郭刚军1，胡小静2，马尚玄1，徐 荣1，岩 利1，邹建云1,*
（1.云南省热带作物科学研究所，云南 景洪 666100；2.文山学院化学与工程学院，云南 文山 663000）
摘 要：以液压压榨澳洲坚果粕为原料，采用碱溶酸沉法提取蛋白质，通过单因素与正交试验确定最佳提取条件，并对其组成与功能性质进行研究。结果表明：澳洲坚果粕蛋白质提取工艺各因素对提取率影响的主次顺序依次为料液比、碱溶pH值、提取时间、提取温度，且均达到了极显著水平（P＜0.01），最佳提取工艺条件为：料液比1∶50（g/m L）、碱溶pH 9、提取时间2 h、提取温度40 ℃。在此条件下提取率达到95.40%，纯度为65.46%。澳洲坚果粕蛋白质中清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白质量分数依次为：7.29%、14.58%、14.95%、63.18%。澳洲坚果粕蛋白质的等电点约为5.0。在适宜的pH值条件下，澳洲坚果粕蛋白质具有较好的溶解性、乳化性、乳化稳定性与泡沫稳定性，起泡性相对较差。在70 ℃温度条件下，吸油性达到最大值，为50.10%。
关键词：澳洲坚果粕；蛋白质；提取工艺；组成分析；功能性质
澳洲坚果（Macadamia integrifo lia），又称夏威夷果、澳洲核桃，其可食部分为果仁，外形美观、口感酥脆、香味浓郁、营养丰富，脂肪质量分数高达65%～80%（单不饱和脂肪酸占78%，是果仁中唯一富含棕榈油酸的木本坚果类果树，质量分数为14%～19%），且还含有蛋白质、碳水化合物、维生素与微量元素[1-3]，是世界坚果类食品中最高级的一种，被誉为“坚果之王”[4]。长期食用澳洲坚果有助于降低血液总胆固醇，防止动脉硬化，降低血小板的黏度，降低心脏病、心肌梗塞及其他心血管病的发生[5-6]，在国际市场上极受青睐。我国于20世纪70年代开始澳洲坚果引种试种，现已引种试种的省区有广东、广西、云南、海南、福建、四川、贵州等，商业性种植主要在云南、广西和贵州。2015年，我国澳洲坚果种植面积191.64万 亩，收获面积12.80万 亩，带壳果产量1.02万 t，产值2.34亿 元[7]。随着《云南省澳洲坚果产业规划（2013—2020）》实施，我国澳洲坚果带壳果产量有望达到100万 t。
澳洲坚果油油质清香，清亮透明，熔点低，是上等的天然油脂[8-9]。据测算，澳洲坚果油的市场容量超过60万 t，市场潜力巨大，随着我国澳洲坚果种植面积扩大和产量的逐年增加，澳洲坚果油将成为重要的产品形式[10]。而榨油后的副产物澳洲坚果粕含有30%左右的蛋白质，氨基酸比值系数分达86.95，营养价值较高，是提取蛋白质的优质原料[11]。目前，国外对脱脂澳洲坚果粕粉的功能性质已有文献报道[12]，但对提取的澳洲坚果粕蛋白质的功能性质还鲜见报道。因此，本研究以品质优良的液压压榨澳洲坚果粕为原料，采用碱溶酸沉法提取蛋白质，并测定其组成与功能性质，以期为澳洲坚果产品的精深加工与综合利用提供一定的技术参考。
1.1 材料与试剂
澳洲坚果碎仁 西双版纳云垦澳洲坚果科技开发有限公司；酪蛋白标准品、牛血清蛋白、考马斯亮兰G250、85%浓磷酸、甲醛、无水乙醇、亚硫酸钠、盐酸、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、氯化钠均为分析纯。
1.2 仪器与设备
QYZ-550型液压榨油机 泰安市良君益友机械有限公司；电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；K9860凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司；DZKW-4电子恒温水浴锅 上海科析试验仪器厂；FE20型pH计、ME4002E型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；紫外-可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；冷冻干燥机 南京以马内利仪器设备有限公司；25 m L型数字瓶口滴定仪 德国普兰德（Brand）公司。
1.3 方法
1.3.1 液压压榨澳洲坚果粕的制备
取澳洲坚果碎仁10 kg，采用液压榨油机在压榨温度60 ℃、压力范围30～40 MPa的条件下压榨80 m in，出油率65.75%，制得颜色呈乳白色、品质优良的液压压榨澳洲坚果粕，蛋白质质量分数为32.25%。
1.3.2 澳洲坚果粕蛋白质提取工艺流程
澳洲坚果粕→粉碎→过60 目筛→加0.14 m ol/L亚硫酸钠溶液浸泡→调pH值碱性（加入0.2 m o l/L NaOH溶液）→水浴恒温提取→离心→去油层和下层沉淀→上清液加柠檬酸调pH值酸性→4 000 r/m in离心10 m in→取沉淀层→加5 倍体积70%乙醇溶液→静置30 m in→4 000 r/m in离心10 m in→取沉淀层→冷冻干燥→澳洲坚果粕蛋白质。
