张佳婵1，史豆豆1，王昌涛1,2,*，李 萌1，赵 丹1，王成涛2,3，孙宝国2,3
（1.北京工商大学理学院，植物资源研究开发北京市重点实验室，北京 100048；2.北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100048；3.北京工商大学食品学院，食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048）
摘 要：本实验以沙棘粕为研究对象，提取得到沙棘粕醇提物（sea buckthorn seed extracts，SBSE），对SBSE进行极性部位划分，得到乙酸乙酯层和萃余水层；对划分部分及SBSE（下称“粗提物”）进行活性成分分析、化学水平自由基清除能力测定以及细胞水平过氧化氢酶活力、活性氧含量、基质金属蛋白酶1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）含量和Ⅰ型胶原含量分析。结果表明，粗提物、乙酸乙酯层和萃余水层主要活性成分均为黄酮类、原花青素类和总酚，三者均具有较为显著的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力，乙酸乙酯层和萃余水层对羟自由基（·OH）的清除能力显著，粗提物未表现出对·OH的清除效果；3 种样品在0.05～5.00 mg/mL范围内，对人皮肤成纤维细胞均未表现出强烈的细胞毒性，细胞活力均在80%以上；3 种样品刺激细胞后，其过氧化氢酶活力显著升高，除0.5 mg/mL萃余水层外，其余样品作用后细胞中活性氧水平高度显著降低（P＜0.001），其中，粗提物比乙酸乙酯层和萃余水层具有更为优越的促进过氧化氢酶活性和抑制活性氧产生的能力；并且，3 种样品特别是粗提物可以显著降低人皮肤成纤维细胞中MMP-1的含量（P＜0.05），其细胞中Ⅰ型胶原含量也最高。由结果可知，SBSE具有潜在的抗衰老功效。
关键词：沙棘粕；粗提物；乙酸乙酯层；萃余水层；抗衰老
Abstract:In this research, sea buckthorn seed extracts (SBSE) were obtaine d by the extraction of sea buckthorn seed residues using ethanol. SBSE were separated into two fractions of different polarities: the upper ethyl acetate phase and the bottom aqueous phase. The crude extract and its fractions were tested for bioactive components, chemical and cellular antioxidant properties including scavenging capacity against 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical and hydroxyl radicals and catalase activity, and their effects on reactive oxygen (ROS), matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)and type Ⅰ collagen (COLⅠ) contents in the culture supernatants of human skin fi broblast cells were examined. The results showed that fl avonoids, proanthocyanidins and total phenolics were the major bioactive compounds in the crude extract and its fractions. All these samples could strongly scavenge DPPH free radical. The two fractions but not the crude extract showed potent hydroxyl radical scavenging activity. All three samples in the concentration range of 0.05–5.00 mg/mL showed no strong cytotoxicity to human skin fi broblast cells and the cell viability was above 80% in the presence of each sample. Stimulation with the samples signifi cantly increased catalase activity and reduced ROS content, and the crude extract showed the strongest catalase activity and lowest ROS level among these samples. Furthermore, cellular MMP-1 contents were signifi cantly decreased by SBSE, and COLⅠ contents were increased to the maximum. Therefore, SBSE had potential anti-aging effect.
