王 立1,2，邹 烨2,*，张 坤3，于 海1,*
（1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；3.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210023）
摘 要：以鸭肝为原料，以NaOH溶液为提取剂，采用超声辅助提取，通过响应面分析方法优化鸭肝蛋白提取工艺条件，并比较常规碱提和超声辅助碱提鸭肝蛋白的抗氧化性能。结果显示，鸭肝蛋白的最佳提取条件为超声功率256 W、超声时间43 m in、pH 11，此时鸭肝蛋白的得率达到73.1%；抗氧化实验结果表明：超声提取鸭肝蛋白清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhyd razyl，DPPH）自由基、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazo line-6-su lphonate) free radical，ABTS＋·）、羟自由基IC50值分别为1.97、0.168、0.529 m g/m L，其中鸭肝蛋白对ABTS＋·清除效果较强，其还原力较高；与常规碱提蛋白相比，超声辅助碱提鸭肝蛋白的抗氧化能力提高显著（P＜0.05）。因此，超声辅助碱提鸭肝蛋白具有较好的抗氧化性。该研究为鸭肝的深加工提供了的一定的科学依据。
关键词：鸭肝蛋白；超声辅助碱提；响应面；抗氧化
动物肝脏是一种营养丰富的食品，富含蛋白质、脂肪、糖类、维生素和矿物质[1]。肝脏不仅是一种优质完全蛋白质源，含有多种人体必需氨基酸，且比例适当[2]，同时还含大量的超氧化物歧化酶等，具有明显的抗脂质氧化作用[3]，从而保护细胞和组织不受损伤，在一定程度上具有防止肿瘤发生[4]、抗衰老[5]、提高机体免疫力的作用[6]，具有很高的应用价值。鸭肝属鸭科动物家鸭的肝脏，根据氨基酸营养评价[7]，其中苯丙氨酸的含量最高。此外，鸭肝富含锌、铁、硒等矿物质元素[8]。根据营养质量指标[9]，其中铁元素含量最高。此外锌、硒等元素含量较高，其中硒是重要的营养物质，具有预防心血管等重要功能[10]。目前蛋白质的提取方法一般多为碱提酸沉法。张耀兮[11]用碱提酸沉法提取牦牛肝蛋白的提取条件为NaOH质量分数1%、料液比1∶5、浸提时间60 m in、提取温度40 ℃、酸沉条件p H 4.0，牦牛肝蛋白得率为77.91%。本实验采用超声辅助碱法提取鸭肝蛋白，超声是一种新颖、简单、绿色、安全、快速的技术，具有提取时间短、得率高、溶剂用量少等优点，适用于食品来源的蛋白质提取[12-13]。虽然鸭肝的营养价值较高，但到目前为止，对鸭肝蛋白的深加工提取及生物活性研究鲜见报道。
本实验以新鲜鸭肝为原料，以NaOH溶液为提取剂，采用超声辅助碱提法提取鸭肝蛋白，考察不同超声功率、超声时间、超声温度、料液比、pH值对鸭肝蛋白得率的影响。在单因素试验基础上，通过响应面分析方法优化提取工艺，并进一步比较常规碱提和超声辅助碱提所得鸭肝蛋白的抗氧化性，对鸭肝蛋白的深加工提供一定的科学依据。
1.1 材料与试剂
鸭肝 南京市孝陵卫农贸市场。
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d ip h en y l-2-p icrylhyd razyl，DPPH） 美国Sigm a公司；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS） 萨恩化学技术（上海）有限公司；考马斯亮兰 南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
HH-8数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；T25DS25高速粉碎机 德国IKA公司；LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；Uncen MR台式冷冻离心机 德国Hero Lab公司；M 124A电子天平意大利Bel公司；pH计 美国奥豪斯公司；UV-6100型分光光度计 上海美普达仪器有限公司；DGG-9023A电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 鸭肝蛋白提取工艺流程
超声辅助提取：新鲜鸭肝（2 g）→切丁→匀浆（10 000 r /m in匀浆2 次，每次20 s，间隔10 s）→异丙醇脱脂（10%，静置12 h）→离心（5 000×g，10 m in）→干燥→超声辅助提取（超声功率：50～300 W；超声时间：10～60 m in；温度：20～70 ℃；料液比1∶30～1∶80；pH 9～13）→离心（5 000×g，15 m in）→取上清液→测吸光度（BCA试剂盒）→计算鸭肝蛋白质量浓度→其余粗提物→调至等电点（p H 4.5）→离心（13 400×g，30 m in）→得沉淀→蒸馏水洗至pH值中性→真空冷冻干燥→鸭肝蛋白粗品。
