不同酶解条件对脱脂蚕蛹蛋白水解效果的影响
Fig. 1 Effects o f various hyd ro lysis conditions on deg ree o f hyd ro lysis and senso ry score for um am i

由图1a可知，随着底物质量浓度的增加，水解度和鲜味呈现先上升后下降的趋势。在底物质量浓度为

8 g/100 m L时，脱脂蚕蛹蛋白水解度最大，酶解液的鲜味值最大。由图1b可知，随着总酶添加量的增加水解度呈上升趋势，当总酶添加量增加到1 g/100 g时，酶解液的鲜味稍微减弱。并且加酶量的增加，会相应的提高工艺成本，综合考虑选择1 g/100 g的总酶添加量。由图1c可知，在一定的底物和总酶添加量下，脱脂蚕蛹蛋白的水解度和鲜味随着温度的升高呈先上升后下降的趋势，当温度在50 ℃左右时水解度达到12.2%，鲜味评分达到7.5。当温度大于50 ℃，其水解度和酶解液的鲜味下降，可见酶对温度的敏感性，温度过高或过低不利于酶促反应。另外，由图1d可知，随着酶解时间的延长，脱脂蚕蛹蛋白逐渐被酶解，表现为其水解度的增大。当酶解时间在9 h左右，蛋白质水解度的增加减缓，此时蛋白水解度大约为13.4%，并且此时酶解液的鲜味较好。

2.2 酶解脱脂蚕蛹蛋白规律分析

2.2.1 酶解产物氮存在形式和总糖回收率的变化

图2 脱脂蚕蛹蛋白酶解产物的氮存在形式、总糖回收率变化
Fig. 2 Changes in existing form s o f nitrogen and total sugar recovery during enzym atic hyd ro lysis

从图2可以看出，氨基态氮随着时间的延长而增加，总糖的回收率也是呈现增加的趋势。这说明蛋白酶一直在作用于蚕蛹蛋白，将蚕蛹蛋白酶解成小分子肽和和游离氨基酸，并且使脱脂蚕蛹中的糖逐渐被释放出来。氨基态氮在1～9 h有着明显的增加趋势，而在9 h以后增加趋势变的较为缓慢，这说明随着酶解的进行，酶活力可能会不断的下降，并且酶解产物的大量积累也会对酶解产生一定的反馈抑制作用使酶解速率下降并达到一个平衡的状态。总糖对酶解液的呈味有着重要的影响，糖可以提高酶解液的甜味，并且很好地掩盖其他一些杂味，或与其他物质相互作用影响酶解液整体风味[20]。唐胜等[12]研究小麦深度酶解过程中呈味物质的变化，发现蛋白回收率和氨基酸转化率是逐渐增加，总糖含量先缓慢增加，后期逐渐下降，而本研究酶解过程中总糖变化规律，总糖的回收率呈现平缓增长的趋势，在酶解的后期总糖回收率最高，可能是由于酶解时间的延长，酶同时作用于酶解的大分子肽和蛋白产生了较好的总糖累积效应。

2.2.2 酶解过程中肽分子质量分布变化规律

表1 脱脂蚕蛹蛋白酶解液中肽分子质量的分布
Tab le 1 Mo lecu lar m ass distribution o f pep tides in defatted silkw orm pupa p rotein hyd ro lysates
%

分子质量mw/k D 1 h 3 h 5 h 7 h 9 h 12 h＞10 3.45 2.11 1.19 0.04 0.05 0.02 5＜mw＜10 3.12 2.61 1.48 1.22 1.16 0.96 3＜mw＜5 5.50 4.13 4.80 3.56 3.35 3.08 1＜mw＜3 21.85 23.08 22.55 22.76 21.95 21.84＜1 66.07 68.07 69.97 72.42 73.49 74.10