Key words:sea buckthorn seed residues; crude extracts; ethyl acetate phase; aqueous phase; anti-aging potential
人体皮肤衰老是一个复杂的生物学变化过程，其中包括外源性衰老和内源性衰老。内源性衰 老主要与遗传背景、年龄因素有关，而外源性衰老主要受外界环境因素的影响，如紫外线暴露、吸烟、环境污染等[1-2]。根据皮肤的衰老机理，抗衰老的途径主要概括为以下几个方面：保护皮肤免受外界环境刺激；清除细胞内多余自由基；对皮肤细胞进行修复和补充营养[3]。皮肤衰老多表现为皱纹、干燥、起屑、松弛和色斑等[4]。随着生活水平的提高，人们逐渐重视具有抗衰效果的绿色天然食品源制品的使用。因此开发具备抗衰老功效的天然食源产品已成为近年来的研究热点。
沙棘（Hippophae rhamnoidesL.），主要存在于亚欧大陆，是我国西部生态治理的优选植物。大量研究证实了沙棘具有抗炎、抗癌等功效[5-6]。沙棘粕是沙棘籽经过脱油处理后的副产物，Ushakova等[7]研究发现沙棘粕中含有较多纤维素、半纤维素等物质，一般作为饲料或废弃物丢弃，造成了资源的浪费。本课题组前期研究发现（未发表），沙棘粕仍然含有丰富的黄酮、原花青素等物质，具有显著的清除自由基、抗氧化功效。研究发现，黄酮类、多酚类以及原花青素-白藜芦醇等活性成分具有显著的抗衰老功效[8-15]，其醇提物具有丰富的黄酮类物质，因此断定沙棘粕醇提物（sea buckthorn seed extracts，SBSE）具有潜在的抗衰老功效。
细胞水平评价物质的抗衰老功效是介于体外化学水平评价和动物、人体实验之间的评价体系。其较体外化学水平更接近于生物机体，又具有比动物、人体实验周期短、个体差异小且易于操作的特点，所得结果一定程度上可反映真实水平。细胞水平抗衰老功效的评价指标较多。其中过氧化氢酶是生物演化过程中建立起来的氧化防御系统的关键酶之一[16]，过氧化氢酶可以与机体代谢产生的H2O2结合，并将其分解为H2O和O2。细胞衰老将导致其消除H2O2的能力下降，打乱机体活性氧水平的平衡，使活性氧自由基聚集，细胞膜中的不饱和脂肪酸被产生的活性氧自由基损害，引起脂质过氧化反应，并且对细胞器结构和功能产生损害，继而损害蛋白质、脂质等生物大分子，使机体走向衰老[17-18]。此外，维持肌肤弹性的Ⅰ型胶原是评价衰老程度的另一指标。机体内还存在分解胶原蛋白的酶类——基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1。该酶又称为胶原酶-1、成纤维细胞胶原酶或间质胶原酶，不仅可降解Ⅰ型胶原还可降解蛋白、多糖等物质[19]。因此，本实验选择过氧化氢酶活性、活性氧水平、Ⅰ型胶原和MMP-1含量为细胞水平评价SBSE抗衰老功效的4 个指标。
本实验利用副产物沙棘粕提取得到SBSE，初步划分极性部位，化学水平测定SBSE清除自由基的能力；选择人皮肤成纤维细胞为评价载体，测定样品刺激细胞后，其过氧化氢酶活性以及活性氧水平的变化，从抗氧化、清除自由基方面评价抗衰老功效；通过测定细胞中MMP-1和Ⅰ型胶原含量，评价SBSE是否具有潜在的延缓皮肤出现皱纹、松弛等衰老表现的作用，以期为SBSE在食品中的应用提供参考。
1.1 材料与试剂
沙棘粕由青海康普生物科技股份有限公司提 供，均烘干粉碎过筛。人皮肤成纤维细胞购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。
芦丁、原花青素 中国药品生物制品检定所；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、盐酸、邻二氮菲（均为分析纯） 北京化工厂；抗坏血酸（分析纯，纯度≥99.7%） 国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、胰酶（1∶250） 美国Sigma Aldrich公司；DMEM培养基、新生牛血清、磷酸盐缓冲液（phosphat e buffered saline，PBS）、青霉素（1×105U/L）、链霉素（100 mg/L） 美国Gibco公司；活性氧检测试剂盒、过氧化氢酶检测试剂盒 碧云天生物技术有限公司；人Ⅰ型胶原酶联免疫检测试剂盒、MMP-1酶联免疫检测试剂盒 武汉华美生物工程有限公司。
1.2 仪器与设备
BS2202S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；DSHZ-300恒温水浴振荡器 江苏省太仓市实验设备厂；2-16N型医用高速离心机 湖南恒诺仪器设备有限公司；Elx-808型酶标仪 美国Bio-Tek公司；T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；YJ-2450医用超净工作台 苏州净化设备厂；CO2培养箱 美国Thermo公司。
1.3 方法
