图1 番茄红素及番茄酱红外图谱
Fig. 1 IR spectra o f lycopene and ketchup
庄 洋1，田盼盼2，夏冬梅3，单长海4，陈美林1，程 超1，汪兴平1,*
（1.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院科技学院，湖北 恩施 445000；3.秭归帝元食品罐头股份有限公司，湖北 秭归 443600；4.恩施土家族苗族自治州食品药品检验检测中心，湖北 恩施 445000）
摘 要：利用衰减全反射红外光谱法测定番茄酱中番茄红素，选择1 700～950 cm－1作为样品的红外光谱分析波段，用二阶导数对原始红外光谱降噪后，进行偏最小二乘法回归分析，建立了回归方程，模型决定系数R2为0.970。经验证，其相对预测均方根误差为3.78，预测值与真实值的线性拟合决定系数为0.959 8，能较准确测定番茄酱中番茄红素含量。
关键词：衰减全反射红外光谱；番茄红素；建模；测定
番茄酱是鲜番茄的酱状浓缩制品。在北美、欧盟等发达国家中鲜食番茄和加工番茄的比例在6∶4，甚至5∶5。番茄红素是番茄酱中具有重要生理功能的天然色素，是衡量其品质的重要因子，具有抗氧化、清除自由基、有效防治肿瘤和心脑血管疾病、延缓衰老、提高免疫力的能力[1-4]。因此，准确测定番茄红素的含量在环境科学、生物医学及食品科学研究中是十分重要的。
目前，番茄红素的测定方法主要是高效液相色谱法和分光光度法，不仅需要标准样品定量，而且需要从样品中提取番茄红素后再进行色谱分离检测，并要标准品定量，方法繁琐，试剂消耗量大，难以做到快速准确的检测。我国番茄酱罐头推荐标准GB/T 14215—2008《番茄酱罐头》中关于番茄红素测定方法中采用苏丹Ⅰ替代番茄红素标准样品。所以探讨不用或者少用标准样品，而且高效准确的番茄红素测定方法是一个实际又紧迫的学术问题。近年来，红外检测技术在食品[5-7]、药品[8-10]领域得到快速发展，其中，衰减全反射-中红外光谱法因不需制样、操作简便快速、灵敏度高而被视为很有前途的分析方法[11]。传统的红外检测是选择特征波长进行定量分析，会造成信息的遗失，且实验样本通常是复杂的体系，红外光谱是多种物质或基团的叠加吸收，干扰较大。因此，通常结合红外光谱全谱或筛选波段和化学计量法[12]建立数学模型来实现样品的快速测定。李波霞[13]利用红外光谱和化学计量学建立了党参、当归的分类模型及当归醇提物和阿魏酸的定量模型，所建立的定性模型能很好地鉴别党参、当归的产地，定量模型能有效预测醇提物和阿魏酸的含量；殷秀秀[14]利用红外光谱技术解决了牛奶中尿素和葡萄糖掺假问题，定量模型能有效预测蛋白质、脂肪和乳糖含量；马兰[15]利用近红外法建立了番茄可溶性固形物、总糖、总酸、VC等内部品质指标的定量模型，结果表明建立模型预测的番茄品质结果与化学测定结果之间没有显著差异。
已有研究表明，影响红外定量测定结果准确性的因素较多，但主要因素是建模方法[16]。定量建模分析方法主要有多元线性回归、主成分回归、偏最小二乘回归等[17]。交叉验证方法主要分为3 种：简单交叉验证[18]、留一交叉验证[19]和V折交叉验证[20]。
本研究利用衰减全反射红外光谱对番茄红素进行测定，选取特征波段，利用SPSS软件进行因子分析、主成分逐步回归建立回归方程，以验证集进行检验，建立番茄酱中番茄红素快速准确的检测方法。
1.1 材料与试剂
番茄酱 湖北秭归帝元罐头食品股份公司。
甲基叔丁基醚、甲醇、乙酸乙酯（均为色谱纯）美国M reda公司；番茄红素标准品（含量85%） 美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Vertex70/80傅里叶变换中红外光谱仪、A531Q1E/Q衰减全反射附件 德国Bruker公司；RE-2000B旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；S21-3磁力搅拌仪 上海司乐仪器有限公司；NBS-Ⅱ氮吹仪 美国Abson公司；MDF-U52V超低温冰箱 日本三洋公司。
1.3 方法
1.3.1 番茄红素的提取[19-21]
准确称取0.6 g番茄酱置于10 m L具塞试管中，加入6 m L正己烷-丙酮-乙醇（2∶1∶1，V/V）混合溶液，2 500 r/m in旋涡混匀60 s，再加入1 m L水，2 500 r/m in旋涡混匀30 s。静置5 m in，取上层正己烷层，反复提取3 次，合并正己烷层，N2吹干，用4 m L乙酸乙酯溶解番茄红素，过0.22 μm滤膜后，充N2密封，置于－76 ℃冰箱备用。
1.3.2 番茄酱中番茄红素含量的测定
采用GB/T 14215—2008中分光光度法测定。
1.3.3 样品制备
采用国标推荐法测定番茄酱中番茄红素，并以现有番茄酱样品中的番茄红素含量为基点（含量测定为35 mg/100 g），分别通过添加和稀释调节样品含量，准备90 个不同含量的番茄酱样品。
高浓度番茄红素不同含量（35～70 mg/100 g）样品配制：准确称取300 g番茄酱，按1.3.1节方法提取番茄红素，旋蒸后加入到300 g番茄酱中，研磨均匀，得到番茄红素含量为70 mg/100 g的母样，取70 mg/100 g母样和含量为35 mg/100 g的番茄酱原酱样按比例混合，研磨均匀即系列含不同含量番茄红素样品。
低含量番茄红素（7～35 mg/100 g）样品配制：配制可溶性固形物含量与番茄酱原酱一致的淀粉蔗糖水溶液（约为1.8 g蔗糖/10 m L），将淀粉蔗糖溶液和含量为35 mg/100 g的番茄酱原酱样按比例混合，搅拌均匀即得样品。
1.3.4 红外光谱数据的采集
采集条件：光谱扫描范围4 000～650 cm－1，扫描16 次，扫描间隔2 cm－1。
2.1 番茄红素红外光谱测定
图1 番茄红素及番茄酱红外图谱
