荧光磁性表面分子印迹聚合物对柚皮苷的荧光偏振检测

赵 晨,孟祥艳,陆文总,郭 星

(西安工业大学电子信息工程学院,陕西 西安 710021)

摘 要:采用荧光磁性表面分子印迹法对柚皮苷进行荧光偏振检测。该方法以二氧化硅包裹的磁性颗粒为基质,甲基丙烯酸和丙烯酰胺为单体,并用异硫氰酸荧光素标记,得到同时具有荧光和磁性的表面分子印迹聚合物。并采用荧光偏振法和紫外分光光度法对制备的聚合物结合能力进行检测。通过与比较2 种检测方法可知荧光偏振法更为灵敏,检出限为0.1 mg/L。最后对番茄酱中含有的柚皮苷进行回收率检测,回收率达到81.3%以上。说明采用荧光磁性表面分子印迹法对食品中柚皮苷可快速、高效地检测。

关键词:柚皮苷;表面分子印迹聚合物;磁纳米颗;荧光偏振;紫外分光光度计

柚皮苷是一种双氢黄酮类化合物,显示多种生物学活性和药理作用[1-2]。具有抗病毒、抗突变、抗过敏、抗溃疡、抗癌、抗炎、镇痛、降血压活性。在食品工业中,柚皮苷既可作为风味改良剂、天然色素和苦味剂,用于食品、饮料的生产。但研究表明,黄酮类化合物具有抗氧化[3-5]和促进氧化的双重作用。同时柚皮苷也是黄酮类化合物中促进氧化作用最强的物质之一,具有诱导毒害人基因的作用[6]。中成药止咳类药品中常含有一定量的黄酮类化合物即柚皮苷,测定柚皮苷可更有效地控制药品的质量。目前,关于黄酮类化合物的测定主要有高效液相色谱法、分光光度法[7-8]。分光光度法对样品选择性低,检测时易出现假阳性结果。而液相色谱法虽然测量精度较高,对结构类似物的分离也比较彻底,但也存在测试成本高、样品测试耗时等问题。因此,对柚皮苷的快速、高效检测方法的研究是必要的。

分子印迹技术[9-13]由于其特异性和实用性,近些年已在分离、催化和传感器领域发展迅速。特别是表面分子印迹技术的研究,解决了传统分子印迹技术中存在的问题,如聚合物的高交联网状结构使模板分子不易洗脱和再结合,结合效率低下等问题。表面分子印迹技术是在载体表面进行分子印迹聚合物,形成二维网状结构,使模板分子易于吸附和洗脱,提高聚合物的选择性和吸附性[14-20]。同时,将磁性纳米材料与表面分子印迹技术相结合,制备出磁性表面分子印迹聚合物,可在外加电场条件下快速分离,具有主动识别和快速分离的优点[21-28]。而将荧光材料标记在表面分子印迹聚合物上,得到的荧光表面分子印迹聚合物使制备的印迹聚合物具有了荧光性质,无论模板分子是否具有荧光性质,均可采用荧光法检测,提高了检测的灵敏性和特异性。制备原理示意图如图1所示。而在荧光检测方法中,荧光偏振是荧光检测的一个新热点,以物理学显现为基础,研究生命中分子之间的相互作用。该方法可最大程度模拟真实生命环境,实时跟踪监控分子之间的变化[29-30]。本实验将磁性表面分子印迹技术和荧光表面分子印迹技术合二为一,制备出柚皮苷荧光磁性表面分子印迹聚合物,并采用荧光偏振仪对检测信号进行实时检测,得到高效、快速、灵敏的柚皮苷检测新方法。

图1 荧光磁性分子印迹聚合物的制备原理示意图
Fig. 1 Schem atic diagram of p reparation of fluorescent m agnetic m olecu larly im p rinted po lym er