1.3.1 SBSE的制备及分级
35 ℃条件下，采用80%乙醇以液料比8∶1（V/m）的比例，提取粉碎干燥处理的沙棘粕，提取时间为1.5 h，3 000×g离心15 min，分离上清液，按照相同方法重复提取2 次，合并上清液，真空旋转蒸发得到浓缩SBSE。
以体积比1∶1的比例，利用乙酸乙酯萃取浓缩SBSE，重复萃取至乙酸乙酯层无色，分别汇总乙酸乙酯层和萃余水层，真空旋转蒸发浓缩，-80 ℃、30 Pa条件下冷冻干燥48 h，分别得到油状物乙酸乙酯层和固体粉末状萃余水层，并分别命名为乙酸乙酯层和萃余水层。将未经萃取过程的SBSE冷冻干燥，命名为粗提物。
1.3.2 主要活性成分的测定
将冷冻干燥后的粗提物、萃余水层和乙酸乙酯层配制成10 mg/mL溶液，测定其黄酮含量、原花青素含量以及总酚含量。黄酮含量测定按照硝酸铝-亚硝酸钠比色法[20]；原花青素含量测定按照香草醛比色法[21]；总酚含量测定按照福林-酚试剂还原比色法[20]。
1.3.3 化学水平抗氧化活性的测定
1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的测定
参考文献[22]的方法，取1.5 mL待测液加入到1.5 mL 2×104mol/L DPPH溶液中，迅速混匀，室温条件下避光静置30 min后于517 nm波长处测定吸光度（A1）。取1.5 mL无水乙醇加入到1.5 mL 2×104mol/L DPPH溶液中，迅速混匀，室温条件下避光静置30 min后于517 nm波长处测定吸光度（A2）。
取1.5 mL无水乙醇加入到1.5 mL样品溶液中，迅速混匀，室温条件下避光静置30 min后于517 nm波长处测定吸光度（A3）。DPPH自由基清除率的计算见式（1）。
1.3.3.2 ·OH清除能力的测定
参考文献[23]的方法，取0.5 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中，依次加入1 mL 0.15 mol/L PBS（pH 7.40）和0.5 mL蒸馏水，充分混匀后，加入0.5 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液，混匀后加入0.5 mL体积分数（下同）0.01%的H2O2溶液，于37 ℃水浴60 min后，在536 nm波长处测定其吸光度，为损伤管吸光度（A损伤）。未损伤管以0.5mL蒸馏水代替损伤管中的0.5 mL 0.01% H2O2溶液，操作方法同损伤管，可测得536 nm波长处未损伤管的吸光度（A未损伤）。样品管以0.5 mL样品溶液代替损伤管中的0.5 mL蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得536 nm波长处样品管的吸光度（A样品）。按式（2）计算样品的•OH清除率。
1.3.4 MTT法测定SBSE对人皮肤成纤维细胞活力的影响
1.3.4.1 细胞培养
人皮肤成纤维细胞培养于含10%新生牛血清、1%青霉素和1%链霉素的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中，以0.05 g/100 mL胰酶消化传代。将处于对数生长期的细胞接种于细胞培养板上进行实验。
1.3.4.2 细胞活力的测定
参考文献[24]的方法，取对数生长期人皮肤成纤维细胞以0.05%胰酶消化、细胞培养液制备成单细胞悬液，接种于96 孔细胞培养板中，每孔100 μL、5 000个细胞，过夜后每孔加入100 μL含不同质量浓度样品溶液或无样品DMEM培养基，实验设置调零组（DMEM）、细胞对照组（细胞+DMEM）、实验组（细胞+不同质量浓度样品溶液）。实验组乙酸乙酯层、萃余水层、粗提物的样品溶液终质量浓度均设定为5.00、1.00、0.50、0.10、0.05 mg/mL，每组至少6 个平行孔。37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。常规方法加入5 mg/mL噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）溶液与DMEM培养液混合溶液（体积比1∶5）100 μL处理4 h，150 μL二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）溶解，37 ℃孵育10 min，测定490 nm波长处吸光度。细胞活力按式（3）计算。
1.3.5 人皮肤成纤维细胞过氧化氢酶活力的测定
按照过氧化氢酶检测试剂盒说明书进行样品测定。标准曲线的测定：取0.0、12.5、25.0、50.0、75.0 μL新鲜配制的5 mmol/L H2O2溶液，分别加入过氧化氢酶检测缓冲液至最终体积为100 μL。分别取4 μL，加入96 孔板的孔内。加入200 μL显色工作液。25 ℃孵育15 min，测定520 nm波长处吸光度A，得到标准曲线为y＝70.094x+0.054 5，R2＝0.997 6。
