图1 实验所用ACP装置
Fig. 1 Schem atic illustration of the experim ental set-up em p loyed for ACP treatm ent of m ackerel
施姿鹤1，陈 静1,2,*，陈星洁1，黄 菊1,2，邓尚贵1,2
（1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江 舟山 316022；2.浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室，浙江 舟山 316000）
摘 要：为探究介质阻挡放电低温等离子体（atmospheric cold plasma，ACP）处理鲐鱼的杀菌效果以及在控制组胺含量中的作用，分别采用ACP直接处理和间接处理两种方式，分析鲐鱼菌落总数的变化，并通过响应面法中心组合设计优化了ACP杀菌的最佳处理电压和时间；在此基础上，探索ACP对鲐鱼贮藏过程中组胺含量以及与组胺产生有关的假单胞菌、肠杆菌、弧菌的影响。结果表明：直接处理对鲐鱼的杀菌效果更优，菌落总数降低率比间接处理高35.88%；最佳处理条件为处理电压59.9 kV、处理时间71.5 s；在优化条件下，鲐鱼菌落总数为1.83（lg（CFU/g）），与预测值1.86（lg（CFU/g））相差不大，所建模型与实际拟合较好；经ACP处理后的鲐鱼在贮藏期（14 d）内，假单胞菌、肠杆菌、弧菌的生长速率明显低于对照组；贮藏第8天时，假单胞菌、肠杆菌、弧菌的菌落数比对照组分别降低25.89%、46.23%和45.23%；组胺含量在贮藏期内增长较慢，第14天时含量为72.34 mg/100 g，低于国标限量。
关键词：鲐鱼；低温等离子体；响应面法；菌落总数；组胺含量
鲐鱼（Pneumatophorus japonicus），鲈形目，鲭科，鲐属，又名青花鱼、青占鱼，典型的远洋暖水性鱼类。鲐鱼在我国各个海域均有生产，其中以东海产量最多，伴随着大小黄鱼、带鱼资源的锐减，鲐鱼现已成为我国主要的经济鱼类之一[1]。鲐鱼因其营养价值、经济价值高深受消费者喜爱，但处理不当的鲐鱼极易发生腐败，产生有毒有害物质。新鲜鲐鱼中游离组氨酸的含量很高，当其死后游离的组氨酸在酶和微生物的共同作用下经组氨酸脱羧酶催化分解成大量的组胺。组胺能引起人体一系列的过敏和炎症反应，如食入过量组胺将危害人体健康，重者甚至危及生命。因此，对鲐鱼中组胺含量的控制具有重大意义。
目前，对水产品的组胺研究较多停留在组胺产生机制以及组胺中毒等方面，而对水产品中组胺含量的控制鲜见报道。抑制或者杀灭产组胺相关的微生物是水产品组胺含量控制的一个重要方式[2]。传统热力杀菌方式虽能有效杀灭细菌，但与此同时，鱼体内的物理化学性质发生改变，如蛋白质发生凝固变性，破坏了鱼体的原有风味及营养成分。随着人们对食品品质以及食品质量安全的关注度越来越高，探索新的安全无毒、天然高效的非热杀菌技术已成为现当下的研究热点。本实验研究介质阻挡放电低温等离子体（atmospheric cold plasma，ACP）对鲐鱼组胺含量及组胺产生菌的影响，以期获得一项能较好控制鲐鱼组胺含量的方法。ACP是一个能在室温甚至较低温度下产生带电粒子、紫外线、活性氧化物、氮化物等杀菌成分的复杂的物理、化学反应过程[3]。ACP通过其产生的杀菌成分破坏细菌细胞膜的通透性、组成完整性以及引起细菌蛋白质变性而导致其正常生理活动改变而达到杀菌的作用[4]。ACP具有杀菌时间短、杀菌效果好、处理温度低、无毒无残留、对食品原有品质保持好等传统热力杀菌无可比拟的优点，因而受到国内外学者的广泛关注[5]。目前，ACP技术已成功地应用于聚合物表面改性、水质消毒、医药领域、废气处理等方面，在食品方面的应用研究主要集中在食品杀菌、食品保鲜等，如ACP在美国、瑞士以及部分欧洲国家已成功应用于部分水果、蔬菜、坚果、谷物、蛋类、肉类及牛奶的杀菌与保鲜[5-8]。我国在ACP技术应用领域的研究主要集中在废气处理、医药研究等方面，ACP在食品领域的应用研究仍处于初始阶段[9-11]。本研究以鲐鱼为对象，通过优化ACP处理电压、处理时间两大关键因素，探讨ACP技术对鲐鱼杀菌效果以及对组胺产生菌的影响，从而达到降低鲐鱼组胺含量的目的，为鲐鱼食用和销售过程中组胺含量的控制提供一定的理论依据。
1.1 材料与试剂
新鲜鲐鱼购于舟山老碶菜场，平均体长22～25 mm，30 m in内以冰温运回实验室。