由表1可以看出，随着酶解的进行，大分子肽逐渐减少，小分子肽逐渐增多。酶解产物的肽分子质量都集中在小于3 kD以下。在酶解12 h内，大于5 kD肽整体含量比较少，并且随着酶解时间的延长，大分子的肽也逐渐的减少，其中在酶解7 h后大于10 kD的大分子肽几乎没有。其中1～3 kD分子质量的肽是呈先增加后减少的趋势，这是因为随着酶解的进行蚕蛹蛋白开始不断地被酶解，酶解后期这部分肽也不断地被大量酶解成更小的肽和氨基酸，所以酶解液的鲜味逐渐增强。小于1 kD的小分子肽的含量随着酶解的进行开始快速的增加，9 h后增加速度较为缓慢，并且在酶解液中的比例较多；酶解液的鲜味在9 h前增加速度较快，其对酶解液的鲜味贡献比较突出。小分子多肽通常具有鲜味和浓厚感等口感特性，这些具有滋味的活性肽，通常分子质量小于5 kD[21]。分子质量小于5 kD的肽组分能够与舌头味蕾上的味觉受体相互作用。所以本实验研究小于5 kD的小分子质量肽含量与鲜味之间的相关性。林峰等[22]研究分子质量在1 kD以下的低聚肽样品的品质评价，发现食源性低聚肽粉产品含有较多比例的二肽和三肽，其生物效价和营养价值会较高。

2.2.3 酶解过程游离氨基酸的释放特点

由表2可以看出，从整个酶解过程来看，脱脂蚕蛹的酶解产物游离氨基酸种类齐全，营养丰富，大部分氨基酸含量都是随着酶解时间的延长不断地增加。在酶解产物中游离的鲜味氨基酸（G lu、Asp）在整个酶解的过程中总含量最少，然而在蚕蛹蛋白中的鲜味氨基酸含量是最多的，这说明鲜味氨基酸不是本实验所选酶的酶切位点，并且这些鲜味氨基酸大部分都是以肽的形式存在于酶解液，这样更加有利于所生成的肽具有鲜味的可能性。酶解产物中苦味游离氨基酸是最多的，一些苦味的游离氨基酸达到相应呈味阈值，说明这些苦味氨基酸对酶解液的滋味产生一定的影响，有增强酶解液的呈味复杂性[23]；其次这些苦味氨基酸以肽的形式存在较少。在有鲜味的酶解液中，鲜味游离氨基酸没有达到呈味阈值，这说明酶解液中的还存在其他的鲜味物质或与酶解液中的肽类物质相互作用，提高了酶解液的鲜味。

表2 酶解过程中游离氨基酸的组成分析
Tab le 2 Free am ino acid com position o f the hyd ro lysates m g/g

滋味氨基酸呈味阈值游离氨基酸含量1 h 3 h 5 h 7 h 9 h 12 h鲜味天冬氨酸Asp 0.3 0.056 0.103 0.150 0.193 0.220 0.298谷氨酸Glu 1.0 0.065 0.130 0.174 0.185 0.200 0.216小计0.121 0.233 0.324 0.378 0.420 0.514甜味苏氨酸Thr 2.6 0.644 0.799 0.885 0.968 1.055 1.148丝氨酸Ser 1.5 0.288 0.424 0.520 0.581 0.628 0.644甘氨酸Gly 1.3 0.112 0.134 0.149 0.152 0.167 0.178丙氨酸Ala 0.6 0.146 0.240 0.312 0.349 0.407 0.454小计1.190 1.597 1.866 2.050 2.257 2.424苦味缬氨酸Val 0.4 0.033 0.045 0.061 0.068 0.069 0.070异亮氨酸Ile 0.9 0.181 0.322 0.423 0.504 0.591 0.693亮氨酸Leu 1.9 0.361 0.691 0.917 1.111 1.241 1.443苯丙氨酸Phe 0.9 0.220 0.432 0.593 0.725 0.831 0.985组氨酸His 0.2 0.554 0.657 0.714 0.779 0.822 0.870精氨酸Arg 0.5 0.288 0.479 0.636 0.747 0.784 0.655蛋氨酸Met 0.3 0.145 0.228 0.284 0.341 0.376 0.433小计1.782 2.854 3.628 4.275 4.714 5.149甜味和苦味赖氨酸Lys 0.5 0.411 0.749 1.004 1.149 1.394 1.107脯氨酸Pro 3.0 0.207 0.247 0.253 0.291 0.303 0.324小计0.618 0.996 1.257 1.44 1.697 1.431无味半胱氨酸Cys 0.492 0.836 1.074 1.252 1.401 1.609酪氨酸Tyr 0.442 0.660 0.823 0.977 1.062 1.237小计0.934 1.496 1.897 2.229 2.463 2.846