常规碱提：新鲜鸭肝（2 g）→切丁→匀浆（10 000 r /m in 匀浆2次，每次20 s，间隔10 s）→异丙醇脱脂（10%，静置12 h）→离心（5 000×g，10 m in）→干燥→常规提取（时间10～60 m in；温度：20～70 ℃；料液比1∶30～1∶80；p H 9～13）→离心（5 000×g，15 m in）→取上清液→测吸光度（BCA试剂盒）→计算鸭肝蛋白质量浓度→其余粗提物→调至等电点（pH 4.5）→离心（13 400×g，30 m in）→得沉淀→蒸馏水洗至pH值中性→真空冷冻干燥→鸭肝蛋白粗品。
1.3.2 鸭肝蛋白得率计算
1.3.3 超声辅助碱提优化试验设计
1.3.3.1 单因素试验
按工艺流程方法提取鸭肝蛋白，选取超声功率（50、100、150、200、250、300 W）、超声时间（10、20、30、40、50、60 m in）、料液比（1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80）、超声温度（20、30、40、50、60、70、80 ℃）以及pH值（9、10、11、12、13）几个因素进行单因素试验，探究各因素对鸭肝蛋白得率的影响。
1.3.3.2 响应面优化试验
在单因素试验的基础上，选择超声功率、超声时间、pH值3 个因素，以蛋白得率为响应值，根据Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken法设计响应面试验方案，其相应的因素与水平设计见表1。
表1 Box-Behnken试验因素和水平
Tab le 1 Factors and levels used in Box-Behnken design
1.3.4 鸭肝蛋白的抗氧化性实验
1.3.4.1 还原力的测定
不同质量浓度（1～6 m g/m L）样品中分别加入1 m L磷酸盐缓冲溶液（0.2 m o l/L，pH 6.6）和2 m L 1%铁氰化钾溶液，置于50 ℃水浴中反应20 m in，然后加入2 m L 10%的三氯乙酸溶液，摇匀，室温反应10 m in，吸取上清液1.5 m L加入1 m L蒸馏水和0.2 m L 0.1%的三氯化铁溶液，混合均匀，室温反应10 m in，于波长700 nm处测定吸光度[14]；VC作阳性对照。
1.3.4.2 DPPH自由基清除率的测定
蛋白水解物用去离子水溶解后配成质量浓度为1～6 m g/m L。用95%乙醇溶液现配0.1 mm o l/L的DPPH溶液，等量1 m L的样品液加入1 m L的乙醇，再加入1 m L的DPPH溶液于比色皿中。振动混匀后在37 ℃水浴中避光反应0.5 h。于波长517 nm处测吸光度A1。乙醇作为空白测定吸光度A2[15]。VC作阳性对照。DPPH自由基清除率计算如式（2）所示：
1.3.4.3 ABTS＋·清除率的测定
ABTS溶液的配制：取0.1 g ABTS和0.029 g过硫酸钾溶于100 m L磷酸盐缓冲液，混合后于25 ℃避光反应16 h备用，实验时取2 m L该反应液，加入18 m L磷酸盐缓冲液，配成ABTS储备液，避光保存当日备用。ABTS储备液再用磷酸盐缓冲液稀释，于波长734 nm处测吸光度在0.85左右，即为ABTS工作液，当日现配使用。
测定方法：分别取0.1 m L样品液，加入3.9 m L ABTS工作液，混合均匀。混合液于室温静置10 m in，于波长734 nm处测定吸光度A1，以试样溶剂代替样品溶液测定空白吸光度A0，以磷酸盐缓冲液代替ABTS工作液测得吸光度A2[16]，实验平行做3 次，VC作阳性对照。ABTS＋·清除率计算如式（3）所示：
1.3.4.4 羟自由基清除能力的测定
试管中分别加入0.5 m L水杨酸-乙醇溶液、0.5 m L FeSO4溶液、0.5 m L样品溶液和1 m L H2O2溶液。混匀后在室温反应10 m in，于波长510 nm处测定吸光度A1。取0.5 m L蒸馏水代替FeSO4溶液，测得吸光度A2，取0.5 m L蒸馏水代替蛋白溶液，测得空白吸光度A0[17]。VC作阳性对照。羟自由基清除率计算如式（4）所示：
1.4 数据分析
采用SPSS 16.0进行显著性（P＜0.05）分析，Origin 8.0、Design-Expert 8.0.6 作图。
2.1 单因素试验结果
图1 超声功率（A）、超声时间（B）、料液比（C）、超声温度（D）、pH值（E）对鸭肝蛋白得率的影响
Fig. 1 Effect of ultrasonic power (A), exposure time (B), material-to-liquid ratio (C), tem perature (D), and pH (E) on the yield of duck liver protein