平板计数琼脂（plate count agar，PCA）、假单胞CFC选择性培养基（pseudomonas CFC selective agar，CFC）、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（violet red bile glucose agar，VRBG）、硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar，TCBS）青岛海博生物技术有限公司；组胺标准品、丹磺酰氯、氯化钠 国药化学试剂有限公司；实验用水均为蒸馏水。
1.2 仪器与设备
Phen ix BK 130/36 ACP处理仪 美国Phen ix Technologies有限公司；M AP-H360复合气调保鲜包装（modif i ed atmospheric packaging，MAP）机 苏州森瑞保鲜设备有限公司；HWSG恒温培养箱 宁波东南仪器有限公司；HS-1300超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 ACP设备及处理方式
实验所用ACP设备如图1所示。仪器采用介质阻挡放电（dielectric barrier discharge，DBD），该装置是由等离子体产生器（DBD-ACP）和交流电控制系统组成。其中DBD-ACP系统有两个直径为15 cm的铝电极（高压电极和接地电极），两个电极之间的距离为38 mm，放有200 mm×120 mm×36 mm的聚丙烯（polypropylene，PP）盒，该PP盒可用于MAP处理后进行ACP处理，也可直接放置待处理的样品。ACP系统的输入电压220 V、频率50 Hz可以产生高达130 kV的处理电压，本实验参考国内外研究文献以及实验安全问题（高电压容易击穿介质阻挡板，造成安全隐患）等因素，确定最高处理电压为70 kV。
图1 实验所用ACP装置
Fig. 1 Schem atic illustration of the experim ental set-up em p loyed for ACP treatm ent of m ackerel
在固定电压60 kV、处理时间60 s情况下，以直接处理和间接处理两种方式对鲐鱼进行ACP处理。其中直接处理采用将鲐鱼直接暴露在低温等离子区域中，间接处理采用将鲐鱼置于PP盒后进行MAP，根据Ruiz-Capillas[12]、Emborg[13]等研究，选取不同CO2/O2/N2体积比（2∶3∶1、3∶3∶2、2∶2∶1、3∶2∶1）对已在4 ℃冰箱中保存5 d的鲐鱼进行MAP处理，然后再置于低温等离子区域，同时以未处理的样品作为对照。菌落总数的测定方法参照GB 4789.2—2010《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》[14]。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 处理电压对鲐鱼杀菌效果的影响
在固定处理时间45 s的情况下，对在4 ℃冰箱贮藏5 d的鲐鱼分别进行20、30、40、50、60、70 kV电压的ACP处理后，取5 g鲐鱼鱼肉进行菌落总数计数。
1.3.2.2 处理时间对鲐鱼表面杀菌效果的影响
在固定电压40 kV的情况下，对在4 ℃冰箱贮藏5 d的鲐鱼分别进行15、30、45、60、75 s的ACP处理后，取5 g鲐鱼鱼肉进行菌落总数计数。
1.3.3 响应面试验优化
采用Design-Expert 8.0.6软件中的中心组合设计试验。根据单因素试验结果，选择处理时间（A）、处理电压（B）2 个因素，以鲐鱼菌落总数为响应值，设计两因素三水平响应面优化试验。响应面试验各因素及水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Tab le 1 Factors and levels used in response surface design
1.3.4 ACP处理对产组胺相关微生物的影响
以响应面优化后的最佳处理时间和处理电压，对新鲜鲐鱼进行ACP处理，同时以未处理的鲐鱼作为对照。将鲐鱼贮藏于4 ℃的冰箱中，每隔2 d取样一次，分别于VRBG、TCBS、CFC培养基上进行菌落计数。
根据样品的腐败程度选取合适稀释度的稀释液，取0.1 m L于无菌平皿中，将冷却至46 ℃左右的VRBG培养基倾注，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后进行肠杆菌的计数。另取0.1 m L上述稀释液，分别涂布于TCBS、CFC培养基上，其中TCBS于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后进行弧菌计数，CFC于25 ℃恒温培养箱中培养48 h后进行假单胞菌计数。