Fig. 1 IR spectra o f lycopene and ketchup
为了收集番茄酱中番茄红素的红外波谱信息，利用傅里叶变换中红外光谱仪对番茄酱和番茄红素标准样品进行红外扫描，如图1所示。番茄红素在1 700～950 cm－1的波段内结构信息丰富，是测定番茄红素含量的重要波区。从番茄酱图谱可见其红外吸收信息同样集中在1 700～950 cm－1，因此选择1 700～950 cm－1作为样品的红外光谱分析波段。但是由于番茄酱是一个复杂的食品体系，物质成分复杂，番茄红素的结构信息被严重掩盖，因此不能采用单一吸收峰来测定其含量，应该尝试红外分析与化学计量法结合测定其含量。
选取1 700～950 cm－1波段，为减少分析工作量和不影响分析结果，每2 个波段取一个值进行分析，利用SPSS进行因子分析，得到回归方程。除噪的方法选用一阶求导和二阶求导，一阶求导可以消除光谱中扁平的基线，二阶求导可以消除光谱中倾斜的基线[22]。由于导数在消除背景干扰的同时，会损失一些低频信息导致随机误差放大，因此本实验只求一阶和二阶导数。模型评价主要通过模型决定系数R2、拟合决定系数R2、预测值与理论值的相对预测均方根误差（relative prediction mean square error，RMSEP）[23]进行，模型决定系数R2越接近1越好，RMSEP和相对偏差越小越好。
2.2 利用训练集建立番茄红素测定模型
将所有的样品（1～90号样）中随机抽27 组数据作为验证集，剩下的作为训练集进行建模，经数据精简，最终共取得195 组波段数据。将这195 组数据作原始数据、一阶求导除噪数据和二阶求导除噪数据建模，得到模型回归方程，其特征参数见表1。
表1 不同处理数据拟合比较
Tab le 1 Com parison o f data fitting w ith d ifferen t p retreatm en ts
由表1可知，利用SPSS软件分析，得出很多主成分，再经逐步回归分析，结果显示只有其中少数几个主成分对番茄红素的测定影响达到了显著水平，因此，建模时只需要用到显著影响主成分。分析显示，经求导数处理后参与建模的主成分为6 个，而原始光谱建模的主成分只有3 个。在确定主成分个数的基础上建立了相应的多元回归方程，由二阶导数分析获得的回归方程模型决定系数R2最高，为0.970，一阶导数分析对应的R2略小，为0.961，而原始光谱数据分析对应的R2远小于前二者，为0.870。为了更好地验证所建模型的优劣，对验证集数据进行验算。
2.3 利用验证集验证模型
分别利用上述3 个多元回归方程，计算验证集番茄红素的预测含量并与其真实含量比较，计算出预测相对偏差和RMSEP。如表2所示，以二阶导数建立的多元回归方程预测相对偏差较小，比较而言，相对偏差大于10%、15%、20%的几率都最小，相对偏差大于20%的几率仅为7.41%，其总体RMSEP最低，为3.78。因此拟合决定系数R2、模型预测偏差、RMSEP都充分说明使用二阶求导处理后所得的回归方程能够更好的描述番茄红素的含量曲线，且预测性能最好。
表2 模型预测相对偏差
Tab le 2 Relative deviations o f m odel p red iction
2.4 3 个模型预测值与真实值的拟合效果
图2 原始数据（A）、一阶导数数据（B）和二阶导数数据（C）拟合
Fig. 2 Original data (A), first order derivative data (B), and tw o order derivative data fitting (C)
为了更好、更直观地判断3 个模型预测的总体效果，将验证集中的模型预测值与其真实值进行拟合作图，如图2所示。图中实线是完全拟合时理想拟合线，表明预测值与真实值没有偏差；虚线为预测值与真实值的实际拟合线，可以看出，使用原始数据进行拟合后，点的离散程度较大，预测出现较大偏差。经一阶求导和二阶求导处理后，点的离散程度变小，各点均匀分步在预测线两侧。相对而言，二阶求导处理的拟合效果最好，各点更紧密的分散在预测线附近，且实际拟合线基本与理想拟合线重合。此外3 个模型相应的拟合决定系数R2分别为0.859 6、0.927 9、0.959 8。因此，图2中直观效果及拟合决定系数R2都说明二阶导数建模预测效果最好。
研究表明，在中红外区域，采用衰减全反射红外光谱定量测定番茄酱中番茄红素的方法是可行的。选择1 700～950 cm－1作为样品的红外光谱分析波段，对采集到的红外光谱数据，用二阶导数降噪后，将样品分为训练集和验证集，用训练集数据进行偏最小二乘法回归分析，建立了测定番茄红素含量的回归方程为Y=1.096＋0.309F1－0.386F2－0.066F3－0.139F5－0.056F6＋0.072F11，其模型决定系数R2为0.970。用此方程对验证集样品进行含量预测，其RMSEP为3.78，预测值与真实值的线性拟合决定系数为0.959 8，预测效果达到仪器分析的基本要求。
样品制备精准，建模效果和预测效果将显著改善。本实验的最初研究中，为了准确测定样品中番茄红素的含量，采用了高效液相色谱法。具体操作时通过添加番茄红素以及稀释现有产品的方法，准备了100 个含有不同番茄红素的系列样品，然后再通过提取和高效液相色谱法测定，但是测定结果符合预期的非常少，通过预判筛选，只留下33 个可用的样品，模型决定系数达到0.95，验证相对偏差为6.6%～30.3%。这些数据虽然说明该研究方法基本可行，但是由于预筛了样品，所以仍令人担心该法的准确度。因此在接下来的重复研究中，采用GB/T 14215—2008法对材料中番茄红素含量进行测定，然后将一份材料中的番茄红素精确提取，准确添加到另一份材料中制备出高含量的番茄酱，以高含量番茄酱、普通番茄酱和纯净水，调制含不同番茄红素的样品，从而减少了测定真值时在提取和测定过程中可能产生的误差。以此法制备的样品未经任何筛选，全部用来进行建模和验证，结果表明效果很好。