如图1A所示，随着超声功率的增大，蛋白得率提高显著，在250 W处出现最大值，表明超声功率越高，获得声强越大[18]。但随着功率的增大，得率反而降低，可能因为过高频率的超声波“空化作用”[19]，使蛋白降解导致鸭肝蛋白得率降低，因此选择超声功率为250 W。
如图1B所示，超声时间在10～40 m in时，蛋白得率呈现逐渐上升趋势，在40 m in处出现最大值。随着超声时间的延长，得率呈下降趋势，可能是超声时间过长使鸭肝蛋白产生高温，使部分蛋白造成降解[20]，因此选择超声时间为40 m in。
如图1C所示，随着溶剂用量增大，蛋白得率呈现逐渐增大后趋于平稳的趋势。当料液比达到1∶60，蛋白得率出现最大值，说明鸭肝蛋白基本提出，继续增大溶剂用量，蛋白得率趋于平衡。考虑试剂成本选择料液比为1∶60。
如图1D所示，随着超声温度的升高，蛋白得率呈上升趋势，在50 ℃出现最大值。再提高温度，得率反而下降。可能是温度过高破坏了鸭肝蛋白的结构完整性[21]，造成蛋白得率下降，因此选择超声温度为50 ℃。
如图1E所示，NaOH溶液在pH 9～11时蛋白得率不断提高，而pH 12～13时，蛋白得率逐渐降低，表明碱液浓度过大，不利于蛋白的提取，主要是由于高碱条件下蛋白变性及水解[22]，因此选择碱液的pH值为11。
2.2 Box-Behnken试验设计及结果
根据单因素试验结果，本研究通过响应面法中Box-Behnken试验设计对鸭肝蛋白提取工艺进行优化。超声功率、超声时间和pH值对鸭肝蛋白得率的影响较为显著，因此选取该3 个因素作为自变量，以鸭肝蛋白得率为响应值，进行三因素三水平Box-Behnken响应面优化试验，试验设计与结果如表2所示。
表2 Box-Behnken试验设计及结果
Tab le 2 Box-Behnken design w ith experim en tal resu lts
2.3 模型的建立及显著性分析
运用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行二次多元回归拟合，获得响应值与自变量的逻辑关系为：Y=73.02＋2.54A＋2.90B＋0.31C＋1.87AC－1.25AC＋2.58BC－11.23A2－5.16B2－4.83C2。
表3 多元回归模型及方差分析
Tab le 3 Analysis o f variance o f reg ression m odel
注：*. P＜0.05，差异显著；**. P＜0.01，差异极显著。
由表3可知，方程的一次项二次项、交互项对响应值鸭肝蛋白得率（Y）的影响均极显著。各因素之间均存在显著的交互作用。回归模型项极显著（P＜0.01），响应值的相关系数R2=0.999 8，说明模型拟合良好，表明通过该模型能够较好地对鸭肝蛋白的得率作出预测。调整相关系数R2Adj达到0.999 6，说明鸭肝蛋白的得率模型能够在99.996%的程度上解释试验结果。本实验模型的失拟项不显著（P＞0.05），进一步说明模型的拟合度较好。综上所述，回归模型拟合程度良好，试验误差小，能够准确分析和预测鸭肝蛋白得率。
2.4 交互作用分析
等高线的形状能够反映出交互项的强弱椭圆形表示交互显著，而圆形相反。而响应面图的陡峭程度可说明随着影响因素的变化，其响应值也随之变化[23]。图2显示了不同因素交互作用对鸭肝得率的等高线及响应面。从图2a可知，响应面图陡峭，表明超声功率和超声时间的交互作用对鸭肝蛋白的影响较大。从等高线图可知，超声时间对鸭肝蛋白得率的影响大于超声功率。从图2b可知，响应面图相对陡峭，表明超声功率和pH值的交互作用对鸭肝蛋白的影响相对交互项AB较小，从等高线图可知，超声功率对鸭肝蛋白得率的影响大于pH值。从图2c可知，BC较AB、AC图陡峭。表明超声时间与pH值的交互作用影响最大，从等高线图可知，超声时间对鸭肝蛋白得率的影响大于pH值。影响鸭肝蛋白得率的因素依次：超声时间＞超声功率＞pH值。
图2 各因素交互作用的等高线及响应面图
Fig. 2 Response su rface p lots show ing the in teractive effect o f th ree extraction cond itions on the yield o f duck liver p ro tein
2.5 优化提取参数和验证模型
通过响应面分析软件，超声碱提鸭肝蛋白最佳工艺为：超声功率256.72 W、超声时间43.3 m in、pH 11.10。考虑实验的可操作性，将提取工艺参数调整为超声功率256 W、超声时间43 m in、pH 11，此时鸭肝蛋白得率的预测值为73.685 6%，在上述条件下，进行3 次平行实验得到鸭肝蛋白的实际提取率为73.1%，与预测值非常接近，误差仅0.42%。常规碱提鸭肝蛋白得率为42.6%。超声碱提法所得的鸭肝蛋白得率显著高于常规碱提法（P＜0.05），结果显示采用超声碱提鸭肝蛋白是可行的[24]。
2.6 鸭肝蛋白的抗氧化性结果
图3 鸭肝蛋白还原力（A）及DPPH自由基（B）、ABTS＋·（C）、羟自由基清除活性（D）