1.3.5 低温等离子处理对鲐鱼组胺含量的影响
取1.3.4节中的鲐鱼，同时进行组胺含量的测定。组胺含量的测定方法参照GB/T 20768—2006《鱼和虾中有毒生物胺的测定 液相色谱-紫外检测法》[15]。
1.4 数据分析
所得数据均用Origin pro 8.5软件作图，通过SPSS 22.0软件进行结果统计分析，实验结果为±s。
2.1 处理方式对鲐鱼杀菌效果的影响
图2 处理方式对鲐鱼菌落总数的影响
Fig. 2 Effect o f p rocessing m ode on TVC o f m ackerel
从图2可以看出，ACP处理后，鲐鱼菌落总数均有减少。其中，MAP后进行ACP处理的鲐鱼菌落总数随着CO2含量的增加而减少。这是因为CO2具有良好的抑制细菌和真菌的性能，是水产品MAP保鲜中最重要的气体成分[16]。CO2在水和脂肪中具有较高的溶解度，易造成鱼表面pH值下降，一定范围内，其抑制腐败微生物生长的能力随着溶解于鱼体的CO2的体积分数的增加而增强[17]。但是MAP处理后菌落总数降低率最高为23.61%，远低于直接ACP处理的降低率（59.49%）。通过方差分析可以得出间接处理组F值小于0.01（P＞0.05），因此MAP对鲐鱼菌落总数没有显著的影响。这是由于大量的带电的活性粒子对PP包装盒的穿透性较差，在复合膜表面等离子体活性粒子四处逸散，导致杀菌效果较弱[18]。因此，之后的实验均采用对鲐鱼进行直接ACP处理。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 处理电压对鲐鱼杀菌效果的影响
图3 处理电压对鲐鱼菌落总数的影响
Fig. 3 Effect o f p rocessing vo ltage on TVC o f m ackerel
如图3所示，随着处理电压的增大，鲐鱼肌肉的菌落总数减少。在0～50 kV之间，菌落总数降低速率较快，杀菌效果显著（P＜0.05）。在50～70 kV之间，菌落总数减少速率显著减缓。当处理电压为60、70 kV时，鱼体菌落总数分别为2.03、2.01（lg（CFU/g）），两者几乎相等，杀菌效果没有显著差异。究其原因，可能是60 kV左右已接近最佳处理电压。鉴于实验安全性以及试验效果考虑，因此选定最佳处理电压范围为50～60 kV。
2.2.2 处理时间对鲐鱼杀菌效果的影响
图4 处理时间对鲐鱼菌落总数的影响
Fig. 4 Effect of p rocessing tim e on TVC of m ackerel
如图4所示，随着处理时间的延长菌落总数呈下降的趋势。在0～45 s内，菌落总数减少较快，在处理时间45 s时达到一个较低点，菌落总数为2.64（lg（CFU/g））。在此之后，随着处理时间的延长，菌落总数的减少不显著。这可能是因为当同性电荷积累到一定程度后，鲐鱼中电荷已接近饱和，再增加电荷量已经不能显著增强静电斥力来破坏细菌细胞膜和细胞壁而杀灭细菌[19]。当处理时间为75 s时，菌落总数为2.32（lg（CFU/g）），与处理时间为60 s时所计得的菌落总数2.34（lg（CFU/g））差别很小，但与处理时间为45 s时所计得的菌落总数2.64（lg（CFU/g））相比，延长处理时间杀菌效果提高明显。因此，选定最适处理时间范围为60～75 s。
2.3 响应面试验结果
在单因素试验基础上，以处理电压、处理时间为自变量，鲐鱼菌落总数为响应值的进行响应面分析。试验方案及结果见表2。
表2 响应面中心组合试验设计及结果
Tab le 2 Response surface cen tral com posite design w ith experim ental resu lts
表3 回归模型的方差分析
Tab le 3 Analysis o f variance o f reg ression m odel
注：**.影响极显著（P＜0.01）。
对表2的试验结果通过Design-Expert 8.0.6进行分析拟合，并建立多元二次响应面回归模型方程：Y=2.75－0.81A－0.55B－0.26AB＋0.30A2＋0.45B2。由表3可知，该模型极显著（P＜0.000 1），模型的失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率[20]，失拟项（P=0.153 2＞0.05）不显著，说明在整个回归区域的拟合情况良好，可用该模型对试验结果进行分析[21]。处理电压（A）、处理时间（B）的一次项均为极显著（P＜0.01），说明两个因素对ACP杀菌效果线性显著。二次项（A2、B2）均极显著，交互项（AB）极显著，表明处理电压（A）和处理时间（B）对菌落总数的影响不是简单的线性关系。