取3 μL经乙酸乙酯层、萃余水层、粗提物样品处理24 h的细胞裂解液（蛋白浓度已测定），添加过氧化氢酶检测缓冲液至体积为40 μL，混匀。再加入10 μL 250 mmol/L H2O2溶液，用移液器迅速混匀。反应3 min后，加入450 μL过氧化氢酶反应终止液，对照标准曲线计算残余H2O2浓度。换一洁净离心管，加入40 μL过氧化氢酶检测缓冲液，再加入10 μL已终止并混匀的上述反应体系，混匀。25 ℃孵育15 min后测定520 nm波长处吸光度A，计算过氧化氢酶活力。
1.3.6 人皮肤成纤维细胞活性氧含量的测定
按照活性氧检测试剂盒说明书进行样品含量测定。乙酸乙酯层、萃余水层、粗提物样品溶液在0.05、0.50、5.00 mg/mL条件下处理人皮肤成纤维细胞24 h后，PBS冲洗2 次，用含10 μmol/L 2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（2’,7’-dichlorodi-hydrofl uorescein diacetate，DCFH-DA）探针的培养液37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。DMEM洗涤细胞3 次。收集细胞后，荧光酶标仪测定激发波长488 nm、发射波长525 nm条件下的荧光强度。以试剂盒配套阳性对照ROSUP和天然抗氧化剂VC为对照。
1.3.7 人皮肤成纤维细胞Ⅰ型胶原含量的测定
按照人Ⅰ型胶原酶联免疫检测试剂盒说明书进行样品的测定。乙酸乙酯层、萃余水层、粗提物样品溶液在3 个质量浓度（0.05、0.50、5.00 mg/mL）条件下处理人皮肤成纤维细胞24 h后，取细胞培养液上清液，于2～8 ℃、1 000×g离心15 min，取上清液立即进行测定。
在预先包被了抗体的酶标孔中加入样品或标准品，在加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的识别抗原，在37 ℃条件下孵育1 h，两者与固相抗原竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤后，结合的HRP催化四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TNB）成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450 nm波长处测定吸光度，对照标准曲线来计算样品刺激后细胞的Ⅰ型胶原含量。
1.3.8 人皮肤成纤维细胞MMP-1含量测定
按照MMP-1酶联免疫检测试剂盒说明书进行样品测定。乙酸乙酯层、萃余水层、粗提物样品溶液在3 个质量浓度（0.05、0.50、5.00 mg/mL）条件下处理人皮肤成纤维细胞24 h后，取细胞培养液上清液，于2～8 ℃、1 000×g离心15 min，取上清液立即进行测定。
在包被有纯化MMP-1抗体的微孔板中依次加入样品或标准品、生物素化的抗MMP-1抗体、HRP标记的亲和素，经彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的作用下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。颜色的深浅与样品中MMP-1含量呈正相关。用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度，对照标准曲线来计算样品刺激后MMP-1含量。
1.4 数据统计分析
本实验均设置3 组平行，实验数据利用SPSS 19.0软件进行统计学处理，组间比较采用单因素ANOVA分析，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，所得结果以 ±s表示。
2.1 SBSE活性成分测定结果
表1 SBSE中黄酮、原花青素和总酚含量
Table 1 Contents of fl avonoids, proanthocyanidins and total phenolics in SBSE and fractions mg/mL
表1显示，粗提物、萃余水层以及乙酸乙酯层均含有丰富的黄酮、原花青素以及总酚。10 mg/mL的样品溶液中，粗提物黄酮含量占32%以上，原花青素含量占（33.90±2.10）%，总酚含量为（2.56±0.78）mg/mL，占总成分的25%以上，说明沙棘粕粗提物中含有较高含量的该类物质。萃余水层中黄酮含量最高，10 mg/mL萃余水层样品中黄酮含量高达（4.77±0.18） mg/mL，质量分数达47.70%，其次为总酚和原花青素。乙酸乙酯层中原花青素含量最高，为（4.67±0.17）mg/mL，其次为黄酮和总酚。
2.2 SBSE化学抗氧化活性评价
图1 SBSE清除DPPH自由基（AA）和·OH（BB）能力