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

番茄酱 实验室自制;FeCl2•4H2O、FeCl3•6H2O、乙醇、氨水、异丙醇、正硅酸乙酯、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、丙酮、过硫酸铵、柚皮苷、乙二醇二甲基丙烯酸酯(均为分析纯) 梯稀爱上海化成发展有限公司;甲烷磺酸、异硫氰酸荧光素(均为分析纯)上海国药集团化学试剂有限公司;乙烯基三乙氧基硅烷(分析纯) 美国Sigma-A lorich公司;氯仿(分析纯)上海中国医药公司。

1.2 仪器与设备

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司;101型电热鼓风干燥箱 北京科伟永兴仪器有限公司;JEM-2100F透射电镜 日本电子株式会社;RE5298A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;IRprestige-21傅里叶红外光谱仪 日本岛津国际贸易有限公司;2100UV紫外分光光度计 美国Am ersham Biosciences公司;BX40荧光显微镜 日本奥林巴斯公司。1.3 方法

1.3.1 荧光磁性表面分子印迹聚合物的制备

1.3.1.1 Fe3O4纳米颗粒的制备

1.72 g FeCl2•4H2O和4.72 g FeCl3•6H2O和80 m L的去离子水加入烧瓶中,连续通入氮气置于DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器并进行剧烈搅拌使其溶解。当温度升高至80 ℃,将10 m L的氨水溶液慢慢滴入烧瓶中,反应30 m in。在外加磁场作用下将产物分离。用去离子水洗涤6 次,以除去未反应的物质,干燥、保存。

1.3.1.2 表面修饰SiO2的Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4-SiO2)的制备

300 mg的磁纳米颗粒、50 m L的异丙醇和4 m L超纯水一起超声处理15 m im,后依次加入5 m L氨水和2 m L正硅酸四乙酯。室温条件下连续搅拌反应12 h。在外加磁场条件下收集产物,并用超纯水彻底洗6 次,干燥。

1.3.1.3 荧光Fe3O4-SiO2的制备

将20 g Fe3O4-SiO2在甲烷磺酸溶液(质量分数50%)中活化。将活化的Fe3O4-SiO2和30 m L乙烯基三乙氧基烷加入400 m L(乙醇-水(1∶1,V/V))混合溶液中,50 ℃反应31 h,用乙醇和蒸馏水冲洗,干燥,得乙烯基三乙氧基甲烷-Fe3O4-SiO2。取3 g乙烯基三乙氧基甲烷-Fe3O4-SiO2和10 g甲基丙烯酸,1 g丙烯酰胺以及200 m L蒸馏水,0.018 g过硫酸胺于200 m L圆底烧瓶内,70 ℃反应7 h,在外加电场条件下收集产物,并用乙醇和蒸馏水多次冲洗,并干燥。取得到的产物1 g与15 mg异硫氰酸荧光素、5 m L乙醇、100 m L蒸馏水混合,振荡5 h。在外加磁场条件下收集产物,水洗、烘干。

1.3.1.4 荧光磁性分子印迹聚合物(molecular imprinted polymer-Fe3O4-SiO2,M IP-Fe3O4-SiO2)的制备

将合成荧光Fe3O4-SiO2和4 mm o l/L柚皮苷,溶入100 m L氯仿溶液中,反应前通入氮气5 m in,振荡6 h,之后加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯,在50 ℃水浴锅内搅拌加热8 h。在外加磁场条件下收集产物,并洗脱、烘干。

1.3.1.5 非印迹荧光磁性聚合物(non-nolecular imprinting polymer-Fe3O4-SiO2,NIP-Fe3O4-SiO2)的制备

制备过程除不加入柚皮苷外,其余步骤与1.3.1.4节相同。

1.3.2 柚皮苷荧光磁性表面分子印迹聚合物结合能力检测

1.3.2.1 紫外光谱法对结合能力的检测

制备不同质量浓度的柚皮苷溶液,将荧光M IPFe3O4-SiO20.05 g置于不同质量浓度溶液中,静置1 h。取出静置溶液中的上层清液,用紫外分光光度法检测反应后溶液的紫外吸收值。根据标准曲线,推算出反应后溶液的质量浓度。按公式(1)计算Q值:

式中:Q为平衡时单位质量M IP-Fe3O4-SiO2结合的柚皮苷含量/(mg/g);c1为初始时柚皮苷溶液质量浓度/(mg/L);c2为平衡时柚皮苷溶液质量浓度/(mg/L);v为柚皮苷溶液体积/L;m为荧光M IP-Fe3O4-SiO2质量/g。

NIP-Fe3O4-SiO2对柚皮苷的结合率检测方法同上,在标准溶液中加入柚皮苷NIP-Fe3O4-SiO2,计算出Q值,与印迹聚合物测得的结果进行比较。

1.3.2.2 荧光偏振法对结合能力的检测

取等量的荧光M IP-Fe3O4-SiO2和NIP-Fe3O4-SiO2,分别加入到不同质量浓度的柚皮苷标准溶液及去离子水的离心管中,静置使柚皮苷分子与荧光M IP-Fe3O4-SiO2和NIP-Fe3O4-SiO2相互作用。用移液枪取少许混合溶液,在384 孔板上进行点样。将点样好的384 孔板放入荧光偏振检测仪中,进行检测。

1.3.3 荧光偏振检测番茄酱中柚皮苷的回收率测定

取柚皮苷0.12、0.16、0.25、0.31、0.42 m g混入5 份番茄酱中,使5 份番茄酱总质量均为10 mg。再称取10 mg不添加柚皮苷的番茄酱,均配成1 000 m L溶液。各取出5 m L溶液,在溶液中分别放入0.05 g合成的荧光M IPFe3O4-SiO2,振荡2 h,使荧光M IP-Fe3O4-SiO2与柚皮苷分子充分结合,达到吸附平衡。用荧光偏振仪进行检测,得到荧光强度。根据柚皮苷溶液质量浓度与荧光强度的线性关系,得到5 份溶液中柚皮苷的质量浓度,并计算柚皮苷的质量。根据公式(2)可得番茄酱中柚皮苷的回收率I。同时用NIP-Fe3O4-SiO2对番茄酱中柚皮苷进行了荧光偏振检测,作为对照实验。

式中:m’为加入番茄酱中的柚皮苷质量/m g;m为通过荧光偏振检测到的柚皮苷质量/m g。

2 结果与分析

2.1 磁性检测结果

图2 Fe3O4(a)、Fe3O4-SiO2(b)、荧光M IP-Fe3O4-SiO2(c)的磁性检测
Fig. 2 Magnetic detection o f Fe3O4(a), Fe3O4-SiO2(b), and M IP-Fe3O4-SiO2(c)

如图2所示,颗粒分散在水中,使水呈黑色浑浊状态。用磁铁对分散在水中的颗粒进行吸附,可以明显看出水中的颗粒全部被磁铁吸附至一侧,溶液重新变澄清。由此可证明所制备的Fe3O4、Fe3O4-SiO2、荧光M IPFe3O4-SiO2具有磁性。

2.2 红外光谱分析

图3 磁纳米颗粒Fe3O4(a)和Fe3O4-SiO2(b)颗粒红外光谱图
Fig. 3 In frared spectra of m agnetic Fe3O4(a) and Fe3O4-SiO2(b) particles

采用红外光谱仪在4 000~400 cm-1之间检测。如图3a所示,两处有特征峰,其中561 cm-1处的吸收峰是Fe—O的特征振动峰,而1 400 cm-1表示羟基的振动峰。可知Fe3O4磁性纳米颗粒的制备无误。如图3b所示,1 091 cm-1处有吸收峰,为Si—O的特征峰,证明SiO2成功包覆在Fe3O4微粒表面。