根据F值可知，影响程度处理电压大于处理时间。方程的R2为0.996 5，说明99.65%的试验数据可由该模型解释。而且模型的调整系数R2Adj为0.994 0，说明该方程的应变量与全体自变量间线性关系显著[22]，响应值的变化99.40%来源于所选自变量；模型的变异系数为2.18%，说明该模型精密度好，试验结果可靠性高。
图5 处理电压和处理时间交互作用对菌落总数影响的响应面图
Fig. 5 Response surface and correspond ing contour p lots show ing the effect o f p rocessing vo ltage and tim e on TVC
由图5可知，两因素交互作用极显著，在一定条件下，随着处理电压的升高、处理时间的延长，菌落总数逐渐减少。且在处理电压为59.2 kV、处理时间为70.3 s时，鱼体菌落总数达最小值1.88（lg（CFU/g））。
根据响应面分析建立的数学模型，得到最佳杀菌处理条件为：处理电压59.9 kV、处理时间71.5 s。在此条件下，ACP处理后鲐鱼表面的菌落总数预测值为1.86（lg（CFU/g））。为验证回归模型的可靠性，在响应面得出的最佳处理条件下进行3次验证实验，得到ACP处理后鲐鱼表面的菌落总数为1.83（lg（CFU/g）），与预测值相差不大，说明所建模型与实际情况吻合较好，可用于之后的实验。
2.4 ACP处理对产组胺相关微生物的影响
图6 ACP处理下鲐鱼中产组胺有关微生物的变化
Fig. 6 Effect o f DBD-ACP treatm en t on changes in histam inep roducing m icroorganism s in m ackerel
根据国内外相关报道，具有组胺脱羧酶活性的微生物主要集中在肠杆菌、假单胞菌、弧菌以及一些耐盐性菌，如奇异变形杆菌（Proteus m irabilis）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）等[23-28]。ACP处理后与组胺产生有关的假单胞菌、肠杆菌、弧菌的变化如图6所示。未进行ACP处理的鲐鱼在贮藏期内，3 类微生物均保持持续生长，且增长速率明显快于ACP处理组。假单胞菌在贮藏6 d菌落数为6.26（lg（CFU/g）），超过6（lg（CFU/g）），肠杆菌在8 d菌落数超过6（lg（CFU/g））。而弧菌在贮藏初期并未检出，在4 d时急速增长到4.17（lg（CFU/g））后生长缓慢，10 d菌落数为6.04（lg（CFU/g））超过6（lg（CFU/g））。ACP对该3 种产组胺相生有关的微生物均有显著的抑制作用（P＜0.05），3 种菌经ACP处理后生长速率明显减缓。ACP处理对微生物的杀灭作用强，延缓了鱼体的腐败变质。假单胞菌在8 d的菌落数仅为5.32（lg（CFU/g）），与未处理的鲐鱼相比减少了2 个数量级。3种菌属中，肠杆菌受到ACP的影响最显著。处理组贮藏初期，鱼体中没有检出肠杆菌，且在整个贮藏期内，肠杆菌均未超过6（lg（CFU/g））。这是因为肠杆菌为革兰氏阴性菌，其细胞膜外表面是不光滑或者是不规则的，能较好地吸附带电电荷，随着带电电荷的不断积累，同性电荷之间产生的静电斥力会超过细胞膜或者细胞壁的拉伸强度从而导致细胞膜或者细胞壁破裂并导致细胞死亡[7]。弧菌在贮藏期前2 d内几乎不生长，14 d时菌落数为4.68（lg（CFU/g））。
2.5 ACP处理对鲐鱼组胺含量的影响
图7 ACP处理下鲐鱼中组胺含量的变化
Fig. 7 Effect of DBD-ACP treatm ent on changes in histam ine content in m ackerel