Fig. 1 DPPH (A) and hydroxyl (B) radical scavenging capacity of SBSE and fractions
由图1A可知，粗提物、萃余水层、乙酸乙酯层具有较为显著的DPPH自由基清除能力。在考察质量浓度范围内，3 种SBSE样品的清除率均在70%以上，在0.4～1.6 mg/mL范围内，三者的清除能力均优于VC。
由图1B可知，乙酸乙酯层和萃余水层的在清除·OH能力方面较为显著，在1.2～2.0 mg/mL范围内具有比VC更强的·OH清除能力。粗提物未表现出较强的·OH清除效果，这可能与活性成分的分离和重新依极性组合有关。单因素ANOVA数据分析，粗提物在考察质量浓度范围内无显著差异（P＞0.05）。
2.3 SBSE对人皮肤成纤维细胞活力的影响
图2 不同质量浓度SBSE对人皮肤成纤维细胞活力的影响
Fig. 2 Effect of different concentrations of SBSE and fractions on cell viability of human skin fi broblasts
由图2可知，在考察的质量浓度范围内（5.00、1.00、0.50、0.10、0.05 mg/mL），乙酸乙酯层、萃余水层和粗提物对细胞均未表现出强烈的细胞毒性，细胞活力均在80%以上。相同质量浓度下3 种SBSE样品的细胞活力差异不显著（P＞0.05）。因此，本实验选择了3 个质量浓度（5.00（高剂量组）、0.50（中剂量组）、0.05 mg/mL（低剂量组））进行后续实验。
2.4 SBSE对人皮肤成纤维细胞过氧化氢酶的影响
图3 SBSE对过氧化氢酶活力的影响
Fig. 3 Effect of SBSE and fractions on catalase activity
由图3可知，粗提物、乙酸乙酯层、萃余 水层处理后细胞中的过氧化氢酶可以显著促进清除H2O2能力，加入等量H2O2反应一定时间，残余H2O2量显著低于细胞对照（P＜0.01）。单因素ANOVA分析，相同样品不同质量浓度条件下的过氧化氢酶活力差异不显著（P＞0.05，数据未列出）。
2.5 SBSE对人皮肤成纤维细胞活性氧含量的影响
图4 SBSE对细胞中活性氧含量的影响
Fig. 4 Effect of SBSE on ROS content
由图4可知，阳性对照ROSUP可以造成细胞损伤，高度显著提高活性氧水平（P＜0.001）。对3 种SBSE的活性氧实验数据进行分析，发现与细胞对照相比，除0.50 mg/mL萃余水层外，3 种SBSE均可以高度显著降低细胞中活性氧水平（P＜0.001）。其中，粗提物比乙酸乙酯层和萃余水层具有更为优越的抑制活性氧产生的能力。VC被认为具有一定的抑制活性氧水平的刺激物。本实验选择以VC为另一对照，由图4可知，VC与0.05 mg/mL和5.00 mg/mL萃余水层相比差异不显著（P＞0.05）；细胞经VC处理后，与乙酸乙酯层相比，活性氧水平高度显著降低（P＜0.001）；但是，0.05、0.50 mg/mL粗提物处理细胞后，活性氧水平高度显著低于VC（P＜0.001）。由此可见，粗提物相较于其他极性部位具有更为显著的降低细胞活性氧水平的能力。
2.6 SBSE对人皮肤成纤维细胞MMP-1、Ⅰ型胶原含量的影响
由图5A可知，SBSE可以显著降低人皮肤成纤维细胞中MMP-1含量（P＜0.05），其中粗提物作用下的细胞MMP-1含量最低，乙酸乙酯层相对最高，萃余水层其次；且随着处理质量浓度的升高，各实验组MMP-1含量有降低的趋势。由图5B可知，粗提物处理细胞后Ⅰ型胶原含量最高，其次为乙酸乙酯层；0.05 mg/mL条件下，粗提物处理的细胞Ⅰ型胶原含量为 （29.14±1.21）ng/mL，约为细胞对照的3 倍（细胞对照组为（10.93±0.97）ng/mL）；且Ⅰ型胶原含量显示与3 组样品呈现剂量依赖性。此前，Kim等[25]的研究也发现，沙棘籽提取物可以 保护UVB诱导的人皮肤成纤维细胞的光老化损伤，MMP-1受到抑制，原骨胶原含量升高。与本实验结论相似，进一步验证了沙棘籽提取物的抗衰老功效。
图5 SBSE对人皮肤成纤维细胞MMP-1（A）和Ⅰ型胶原（B）含量的影响
Fig. 5 Effect of SBSE and fractions on MMP-1 (A) and COLⅠ (B) contents
从图5还可以看出，粗提物虽为乙酸乙酯层和萃余水层的加和，但是其功效作用并非另两者的简单叠加，不同极性部位所占比例、各成分的区别，以及不同活性成分之间的协同增效作用是造成功效差异的重要原因，在谭榀新等[26]有关植物提取物抗氧化成分及机理研究进展的综述中也阐述到这一点。