Fig. 3 Free rad ical scavenging activity and reducing pow er o f duck liver p ro tein
两种提取方法所得的鸭肝蛋白对还原力、DPPH自由基、ABTS＋·、羟自由基清除能力的作用效果如图3所示。还原力是通过物质的还原作用，给出电子清除自由基，还原力越强，表明抗氧化性越强[15,25]。由图3A可知，鸭肝蛋白的还原力随着质量浓度的增大而增大。质量浓度为6 m g/m L时，超声碱提鸭肝蛋白还原力为0.714，常规提取鸭肝蛋白的还原力为0.642，两者的还原力具有显著性差异（P＜0.05）。李丹等[26]研究玉米和大豆的自由基清除活性和还原力。玉米的多肽质量浓度32 m g/m L时还原力为0.7，大豆多肽32 m g/m L时还原力不到0.6，表明超声碱提鸭肝蛋白的还原力均高于大豆和玉米多肽，具有较高的还原力。
从图3B可知，随着质量浓度增大，清除DPPH自由基能力增大。常规和超声鸭肝蛋白清除DPPH自由基的IC50值分别为3.576、1.97 m g/m L。质量浓度为6 m g/m L时，常规碱提鸭肝蛋白对DPPH自由基清除率为55.9%，超声碱提鸭肝蛋白对DPPH自由基清除率为72%，超声碱提蛋白清除DPPH自由基显著高于常规鸭肝蛋白（P＜0.05）。张宇等[27]从羊肝提取羊肝蛋白清除DPPH自由基的IC50值为14.452 m g/m L，表明超声碱提鸭肝蛋白具有较高清除DPPH自由基的能力。
ABTS＋·广泛用于样品的抗氧化能力，蛋白提取液与ABTS自由基反应使其褪色，吸光度越低，表明样品的抗氧化能力越强[28]。从图3C可知，常规和超声鸭肝蛋白清除ABTS＋·的IC50值分别为0.241、0.168 m g/m L，表明超声碱提鸭肝蛋白清除ABTS＋·的能力显著高于常规鸭肝蛋白（P＜0.05）。Mem arpoor-Yazd i等[29]从鸡蛋清分离的NYDGSTDYGILQINSR抗氧化多肽清除ABTS＋·的IC50值为1.35 m g/m L，表明超声碱提鸭肝蛋白具有较高清除ABTS＋·的能力。
羟自由基是一种危害较大的氧自由基，在生物体内能与蛋白质等物质发生反应，破坏这些物质活性的功能[30]。由图3D可知，鸭肝蛋白清除羟自由基的能力随蛋白质量浓度增大而增大。常规和超声鸭肝蛋白清除羟自由基的IC50值分别为0.878、0.529 m g/m L，两者具有显著性差异（P＜0.05）。张宇等[27]从羊肝中提取的羊肝蛋白清除羟自由基的IC50值为10.271 m g/m L，表明超声碱提鸭肝蛋白具有较高清除羟自由基的能力。以上抗氧化实验结果表明，超声辅助碱提鸭肝蛋白具有较强的还原力和DPPH自由基、ABTS＋·、羟自由基的清除能力，是一种潜在的抗氧化剂。
以蛋白得率为考察指标，通过单因素以及响应面优化实验，建立了超声辅助碱提鸭肝蛋白最佳提取工艺为超声功率256 W、超声时间43 m in、pH 11，影响超声碱提鸭肝蛋白得率的因素为超声时间＞超声功率＞pH值。经验证，超声辅助碱提鸭肝蛋白的得率达到73.1%。与常规碱提鸭肝蛋白（得率为42.6%）相比，超声辅助碱提法显著地提高了鸭肝蛋白的得率。
抗氧化实验结果表明：超声提取鸭肝蛋白清除DPPH自由基、ABTS＋·、羟自由基的IC50分别为1.97、0.168、0.529 m g/m L，其中超声提取鸭肝蛋白清除ABTS＋·的能力较强。与常规碱提法的蛋白相比，超声辅助碱提鸭肝蛋白的抗氧化能力有明显提高，表现出较好的抗氧化能力，可为鸭肝蛋白的精深加工利用提供参考。
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Op tim ization o f Ultrasonic-Assisted Alkaline Extraction o f Duck Liver Pro tein Using Response Su rface Methodo logy and Its Antioxidan t Activity
WANG Li1,2, ZOU Ye2,*, ZHANG Kun3, YU Hai1,*
(1. Schoo l o f Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China; 2. Institute o f Agricu ltural Products Processing, Jiangsu Academ y o f Ag ricu ltu ral Sciences, Nan jing 210014, China; 3. Co llege o f Food Science and Engineering, Nan jing University o f Finance and Econom ic, Nan jing 210023, China)