1.3.3 澳洲坚果粕蛋白质等电点的测定
称取过60目筛的澳洲坚果粕粉20 g，在料液比1∶20、pH 10.0、温度30 ℃条件下恒温浸提2 h，离心分离，取上清液30 m L，测定蛋白质含量，然后分别加柠檬酸调pH值为3.0、4.0、5.0与6.0，4 ℃条件下静置30 m in后，离心得沉淀，将沉淀用水快速洗涤2～3 次，溶于水并定容，测定各溶液的蛋白质含量，按式（1）计算澳洲坚果粕蛋白质的析出率：
1.3.4 澳洲坚果粕蛋白质提取工艺单因素试验
1.3.4.1 料液比对蛋白质提取率的影响
固定提取温度40 ℃、碱溶pH 10.0、提取时间2 h，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/m L）条件下进行恒温提取，离心，测定上清液中的蛋白质含量，计算提取率。
1.3.4.2 提取温度对蛋白质提取率的影响
固定料液比1∶40、碱溶pH 10.0、提取时间2 h，提取温度分别为30、40、50、60 ℃条件下进行恒温提取，离心，测定上清液中的蛋白质含量，计算提取率。
1.3.4.3 碱溶pH值对蛋白质提取率的影响
固定料液比1∶40、提取温度40 ℃、提取时间2 h，碱溶pH值分别为8.0、9.0、10.0、11.0的条件下进行恒温提取，离心，测定上清液中的蛋白质含量，计算提取率。
1.3.4.4 提取时间对蛋白质提取率的影响
固定料液比1∶40、碱溶pH 10.0、提取温度40 ℃，提取时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h条件下进行恒温提取，离心，测定上清液中的蛋白质含量，计算提取率。
1.3.5 澳洲坚果粕蛋白质提取工艺正交试验设计
在单因素试验的基础上，选择料液比（A）、提取温度（B）、碱溶p H值（C）、提取时间（D）4个因素，每个因素选择3 个水平，以提取率为考察指标，选用L9（34）进行正交设计来选择最佳提取条件，因素水平见表1。
表1 澳洲坚果粕蛋白质提取工艺正交试验因素与水平
Tab le 1 Factors and levels used in orthogonal array design
1.3.6 澳洲坚果粕蛋白质组成分析
采用Osborne法分级提取澳洲坚果粕蛋白质中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白与谷蛋白，并测定其含量[13-14]。
1.3.7 澳洲坚果粕蛋白质的测定与提取率的计算
考马斯亮蓝比色法[15-16]：以牛血清蛋白为标样，采用考马斯亮蓝染色，建立吸光度（A）与蛋白质质量浓度（Y）标准曲线，Y=1.684 4A－0.006 1，R2=0.993 7。然后取澳洲坚果粕碱溶离心后的上清液测定其蛋白质含量。蛋白质提取率计算如式（2）所示：
1.3.8 澳洲坚果粕蛋白质功能性质测定
对提取制备的澳洲坚果粕蛋白质分别进行溶解性、吸油性、起泡性、泡沫稳定性、乳化性与乳化稳定性测定[17-20]。
1.4 统计分析
数据采用SAS 9.2软件处理，应用Duncan’s法进行显著性分析，以P＜0.05为显著性差异。用Orig in 8.0软件进行数据图像处理。本实验均3 次重复，结果以
±s表示。
2.1 澳洲坚果粕蛋白质等电点的确定
图1 不同酸沉pH值条件下澳洲坚果粕蛋白质析出率
Fig. 1 Precipitation rate of macadam ia nut meal protein under various pH conditions
字母不同表示差异显著（P＜0.05），下同。
蛋白质分子在等电点状态下，分子呈电中性，电荷平均值为零，凝聚析出量最多，通过测定不同沉降pH值的蛋白质析出率，可测定蛋白质的等电点[21]。由图1可知，澳洲坚果粕蛋白质析出率在约pH 5.0时最大，表明在该pH值时溶解度最低。故澳洲坚果粕蛋白质等电点约为5.0，为提取时的酸沉pH值。
2.2 澳洲坚果粕蛋白质提取工艺单因素试验结果
2.2.1 料液比对蛋白质提取率的影响
图2 料液比对蛋白质提取率的影响
Fig. 2 Effect o f so lid-to-liquid ratio on the extraction yield o f p rotein
由图2可知，随着溶剂用量的增加，澳洲坚果粕蛋白质的提取率不断增大，当料液比为1∶40时，提取率达到最大值，为85.74%，溶剂用量继续增加，提取率呈下降趋势，这是因为在低溶剂用量时，提取溶剂很快达到饱和而未能溶解完全坚果粕中的蛋白，当料液比达到一定值后，蛋白溶解完全提取率达到最大值，继续增加溶剂用量蛋白质质量浓度变低，提取率反而呈缓慢下降趋势。故料液比选择1∶40较为适宜。