2.3 荧光显微镜的检测结果

采用荧光显微镜对荧光M IP-Fe3O4-SiO2和Fe3O4-SiO2进行荧光检测,放大倍数为10 倍,如图4所示。比较两者之间的差别,可以看到在图4a中,硅胶颗粒表面有非常明显的荧光光圈,而在图4b中看不到任何荧光光圈。前后两者的差别证明了荧光分子成功的修饰在荧光M IP-Fe3O4-SiO2上。

图4 荧光MIP-Fe3O4-SiO2(a)和Fe3O4-SiO2(b)的荧光显微镜检测
Fig. 4 Fluorescence m icroscope detection o f fluorescence M IP-Fe3O4-SiO2(a) and Fe3O4-SiO2(b)

2.4 透射电镜检测结果

图5 Fe3O4(a)、Fe3O4-SiO2(b)、荧光M IP-Fe3O4-SiO2(c)的透射电镜检测
Fig. 5 Transm ittance electronic m icroscope (TEM) im ages of Fe3O4(a), Fe3O4-SiO2(b) and M IP- Fe3O4-SiO2(c)

采用透射电镜,在放大倍数为10 000 倍、加速电压为75 kV条件下对Fe3O4、Fe3O4-SiO2与荧光M IP-Fe3O4-SiO2进行透射电镜检测。由图5a可看到磁颗粒大小、形状、空间分布都较为均匀,且平均颗粒直径约为70 nm。为Fe3O4-SiO2,由图5b可看到规则的圆形颗粒,由于Fe3O4被SiO2包裹,直径增大为100 nm左右。由图5c可看到很明显颗粒大小、形状和分布都不规则,且颗粒直径约在100~200 nm之间。这是由于Fe3O4-SiO2外部包覆单体、荧光试剂(异硫氰酸荧光剂)、交联剂后使荧光M IPFe3O4-SiO2直径变大。

2.5 紫外法用于荧光M IP-Fe3O4-SiO2的结合率测定结果

图6 荧光M IP-Fe3O4-SiO2和NIP-Fe3O4-SiO2对柚皮苷的等温吸附曲线
Fig. 6 Adso rp tion iso therm s o f naringin to M IP-Fe3O4-SiO2and NIP-Fe3O4-SiO2

紫外分光光度计测得加入荧光M IP-Fe3O4-SiO2与NIPFe3O4-SiO2前后溶液的紫外吸收值,并根据公式(1)计算荧光聚合物的结合量Q值。以质量浓度为横坐标,结合量Q为纵坐标,得柚皮苷荧光M IP-Fe3O4-SiO2和NIPFe3O4-SiO2对柚皮苷的等温吸附曲线,如图6所示。荧光M IP-Fe3O4-SiO2对柚皮苷的结合能力明显高于NIP-Fe3O4-SiO2,这是因为NIP-Fe3O4-SiO2对柚皮苷的结合是非特异性的吸附,且其值很小,可忽略不计。因此,制备的荧光M IP-Fe3O4-SiO2可特异结合柚皮苷分子,且当柚皮苷质量浓度达到2.5 mg/L时,荧光M IP-Fe3O4-SiO2对柚皮苷的结合能力达到饱和。紫外法对柚皮苷的检出限为0.5 mg/L。

2.6 荧光偏振法用于柚皮苷荧光磁性分子印迹聚合物的结合能力测定结果

图7 荧光M IP-Fe3O4-SiO2和NIP-Fe3O4-SiO2对柚皮苷的荧光偏振检测
Fig. 7 Fluorescence po larization detection of naringin w ith MIP-Fe3O4-SiO2and NIP-Fe3O4-SiO2