鲐鱼因肌肉组织中血红蛋白、组氨酸含量高，其游离组氨酸易受到高活性组氨酸脱羧酶的细菌污染而脱去羧基形成组胺[2]。若水产品中组胺含量过高，人误食后会产生组胺中毒，国标中规定鲐鱼的组胺含量应小于100 mg/100 g[26]。如图7所示，鲐鱼中组胺含量随着贮藏时间的延长而积累。未经过ACP处理的鲐鱼体内，组胺含量增加速率较快，且在第8天时达到107.25 mg/100 g，超过GB 2733—2005《鲜、冻动物性水产品卫生标准》[29]中的鲐鱼食用标准。经ACP处理的鲐鱼组胺含量降低显著（P＜0.05），在第14天的贮藏期内组胺含量均未超过100 mg/100 g，第14天的组胺含量仅为72.34 mg/100 g，远低于国标限量。贮藏初期，两组鲐鱼组胺含量分别为5.47、5.24 mg/100 g，相差不大。在之后的贮藏期内，ACP处理组的组胺含量增长速率明显低于对照组，呈缓慢增长状，贮藏期第8天时处理组的组胺含量为54.46 mg/100 g，比此时对照组的组胺含量低49.22%，这是由于ACP处理显著杀灭了与组胺产生有关的微生物。其中，肠杆菌的减少尤为显著，据报道，肠杆菌科细菌具有较强的产组胺能力，尤其是肠杆菌中Morganella morganii，在适宜的条件下能产生超过5 000 m g/kg的组胺[30]。因此，ACP处理能较好地降低鲐鱼中的组胺含量。
以鲐鱼为研究对象，探究了ACP处理对鲐鱼杀菌效果及组胺含量的影响。结果表明，直接将鲐鱼暴露于等离子体环境中杀菌效果更好，经响应面优化后的最佳ACP条件为处理电压59.9 kV、处理时间71.5 s，且在该优化条件下，鲐鱼菌落总数与未处理相比降低了64.02%，杀菌效果显著。同时，经ACP最佳条件处理后的鲐鱼，在贮藏期内产组胺相关微生物生长缓慢，菌落数远少于同时期的对照组。其中，处理组鲐鱼在整个贮藏期内肠杆菌和弧菌均未超过6（lg（CFU/g）），且ACP对肠杆菌的杀灭效果尤为显著。ACP对组胺含量的控制有极其显著的作用，在整个贮藏期内组胺含量均未超过国家标准中规定的鲐鱼组胺含量100 mg/100 g。由此可见，ACP技术在控制鲐鱼微生物污染、组胺含量等方面有着广阔的应用前景。
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Dielectric Barrier Discharge Atm ospheric Co ld Plasm a Inactivation of M icroorganism s on Mackerel (Pneumatophorus japonicus) and Its Effects on Histam ine Conten t
SHI Zihe1, CHEN Jing1,2,*, CHEN Xing jie1, HUANG Ju1,2, DENG Shanggui1,2
(1. Co llege o f Food and Med icine, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 2. Key Labo ratory o f Health Risk Factors for Seafood o f Zhejiang Province, Zhoushan 316000, China)
Abstract:The aim of this work was to investigate the bactericidal eff i cacy of dielectric barrier discharge atmospheric cold plasma (DBD-ACP) and its effect on the histamine content of mackerel (Pneumatophorus japonicus). Direct and indirect processing modes were adopted and their anti-m icrobial effects were compared based on the variations of total variable counts (TVC) in the fish. The voltage and treatment time were optim ized using response surface methodology (RSM) combined w ith central composite design. Under optim ized conditions, the effect of DBD-ACP treatment on the changes in histam ine contents and histam ine-producing m icroorganisms such as Pseudomonas, Enterobacter, and Vibrio during storage were evaluated. The results indicated that direct DBD-ACP treatment was more effective in the