2.2.2 提取温度对蛋白质提取率的影响
图3 提取温度对蛋白质提取率的影响
Fig. 3 Effect o f tem perature on the extraction yield o f p rotein
由图3可知，随着提取温度的升高，澳洲坚果粕蛋白质提取率不断增大，当温度升到40 ℃时，提取率达到最大值，为87.92%，这是由于随着温度的升高，蛋白质分子的构象发生轻微改变，分子的立体结构变得伸展，有利于蛋白质分子和水分子的运动及其相互作用，温度的升高对蛋白质溶解起到了增溶作用。但当温度继续升高时，维持蛋白质空间构象的次级键被破坏，引起天然构象解体，把原来在分子内部的一些疏水基团暴露到分子表面，促进了蛋白质分子间的相互结合而凝结沉淀而导致提取率下降[22]。因此提取温度40 ℃为宜。
2.2.3 碱溶pH值对蛋白质提取率的影响
图4 碱溶pH值对蛋白质提取率的影响
Fig. 4 Effect o f alkaline pH on the extraction yield o f p ro tein
由图4可知，随着碱溶pH值的升高，澳洲坚果粕蛋白质提取率不断增大，但当pH值大于10时，提取率的增大幅度趋于平缓。这是因为在碱性条件下，蛋白质发生酸式解离使其本身带负电荷，分子间相互排斥，分散性好，蛋白质溶出率高，但碱性过强会引起蛋白质极端变性，产生有毒的物质，部分蛋白质会发生水解，造成提取率降低[23-24]。故pH值选择10较为适宜。
2.2.4 提取时间对蛋白质提取率的影响
图5 提取时间对澳洲坚果粕蛋白质提取率的影响
Fig. 5 Effect of extraction tim e on p rotein yield
由图5可知，随着提取时间的延长，澳洲坚果粕蛋白质提取率不断上升，当提取时间为2 h时提取率达到最大值，为90.37%，提取时间继续延长，提取率呈下降趋势，这可能是由于长时间浸提，蛋白变性析出以及蛋白质与原料中的成分相互作用形成絮凝沉淀所致。故提取时间选择2 h较为适宜。
2.3 澳洲坚果粕蛋白质提取工艺正交试验结果
由表2可知，澳洲坚果粕蛋白质提取工艺各因素对提取率影响的主次顺序为A＞C＞D＞B，即料液比＞碱溶pH值＞提取时间＞提取温度，最优工艺组合为A3B2C1D2，在此条件下，进行了3 组平行验证实验并取平均值，提取率达到95.40%，优于正交表中其他组合，蛋白质纯度为65.46%。由表3可知，料液比、提取温度、碱溶pH值与提取时间4 个因素对澳洲坚果粕蛋白质提取率的影响达到极显著水平（P＜0.01），提取时均应将其控制在最优水平上。故确定料液比1∶50、碱溶pH 9、提取时间2 h、提取温度40 ℃为澳洲坚果粕蛋白质提取的最佳工艺条件。
表2 澳洲坚果粕蛋白质提取工艺正交试验结果
Tab le 2 Orthogonal array design w ith experim ental resu lts
表3 澳洲坚果粕蛋白质提取工艺正交试验方差分析
Tab le 3 Analysis o f variance o f the experim ental resu lts o f orthogonal array design
注：**.差异极显著（P＜0.01）。
2.4 澳洲坚果粕蛋白质的组分分析
图6 澳洲坚果粕蛋白质各组分的质量分数
Fig. 6 Proporp tions of album in, globu lin, g liadin and glutenin in total p roteins from m acadam ia nut m eal
根据蛋白质在不同溶剂中溶解度不同的性质，采用Osbo rne法分级提取澳洲坚果粕蛋白质中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白与谷蛋白，测定各蛋白组分含量，计算百分比。如图6所示，在澳洲坚果粕蛋白质中，谷蛋白质量分数最高，占其总蛋白的63.18%，其次为球蛋白与醇溶蛋白，其质量分数无显著性差异，分别为14.58%与14.95%，清蛋白质量分数最低，为7.29%。
2.5 澳洲坚果粕蛋白质功能性质分析
2.5.1 溶解性
图7 pH值对蛋白质溶解性的影响
Fig. 7 Effect of pH on the solubility of the p rotein
由图7可知，澳洲坚果粕蛋白质的溶解性随pH值的不同而不同。在等电点pH 5.0时，蛋白质分子绝大部分发生沉淀，溶解度最小，仅为1.37%。当pH值大于或者小于等电点时，蛋白质分别以负离子和正离子状态存在，相互间斥力作用和水合作用促进了蛋白质的溶解。当pH值大于9.0时，澳洲坚果粕蛋白质的溶解度超过60%，这可能是由于澳洲坚果粕蛋白质中含有较多的碱溶性谷蛋白的缘故。总体来说，碱性条件下澳洲坚果粕蛋白质的溶解性优于酸性条件。