Abstract:The ultrasonic-assisted alkaline extraction of duck liver protein was op tim ized by response surface methodology, and the antioxidant activity of duck liver p rotein extracted w ith and w ithout ultrasonic treatm ent w as com pared. For the u ltrasonic-assisted extraction, the op tim um conditions were determ ined as follows: u ltrasonic power, 256 W; ultrasonic exposure tim e, 43 m in; and pH value, 11, where the m axim um yield of duck liver p rotein equal to 73.1% was achieved. Antioxidant activity tests showed that IC50values for scavenging of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate (ABTS+·) and hydroxyl free radicals were 1.97, 0.168 and 0.529 mg/m L of the ultrasonically extracted duck liver protein, respectively, suggesting stronger scavenging activity against ABTS+· than other free radicals, which also had high reducing pow er. Moreover, its antioxidant activity was significantly higher than that of the conventional alkaliextracted p rotein (P ＜ 0.05). The current study m ay p rovide a scientific basis for intensive p rocessing of duck liver.
Key words:duck liver p rotein; ultrasonic-assisted alkaline extraction; response surface m ethodology; antioxidant activity
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718035
中图分类号：TS209
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）18-0200-07
引文格式：
王立, 邹烨, 张坤, 等. 响应面试验优化超声辅助碱提鸭肝蛋白工艺及其抗氧化性能[J]. 食品科学, 2017, 38(18): 222-228.
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718035. h ttp://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-10-20
基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划课题（2014BAD04B11）；江苏省农业科技自主创新资金项目（CX（14）2117）；江苏省博士后科研资助计划项目（1601131C）
作者简介：王立（1990—），男，硕士研究生，主要从事农产品加工研究。E-m ail：247391269@qq.com
*通信作者：邹烨（1986—），女，助理研究员，博士，主要从事动物源食品加工与质量控制研究。E-mail：zouye_198661@126.com于海（1973—），男，教授，博士，主要从事农产品加工研究。E-m ail：haiyu0078@163.comWANG Li, ZOU Ye, ZHANG Kun, et al. Op tim ization of u ltrasonic-assisted alkaline extraction of duck liver p rotein using response surface m ethodology and its antioxidant activity[J]. Food Science, 2017, 38(18): 222-228. (in Chinese w ith English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718035. h ttp://www.spkx.net.cn