人体衰老是由多方面因素相互作用的结果，也是生命活动中出现的必不可少的一部分，表现为一系列随时间而产生的全身整体性、渐进性、衰退性和不可逆的机体变化和功能紊乱。自由基学说是目前解释衰老的重要学说之一。近年来人们专注于对抗衰老活性成分效果及作用机制的研究，葡萄籽提取物、黄芪提取物、人参提取物等能直接清除自由基、提高抗氧化酶的活性以及降低丙二醛的含量，发挥抗衰老的作用[27-29]。以沙棘为研究对象的活性研究也有所进展，目前已证实沙棘果汁、果油、果渣以及叶提取物的在抗衰老方面的卓越功效[6,30]。但是对沙棘粕的相关研究较少。本实验以副产物沙棘粕为研究对象，依照本课题组前期研究条件提取得到SBSE，并根据极性差异初步划分极性部位——乙酸乙酯层和萃余水层，将未划分部位的醇提物命名为粗提物，重点探讨3 种SBSE（乙酸乙酯层、萃余水层和粗提物）在3 个质量浓度（5.00、0.50、0.05 mg/mL）处理水平刺激人皮肤成纤维细胞，从细胞水平评价SBSE抗衰老功效。
由结果可知，黄酮、原花青素以及总酚是粗提物、乙酸乙酯层、萃余水层的主要活性成分。在考察质量浓度范围内，三者对DPPH自由基清除能力均在70%以上，在清除·OH能力方面，乙酸乙酯层和萃余水层的清除能力较为显著，粗提物未表现出·OH清除效果。这与活性成分的种类和含量的差异以及成分间相互作用相关。在考察的质量浓度范围内，3 种SBSE对人皮肤成纤维细胞均未表现出强烈的细胞毒性，细胞活力均在80%以上；3 种样品刺激细胞后，细胞内过氧化氢酶分解H2O2的能力显著升高，在添加相同量H2O2的条件下，反应一定时间后残余H2O2量极显著低于无样品刺激的细胞裂解液（P＜0.01）；与细胞对照相比，SBSE刺激细胞后，除0.5 mg/mL萃余水层组外，均可以高度显著降低细胞中活性氧水平（P＜0.001），其中，粗提物比乙酸乙酯层和萃余水层具有更强的抑制活性氧产生的能力；此外，SBSE可以显著降低人皮肤成纤维细胞中MMP-1含量（P＜0.05），其中粗提物降低效果最为显著，与此同时，粗提物处理细胞后Ⅰ型胶原含量最高，其次为乙酸乙酯层。
综上所述，通过比较3 种样品的抗衰老效果发现，乙酸乙酯层以及萃余水层均没有粗提物表现出更优越的功效活性，虽然三者均含有丰富的黄酮、原花青素以及总酚，但是由于极性的差异，三者在物质成分及含量上存在差别，若能够在物质成分鉴定及分析方面对SBSE进行透彻分析，将更有利于SBSE在抗衰老领域中的应用。
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Anti-Aging Effects of Sea Buckthorn Seed Extracts
ZHANG Jiachan1, SHI Doudou1, WANG Changtao1,2,*, LI Meng1, ZHAO Dan1, WANG Chengtao2,3, SUN Baoguo2,3
(1. Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, School of Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 3. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food and Chemical Engi neering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201719026
中图分类号：TS209
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）19-0164-07
收稿日期：2016-06-28
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31571801）
作者简介：张佳婵（1987—），女，实验师，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail：xiaochan8787@163.com
*通信作者：王昌涛（1975—），男，教授，博士，研究方向为生物化工。E-mail：wangct@th.btbu.edu.cn
引文格式：
张佳婵, 史豆豆, 王昌涛, 等. 细胞水平评价沙棘粕醇提物的抗衰老功效[J]. 食品科学, 2017, 38(19): 164-170.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201719026. http://www.spkx.net.cn
ZHANG Jiachan, SHI Doudou, WANG Changtao, et al. Anti-aging effects of sea buckthorn seed extracts[J]. Food Science, 2017,38(19): 164-170. (in Chinese with English abstract)
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201719026. http://www.spkx.net.cn