2.5.2 吸油性
图8 温度对蛋白质吸油性的影响
Fig. 8 Effect o f tem perature on the oil-binding capacity o f the p rotein
蛋白质的吸油性是指蛋白产品吸附油脂的能力。蛋白质的吸油性表现在促进脂肪吸收作用和控制脂肪吸收作用[25-26]。如图8所示，从温度30 ℃开始，澳洲坚果粕蛋白质的吸油性随温度的升高而升高，在温度70 ℃时的吸油性超过50%，可能原因是随温度升高，蛋白质分子发生伸展、解离、变性等构象变化，内部非极性键曝露且油脂结合能力增大。但在80 ℃时，吸油性开始下降，这可能是因为高温使蛋白质变性，结构发生改变，吸附能力较弱。
2.5.3 起泡性与泡沫稳定性
如图9可知，澳洲坚果粕蛋白质的起泡性与泡沫稳定性随pH值的增加先降低后增加，呈V型曲线，与其溶解性随pH值的变化规律一致，在等电点pH 5.0附近时起泡性最低，仅为6.00%，泡沫稳定性最差，为41.67%。而远离等电点的酸性与碱性条件下，泡沫较为细腻均匀，稳定性也相对较好。这可能是由于蛋白分子在酸性或碱性条件下带净正或净负电荷，导致分子间静电斥力增加并削弱了分子的疏水相互作用，分子柔性增大，有利于其更快地吸附至气液界面从而增强了起泡能力缘故[27-28]。
图9 pH值对蛋白质起泡性与泡沫稳定性的影响
Fig. 9 Effect o f pH on the foam ability and foam stability o f the p rotein
2.5.4 乳化性与乳化稳定性
图10 pH值对蛋白质乳化性与乳化稳定性的影响
Fig. 10 Effect of pH on the emulsibility and emulsifying stability of the protein
蛋白质具有乳化剂的特征结构，即两亲结构，在蛋白质分子中同时含有亲水基团和亲油基团，能够降低水和油的表面张力。同时，蛋白质还能降低水和空气的表面张力，即蛋白质的乳化稳定性。蛋白质特殊的结构使其可以作为一种表面活性剂，在食品加工中用于稳定乳化状态从而延长货架时间[29-30]。由图10可以看出，pH值对乳化性的影响相对较小，在不同pH值条件下，均具有较好的乳化性，相对来说，在pH 5.0时最低，与其他pH值有显著性差异（P＜0.05）。pH值对澳洲坚果粕蛋白质的乳化稳定性的影响呈V型曲线，这与其溶解性曲线变化规律相似，在pH 5.0时达到最低值，与其他pH值时的乳化稳定性有显著性差异（P＜0.05），在pH 2与pH 11时的乳化稳定性无显著性差异（P＞0.05），达到了90%以上，优于其他pH值。
液压压榨澳洲坚果粕碱溶酸沉淀法提取蛋白质的最佳提取工艺条件为：料液比1∶50、碱溶pH 9、提取时间2 h、提取温度40 ℃。在此条件下提取率达到95.40%，纯度为65.46%。澳洲坚果粕蛋白质中清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白的质量分数依次为：7.29%、14.58%、14.95%、63.18%。澳洲坚果粕蛋白质的等电点约为5.0。在适宜的p H值条件下，澳洲坚果粕蛋白质具有较好的溶解性、乳化性、乳化稳定性与泡沫稳定性，起泡性相对较差。在70℃温度条件下，吸油性达到最大值，为50.10%。
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GUO Gang jun1, HU Xiao jing2, MA Shangxuan1, XU Rong1, YAN Li1, ZOU Jianyun1,*
(1. Yunnan Institute o f Trop ical Crops, Jinghong 666100, China; 2. Schoo l o f Chem istry and Engineering, Wenshan University, Wenshan 663000, China)
Abstract:The extraction of p rotein from hyd rau lic expeller-p ressed m acadam ia nut meal by alkali dissolution and acid p recipitation was op tim ized using one-factor and orthogonal array design m ethods. The com position and functionality of the protein extract were evaluated. The results showed that alkaline pH, extraction time and tem