本实验充分验证了红外光谱建模预测番茄红素含量的可行性，该方法操作简单、快速、结果准确，而且绿色无污染，是一个非常有前途的番茄红素测定方法。尤其是不需要繁琐的样品准备过程，测定结果影响因素较少，测定结果重复性高、分析效率高。由于红外技术的这些特点，近年来在农业、食品、化工、制药、石油、纺织及生物医学等领域都有广泛的研究[24-30]。相信红外技术将更广泛应用于化学成分的定量测定。
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Determ ination o f Lycopene in Ketchup Using Attenuated Total Reflection In frared Spectroscopy
ZHUANG Yang1, TIAN Panpan2, XIA Dongm ei3, SHAN Changhai4, CHEN Meilin1, CHENG Chao1, WANG Xingp ing1,*
(1. Co llege o f Bio logical Science and Techno logy, Hubei University fo r Nationalities, Enshi 445000, China; 2. Co llege o f Science and Techno logy, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China; 3. Zigui Diyuan Canned Food Co. Ltd., Zigui 443600, China; 4. Enshi Autonom ous Prefecture o f M iao and Tu jia Nationalities Center for Food and Drug Con tro l, Enshi 445000, China)
Abstract:In this study, the feasibility of using attenuated total ref l ection infrared spectroscopy to determ ine lycopene in ketchup was exam ined. The results obtained were as the follow s: The wavenumber region between 1 700 and 950 cm-1was chosen for the infrared spectrum analysis of samples and the spectrum data were analyzed by partial least squares regression after denoising using the 2ndderivative pretreatment. A regression equation was established w ith a coeff i cient of determination of 0.970, and the root mean square error of prediction of the model was 3.78. The coeff i cient of determination of linear fi tting between the predicted and real values was 0.959 8, suggesting that the regression equation can accurately predict the content of lycopene in ketchup.
Key words:attenuated total ref l ectance infrared spectroscopy; lycopene; modeling; determ ination
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718026
中图分类号：TS255.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）18-0163-05引文格式：
庄洋, 田盼盼, 夏冬梅, 等. 衰减全反射红外光谱测定番茄酱中番茄红素[J]. 食品科学, 2017, 38(18): 163-167.
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718026. http://www.spkx.net.cn
ZHUANG Yang, TIAN Panpan, XIA Dongm ei, et al. Determ ination of lycopene in ketchup using attenuated total reflection infrared spectroscopy[J]. Food Science, 2017, 38(18): 163-167. (in Chinese w ith Eng lish abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718026. h ttp://www.spkx.net.cn
收稿日期：2017-03-12
基金项目：宜昌市科学技术研究与开发项目（A15-203）
作者简介：庄洋（1990—），男，硕士研究生，主要从事林特食品加工与开发研究。E-m ail：550376410@qq.com
*通信作者：汪兴平（1963—），男，教授，博士，主要从事食品加工及天然产物化学研究。E-m ail：hbm yw xp@163.com