为了更好地反映脱脂蚕蛹在酶解过程中的游离氨基酸释放的规律，通过聚类分析研究在酶解过程中16 种游离氨基酸的分类情况。聚类分析后，在酶解过程中，发现这些游离氨基酸分为两大类，其中一类氨基酸（Thr、His、Leu、Tyr、Lys、Cys）占有总游离氨基酸含量的60%左右，也是酶解过程中的主要游离氨基酸，这类氨基酸的增长趋势完全与总氨基酸的增加趋势一致，并且这类氨基酸的增长速率大于其他氨基酸，而其他氨基酸的增长速率较为缓慢，这说明这类氨基酸的很可能是所选酶的酶切位点。从主要的氨基酸增长趋势来看，在1～3 h时，游离氨基酸的增长速度最快，3～9 h时增长减缓，但增长速率维持在一个平缓的阶段，9～12 h时游离氨基酸的增长速度再次减缓，这可能是在酶解过程中，酶解第1阶段有足够的酶解底物，所以酶解的游离氨基酸增长速率很快；酶解第2阶段可能是酶主要作用于酶解第1阶段的一些大分子肽，并且酶活可能有所下降，所以酶解第2阶段保持在一个平稳的增长速率；酶解第3阶段，可能是由于酶解底物的减少造成酶解速率再次下降。酶解过程中，组氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸的含量高于其呈味阈值，对酶解液的滋味贡献比较大，增强酶解液的整体风味[24]。研究发现苦味氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸，其含量低于呈味阈值时，可增强其他氨基酸的鲜味和甜味[25]。

2.2.4 酶解过程肽类氨基酸的释放特点

表3 酶解过程中肽类氨基酸的组成分析
Tab le 3 Pep tide-derived am ino acid com position o f the hyd ro lysates mg/g

注：碱性氨基酸：精氨酸、赖氨酸、组氨酸；疏水性氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸；亲水性氨基酸：苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、酪氨酸。

滋味氨基酸肽类氨基酸含量1 h 3 h 5 h 7 h 9 h 12 h鲜味天冬氨酸Asp 1.773 2.189 2.292 3.024 2.950 3.228谷氨酸Glu 2.567 3.319 3.051 4.646 4.761 5.155小计4.340 5.508 5.343 7.670 7.711 8.383甜味苏氨酸Thr 0.282 0.305 0.283 0.661 0.417 0.463丝氨酸Ser 0.808 0.860 0.775 1.301 1.044 1.114甘氨酸Gly 0.888 1.069 1.034 1.289 1.334 1.511丙氨酸A la 0.920 1.081 0.995 1.037 1.060 1.043小计2.898 3.315 3.087 4.288 3.855 4.131苦味缬氨酸Val 0.924 1.142 1.225 1.820 1.741 2.081异亮氨酸Ile 0.407 0.352 0.196 0.583 0.624 0.692亮氨酸Leu 0.787 0.564 0.385 0.692 0.572 0.596苯丙氨酸Phe 0.505 0.580 0.475 0.716 0.647 0.683组氨酸His 0.415 0.409 0.316 0.600 0.553 0.563精氨酸Arg 1.356 1.689 2.076 2.263 2.274 1.788蛋氨酸Met 0.112 0.222 0.128 0.236 0.362 0.824小计4.506 4.958 4.801 6.910 6.773 7.227甜味和苦味赖氨酸Lys 0.968 0.986 0.813 1.309 1.118 1.668脯氨酸Pro 0.867 1.095 1.213 3.566 3.944 4.485小计1.835 2.081 2.026 4.875 5.062 6.153无味半胱氨酸Cys 0.039 0.324 0.543 0.430 0.869 0.783酪氨酸Tyr 0.616 0.631 0.488 0.836 0.915 0.993小计0.655 0.955 1.031 1.266 1.784 1.776碱性氨基酸2.739 3.084 3.205 4.172 3.945 4.019疏水性氨基酸4.522 5.036 4.617 8.650 8.950 10.404亲水性氨基酸2.633 3.189 3.123 4.517 4.579 4.864