perature all had highly significant effects on extraction efficiency (P ＜ 0.01), and these factors could be ranked in decreasing order of significance: alkaline pH, extraction time and tem perature. The optimal extraction conditions were determ ined as follows: solid-to-liquid ratio, 1:50 (g/m L); pH value, 9.0; extraction tim e, 2 h; and extraction tem perature, 40 ℃. Under these conditions, the yield and purity of protein extracted from m acadam ia nut meal were up to 95.40% and 65.46%, respectively. Album in, globulin, gliadin and glutenin accounted for 7.29%, 14.58%, 14.95%, and 63.18% of the total proteins extracted from m acadam ia nut meal, respectively. The isoelectric point of the protein isolate was approxim ately 5.0. At the app ropriate pH, the solubility, em u lsifying capacity, em u lsion stability and foam stability of m acadam ia nut m eal p rotein iso late w ere good and the foam ability w as relatively poor. Its oil-bind ing capacity reached the m axim um value o f 50.10% at 70 ℃.
Key words:m acadam ia nu t m eal; p rotein; extraction p rocess; com position analysis; functional p roperties
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718041
中图分类号：TS201.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）18-0266-06引文格式：
郭刚军, 胡小静, 马尚玄, 等. 液压压榨澳洲坚果粕蛋白质提取工艺优化及其组成分析与功能性质[J]. 食品科学, 2017, 38(18): 266-271.
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201718041. h ttp://www.spkx.net.cn
GUO Gang jun, HU Xiaojing, MA Shangxuan, et al. Extraction, com position analysis and functional p roperties o f p rotein isolate from hyd rau lic expeller-p ressed macadam ia nut m eal[J]. Food Science, 2017, 38(18): 266-271. (in Chinese w ith Eng lish abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718041. h ttp://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-11-01
基金项目：云南省热带作物科技创新体系建设专项（RF2014-17；RF2015-2-2；RF2016-7；RF2017-9）；云南省技术创新暨产业发展专项（2012XB049）
作者简介：郭刚军（1980—），男，副研究员，硕士，研究方向为食品加工和植物中天然产物提取分离与功能。
E-m ail：guogang jun2001@126.com
*通信作者：邹建云（1980—），男，研究员，本科，研究方向为热作农产品贮藏与加工。E-m ail：zou jianyunbn@sina.com