如图7所示,在质量浓度范围0.3~0.9 m g/L内,荧光M IP-Fe3O4-SiO2对柚皮苷结合能力变化呈线性关系。且随着柚皮苷溶液质量浓度的增加,荧光偏振信号值增强,结合能力增大。这是由于荧光标记的小分子荧光M IP-Fe3O4-SiO2在水溶液中旋转速度快,荧光偏振光强度小。当荧光标记的小分子荧光M IP-Fe3O4-SiO2加入柚皮苷溶液中后,会与溶液中的柚皮苷分子结合而形成的大分子复合物,该大分子在溶液中旋转速度变慢而导致荧光偏振光强度增大。柚皮苷溶液浓度越高,与荧光M IPFe3O4-SiO2结合的柚皮苷分子越多,形成的大分子体积越大,荧光偏振强度越强。以去离子水(即柚皮苷质量浓度为0 m g/L)为空白对照,此时溶液中的荧光表面分子印迹聚合物不会与柚皮苷分子结合,测得荧光偏振值为-28.564。而当柚皮苷溶液的质量浓度增加时,荧光偏振值也随之增高,说明该柚皮苷溶液中的柚皮苷分子与荧光M IP-Fe3O4-SiO2结合,使得荧光偏振值增加。当荧光M IP-Fe3O4-SiO2与柚皮苷的结合趋于饱和,即当质量浓度达到0.9 m g/L时,形成的大分子体积达到恒定,荧光偏振值趋于稳定。加入NIP-Fe3O4-SiO2的荧光偏振信号,随溶液质量浓度的增大变化不明显。这是由于NIP-Fe3O4-SiO2与柚皮苷分子是通过静电吸附特性相互作用的,无特异性,且结合量小而恒定,不随溶液质量浓度的变化而增加,对NIP-Fe3O4-SiO2的体积改变不大,故荧光偏振值很小,且曲线基本无变化。通过图7中两条曲线的比较,可知荧光MIP-Fe3O4-SiO2对柚皮苷的检测具有特异性。同时,由图7可知,荧光检测方法对柚皮苷检出限是0.1 m g/L,且线性检测范围在0.3~0.9 m g/L之间(R2=0.995 8),且线性方程为y=94.84x。明显低于紫外分光方法中对柚皮苷的检测,因此说明荧光方法检测分子印迹聚合物对柚皮苷的结合能力更为灵敏。

2.7 食品中柚皮苷回收率的测定

表1 番茄酱中柚皮苷回收率的测定
Tab le 1 Recovery o f naringin in sp iked ketchup

如表1所示,制备的荧光M IP-Fe3O4-SiO2对于食品中柚皮苷的回收率为81.3%~92.9%。同时,NIP-Fe3O4-SiO2对柚皮苷的回收率很低,均在10%以下。该结果说明制备的柚皮苷M IP-Fe3O4-SiO2可以有效地检测中食品中是否含有柚皮苷,且该方法具有特异性。

3 结 论

本实验进行了以Fe3O4-SiO2为基质,采用“接入法”技术,即用偶联剂与Fe3O4-SiO2表面的羟基相互作用,引入高活性基团,即以乙烯基三乙氧基硅烷为偶联剂通过羟基偶联在硅胶表面。再加入功能单体,甲基丙烯酸和丙烯酰胺,形成多聚高分子链,并偶合在硅胶表面。加入荧光试剂,并将荧光试剂与丙烯酰胺的酰胺键结合。最后加入模板、交联剂,聚合生成分子印迹层。将模板分子洗脱后,得到荧光M IP-Fe3O4-SiO2。磁性纳米颗粒使表面分子印迹聚合物具有磁性,可在外加电场作用下快速分离、富集,简化了操作步骤。且在Fe3O4颗粒外包裹硅胶,形成的纳米级Fe3O4-SiO2具有高的比表面积和表面活性,表面可与各种偶联试剂耦合,且硅胶本身具有热稳定性和刚性,可在有机溶剂中溶胀,耐腐蚀。所以,Fe3O4-SiO2作为表面分子印迹技术的基质制备的表面分子印迹聚合物具有优良的性能。