由表3可以看出，在酶解过程中，肽类氨基酸都是随着酶解时间的延长不断地增加。在肽类氨基酸中鲜味氨基酸含量最多，得到的酶解产物中肽类的碱性氨基酸（正电荷分子团）和亲水性氨基酸（鲜味肽的助味基团）的含量非常接近。王丽华等[26]研究谷朊粉鲜味肽的呈味规律发现肽的鲜味与谷氨酸含量并不成正相关关系，肽的鲜味是由碱性氨基酸和酸性氨基酸的共同作用。在酶解过程中，同样通过聚类分析发现，肽类氨基酸分为两大类，其中一类肽类氨基酸（Asp、Glu、Pro、Arg）占总肽类氨基酸的50%，这类氨基酸是酶解过程中主要肽类氨基酸，这些氨基酸主要是鲜甜味的氨基酸。鲜味肽通常都含有谷氨酸残基或天冬氨酸残基[27]。

主要的肽类氨基酸在1～5 h增长速度较为平缓；5～7 h肽类氨基酸的增长速度加快，这是由于酶解时间的延长，蛋白被酶解成多肽；7～12 h又维持较为缓慢的增长，这是由于大分子肽又进一步被酶解成更小的肽和氨基酸。其中天冬氨酸和谷氨酸在酶解1 h时的含量大于酶解12 h时的非主要氨基酸的含量，这说明这两种鲜味氨基酸在肽类氨基酸中是最多的，并且在酶解液中的含量和鲜味逐渐增加的趋势一致。

2.2.5 酶解产物的肽分子质量及氨基酸组分与鲜味相关性分析

图3 酶解液的鲜味相关性分析
Fig. 3 Correlation analysis betw een senso ry score for um am i and am ino acid conten ts

在酶解过程中，蚕蛹蛋白逐渐被水解成小分子肽和游离氨基酸。其中氨基酸有两种类型存在于酶解液中：游离氨基酸和未被水解的蛋白或肽中。不同酶的酶解位点对酶解液中不同滋味游离氨基酸的含量和比例有显著的影响，从而影响了酶解液的风味。酶解液中小分子多肽也存在甜、酸、苦、咸、鲜5 种基本滋味，还可以产生浓厚感，而一些多肽还可以呈现两种或以上的味觉。酶解液中肽类氨基酸的序列以及组成对肽的滋味有显著地影响[28]。鲜味肽的鲜味与不同肽分子质量的比例有着密切的关系。Rhyu等[29]从韩国豆酱中采用水提法获得了不同鲜味的分离组分，且发现鲜味最强的分离组分中肽分子质量在500～1 000 D，主要影响豆酱的风味。为了更好探究酶解产物特性与其鲜味之间的关系，本研究酶解产物的鲜味与小于5 kD的肽含量、游离氨基酸、肽类氨基酸之间的线性相关性。由图3可知，肽类氨基酸的含量与鲜味之间的线性相关性比游离氨基酸的含量与鲜味之间的线性相关性好，其中肽类鲜味氨基酸的含量与酶解液的鲜味有最好的线性相关性。在酶解产物中，分子质量小于5 kD的肽含量、游离和肽类鲜味氨基酸含量都与鲜味呈正相关，这是因为小分子质量肽容易与味觉受体作用，而大分子质量肽或蛋白不能很好地与味觉受体结合[30]。从不同因素和酶解液的鲜味线性相关性来看，主要肽类氨基酸的含量和鲜味有较好的线性相关性（R²=0.936），所以主要肽类氨基酸适合作为呈味特性的指标。