inactivation of m icroorganisms, which resulted in a 35.88% decrease in TVC, compared w ith indirect treatment. The optimal conditions were found to be 71.5 s treatment at a voltage of 59.9 kV. Under these conditions, TVC decreased to 1.83(lg(CFU/g)), which is in good agreement w ith the predictive value (1.86(lg(CFU/g))), suggesting that the proposed model could fi t the experimental data well. During a 14-day period of storage, Distinctly slower grow th rates were observed for Pseudomonas, Enterobacter and Vibrio in DBD-ACP treated samples. On the 8thday, the counts of Pseudomonas, Enterobacter and Vibrio decreased by 25.89%, 46.23% and 45.23%, respectively, compared to those of control groups. Meanwhile, a reduced rate of increase in histamine content was determined for DBD-ACP treated group, whose histam ine content was measured to be 72.34 mg/100 g on the 14thday, lower than the national standard lim it.
Key words:mackerel; atmospheric cold plasma; response surface methodology; bacterial variable count; histamine content
收稿日期：2016-07-29
基金项目：浙江省科技厅重大项目（2014C02022）；浙江省自然科学基金项目（LY17C200010）；国家科技部国际合作项目（2012DFA30600）；舟山市定海区科技计划项目（2016T1106）
作者简介：施姿鹤（1995—），女，本科生，研究方向为水产品质量与安全控制。E-m ail：shishihe1995@126.com
*通信作者：陈静（1979—），女，副教授，博士，研究方向为水产品质量与安全控制、海洋生物资源综合利用。
E-m ail：chen jing1979@126.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718037
中图分类号：TS254.4
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）18-0237-07引文格式：
施姿鹤, 陈静, 陈星洁, 等. 介质阻挡放电低温等离子体在鲐鱼杀菌及组胺含量控制中的作用[J]. 食品科学, 2017, 38(18): 237-243.
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201718037. http://www.spkx.net.cn
SHI Zihe, CHEN Jing, CHEN Xing jie, et al. Dielectric barrier d ischarge atm ospheric co ld p lasm a inactivation o f m icroorganism s on m ackerel (Pneumatophorus japonicus) and its effects on histam ine content[J]. Food Science, 2017, 38(18): 237-243. (in Chinese w ith Eng lish abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718037. http://www.spkx.net.cn