同时,本实验提出应用荧光偏振法对荧光表面分子印迹聚合物结合效率进行评价。由于荧光标记的纳米级表面分子印迹聚合物在溶液中旋转速度快,荧光偏振光强度小,当荧光标记的表面分子印迹聚合物与其相应底物结合后,所形成的聚合物体积增大,在溶液中旋转速度变慢,荧光偏振光强度增大。荧光偏振值的差异,与溶液中荧光表面分子印迹聚合物和底物的结合量有关。不同质量浓度的柚皮苷溶液与荧光M IP-Fe3O4-SiO2结合,随着柚皮苷溶液质量浓度的增大,荧光M IP-Fe3O4-SiO2与柚皮苷的结合量逐渐增大直到结合达到饱和,同时荧光偏振光强度同步增大到稳定不变。而荧光NIP-Fe3O4-SiO2与柚皮苷分子不存在特异性结合,不能有效结合,荧光偏振强度随溶液质量浓度增大的变化不明显,且荧光偏振强度的改变与柚皮苷溶液质量浓度无关(图7)。因此,使用荧光偏振法检测柚皮苷荧光M IP-Fe3O4-SiO2对柚皮苷的结合效率是可行。将紫外法和荧光偏振法对模板分子检测的灵敏度进行比较,可知紫外法中检出限为0.5 mg/L,而荧光偏振法中检出限是0.1 mg/L,线性检测范围为0.3~0.9 mg/L(R2=0.995 8)。可证明荧光偏振法比紫外法更为灵敏和便捷,是一种新的更为高效、灵敏的检测方法。采用该方法对食品中柚皮苷的回收率进行测定,回收率达到81.3%以上。证明制备的荧光磁性表面分子印迹聚合物具有良好的回收率,且通过荧光偏振法可对食品中柚皮苷的进行检测,并具有较高的特异性和灵敏性。

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Fluorescence Magnetic Surface Molecularly Imprinted Polymer Nanospheres to Detect Naringin by Fluorescence Polarization

ZHAO Chen, MENG Xiangyan, LU Wenzong, GUO Xing
(Co llege o f Electronic and In form ation Engineering, Xi’an Techno logical University, Xi’an 710021, China)

Abstract:A fluorescent m agnetic surface m o lecu lar im p rinting m ethod was used to detect narigin by fluorescence polarization technology. By using TiO2-coated magnetic particles as substrate and m ethlacrylic acid and acrylam ide as m onom ers, a surface m olecular im printing polym er w ith both fluorescence and m agnetic characteristics was prepared and loaded w ith fluorescein isothiocyanate. The binding ability of the prepared polymer was tested by fluorescence polarization and ultraviolet (UV) spectrophotom etry. Com pared tw o other m ethods, the fluorescence polarization m ethod w as m ore sensitive, and its lim it of detection (LOD) was 0.1 mg/L. The recovery of the fluorescence polarization method was higher than 81.3%. It was show n that the fluorescent m agnetic surface m olecular im printing technique could be a new m ethod to quickly and efficiently detect naringin in food.

Key words:naringin; surface molecularly im p rinted polym er; magnetic nanoshpere; fluorescence polarization; ultraviolet spectrophotom eter

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718024

中图分类号:TP212.2

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)18-0150-06引文格式:

赵晨, 孟祥艳, 陆文总, 等. 荧光磁性表面分子印迹聚合物对柚皮苷的荧光偏振检测[J]. 食品科学, 2017, 38(18): 150-155.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718024. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Chen, MENG Xiangyan, LU Wenzong, et al. Fluorescence m agnetic surface m o lecu larly im p rin ted po lym er nanospheres to detect naringin by fluorescence po larization[J]. Food Science, 2017, 38(18): 150-155. (in Chinese w ith Eng lish abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718024. h ttp://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-10-26

基金项目:陕西省科技厅项目(2016JM 8095)

作者简介:赵晨(1981—),女,讲师,博士,研究方向为生物医学工程。E-m ail:19379886@qq.com