3 结 论

脱脂蚕蛹蛋白酶解条件的研究表明，酶解的最适底物质量浓度8 g/100 m L、温度50 ℃、总酶添加量1 g/100 g（以脱脂蚕蛹粉计）、酶解时间9 h。在酶解过程中促进了总糖的释放，并且可溶性氮主要是以肽氮的形式存在。在酶解过程中，分子质量在1～3 kD的肽占比在90%左右，酶解产物中分子质量小于1 kD的肽大量积累。酶解液的鲜味是一个复杂的呈味结果，其鲜味强弱与其分子质量大小、氨基酸组成有关系。酶解产物中肽类氨基酸的含量与酶解液的鲜味有较好的线性相关性，而肽的结构与鲜味的关系仍待进一步研究。

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Variations in Um am i Am ino Acids o f Defatted Silkw o rm Pupa Pro tein du ring Enzym atic Hyd ro lysis

YANG Bo1, LIU Xiao ling1, ZHAO Moum ing1,2,*
(1. Co llege o f Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2. Co llege o f Food Science and Engineering, South China University o f Techno logy, Guangzhou 510640, China)

Abstract:In this study, alcalase and flavourzyme were applied in combination at a ratio of 1:1 to hydrolyze defatted silkworm pupa protein and the hydrolysates collected at different hydrolysis times were assayed for total sugar, am ino nitrogen, soluble nitrogen, peptide nitrogen and peptide and amino acid compositions. The results showed that the optimum concentration of substrate, temperature, enzyme dosage (relative to the mass of defatted silkworm pupa protein pow der) and hydrolysis time were 8 g/100 m L, 50 ℃, 1 g/100 g, and 9 h, respectively. The enzymatic process promoted the release of total sugar. Nitrogen was mainly existed in the form of peptide nitrogen, and the molecular masses of most peptides in the hydrolysates were lower than 1 kD. The main free am ino acids in the hydrolysates were threonine, histidine, leucine, tyrosine, lysine and cysteine, accounting for about 60% of the total free am ino acid content, and they contributed to the taste of the hydrolysates. Umam i and sweet am ino acids accounted for approximately 50% of the total am ino acids in the hydrolysates w ith a ratio of hydrophilic to alkaline am ino acid of about 1. The contents of peptide-derived amino acids were strongly linearly correlated w ith the umam i of the hydrolsates..

Key words:reeling silkworm pupa; enzymatic hydrolysis; umam i peptide; am ino acids; taste characteristics

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718019

中图分类号：TS251.1

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2017）18-0119-07引文格式：

杨波, 刘小玲, 赵谋明. 酶解脱脂蚕蛹蛋白过程中鲜味规律研究[J]. 食品科学, 2017, 38(18): 119-125.

DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201718019. http://www.spkx.net.cn

YANG Bo, LIU Xiao ling, ZHAO Moum ing. Variations in um am i am ino acids o f defatted silkworm pupa p rotein during enzym atic hyd ro lysis[J]. Food Science, 2017, 38(18): 119-125. (in Chinese w ith Eng lish abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718019. http://www.spkx.net.cn

收稿日期：2016-11-23

基金项目：广西自然科学基金项目（2016GXNSFEA380003）

作者简介：杨波（1991—），男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-m ail：1424468388@qq.com

*通信作者：赵谋明（1964—），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术、蛋白质化学与工程、海洋资源综合利用。E-m ail：femm zhao@scut.edu.cn