巴莲莲子生物碱提取物对人肝癌细胞HepG2的体外抗癌效果

（1.重庆第二师范学院生物与化学工程学院，重庆市功能性食品协同创新中心，重庆市功能性食品工程技术研究中心，功能性食品研发重庆市工程实验室，重庆 400067；2.重庆市巴莲品种选育及深加工企业工程技术研究中心，重庆 400041）

摘要：本研究对巴莲莲子生物碱提取物的体外抗癌效果进行研究，以证实巴莲莲子生物碱提取物的生理活性作用。采用噻唑蓝法、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色法和实时荧光定量聚合酶链式反应法检测巴莲莲子生物碱对人肝癌细胞HepG2的体外增殖抑制作用和凋亡诱导作用。巴莲莲子生物碱可以抑制HepG2细胞的体外增殖，但是对正常肝细胞L02无毒性，不影响其增殖。通过对癌细胞形态的观察发现随着巴莲莲子生物碱质量浓度的提高，更多的癌细胞被诱导凋亡从而死亡。同时，巴莲莲子生物碱能上调HepG2细胞的Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9、p53、p21基因表达和下调Bcl-2、Bcl-xL基因表达，从而促进癌细胞凋亡。巴莲莲子生物碱是一类生物活性成分，实验条件下具有较好的体外抗癌效果。

关键词：巴莲莲子；生物碱；人肝癌细胞HepG2；凋亡；mRNA表达

Abstrac t: In this study, thein vitroanticancer activity of alkaloids extracted from Ba lotus seeds was determined to confi rm its physiological activity. 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT), 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining and quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) methods were used to determine the potential of the alkaloids for inhibiting the proliferation and inducing the apoptosis of human hepatoma HepG2 cellsin vitro. The alkaloids from Ba lotus seeds could inhibit the proliferation of HepG2 cells, but had no toxicity to normal liver cells L02. From morphological observation, it was shown that the alkaloids at higher concentrations could induce more signifi cant apoptosis in cancer cells and lead to cell death. Meanwhile, the alkaloids could up-regulate the mRNA expression levels ofBax,caspase-3,caspase-8,caspase-9,p53andp21, and down-regulate the mRNA expression levels ofBcl-2andBcl-xLin HepG2 cells, thereby promoting apoptosis in cancer cells. Therefore, the alkaloids from Ba lotus seeds are a class of bioactive components with excellent anticancer effectin vitro.

Key words:Ba lotus seed; alkaloid; human hepatoma HepG2 cells; apoptosis; mRNA expression

莲子是睡莲科植物莲（Nelumbo nuciferaGaertn.）的干燥成熟种子，莲子作为一种传统滋补品，具有包括补脾止泻、止带、益肾涩精、养心安神等多种功效[1]。巴莲是一种产自于重庆地区的莲子，在重庆有较大面积的种植，含有包括生物碱等多种生物活性成分[2]。最近的研究显示巴莲具有抗氧化和抗炎等作用[3-5]，并且除了作为传统中药外和一般食用外，巴莲莲子已经被开发出包括保健饮料在内的多种加工食品[6]，是一种具有很好利用价值的天然植物产品。

植物中提取的生物碱大多具有一定的生物活性作用，已经被逐步应用到保健食品的开发上，同时通过现代分子生物学研究表明植物提取生物碱具有较好的降血压、抗炎和抗癌效果[7]，但是未见有对巴莲生物碱抗肝癌作用的研究。同时，有研究表明莲子生物碱包括莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱等20多种异喹啉生物碱，其丰富的生物碱成分可能也具有较好的生物活性作用，莲心生物碱将具有很好的开发利用价值[8]。

肝癌是一种在我国常发的恶性肿瘤，现在我国已成为全球肝癌发病率最高和病死数最多的国家，严重威胁我国国民的身体健康[9]。研究表明诱导癌细胞凋亡是控制癌症的一种有效方式，通过调节多个家族基因的表达可以起到抑制癌症的作用，包括对Bcl-2家族表达的调节，同时激活和提高Caspase家族基因表达也有利于癌症的治疗，并能调节癌细胞的死亡[10]。Bcl-2家族和Caspase家族基因表达在细胞凋亡中发挥着不可或缺的作用，通过食品中的有效生物活性成分的刺激，能够起到调节Bcl-2家族和Caspase家族基因表达作用，从而诱导癌细胞凋亡[11-12]。本研究通过体外实验，对巴莲莲子生物碱提取物的抗癌效果进行了初步研究，将为巴莲莲子生物碱的利用开发积累一定理论基础。

1 材料与方法

人肝正常细胞株L02和人肝癌细胞株HepG2购自于中国科学院细胞库。

DMEM液体培养基美国Hyclone公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）荧光染料北京索莱宝科技有限公司；CycleTESTTM Plus DNA染色试剂盒德国Becton Dickinson公司；Trizol试剂、Oligo(dT)18、RNase、dNTP、鼠白血病病毒（murine leukemia virus，MLV）美国Invitrogen公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物天根生化科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

Biomate3S紫外-可见光分光光度仪、3111二氧化碳培养箱、StepOne Plus定量PCR仪、LUX多功能酶标仪美国Thermo Fisher Scientifi c公司；ICEN-24R高速冷冻离心机杭州奥盛仪器有限公司。

将巴莲莲子冷冻干燥后磨成细粉，取100 g巴莲莲子粉末加入1 000 mL体积分数80%的乙醇溶液后，在50 ℃条件下提取1 h，然后收集过滤后的滤渣再重复以上方法再提取1 次，收集2 次的过滤液后在0 ℃条件下将滤液过732交换树脂收集3 h。然后用蒸馏水冲洗掉水溶性杂质后，以3 mL/min的速率用80%乙醇溶液洗脱生物碱。收集乙醇洗脱液后用旋转蒸发法蒸干乙醇得到巴莲莲子生物碱提取物[13]。

以甲基莲心碱标准品作为测定巴莲莲子生物碱提取物含量的对照物质，称取甲基莲心碱标准品溶于0.1 mol/L的盐酸溶液，配制成质量浓度为0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050 mg/mL的甲基莲心碱溶液，然后在276 nm波长处测定以上溶液的吸光度（A）。以A为纵坐标、甲基莲心碱质量浓度（ρ）为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程为A＝0.016 47ρ+0.014 57（R2＝0.999 9）[13]。

采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法，将L02和HepG2细胞接种于含体积分数10%灭活小牛血清的DMEM液体培养液中，放置于CO2培养箱中进行培养。培养一周后，弃去液体培养基，用0.05%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin ethylene diamine tetraacetic acid，Trypsin-EDTA）消化细胞，3 000 r/min离心分离5 min后，将收集到的细胞加入液体培养基，配制成密度为1×104个/mL的细胞悬液，按每孔200 μL接种于96 孔培养板中，继续在CO2培养箱中培养24 h后待细胞贴壁后弃去上层液体培养基，然后每孔加入200 μL不同质量浓度（50、100、200 μg/mL）的巴莲莲子生物碱提取物继续培养48 h。最后弃去上层液体培养基后每孔加入质量浓度为5 mg/mL含MTT试剂的液体培养基200 μL培养4 h后，每孔加入200 μL的DMSO振荡30 min，570 nm波长处测定各孔OD值，并按公式（1）、（2）[1]计算细胞存活率和增殖抑制率。空白组和不同质量浓度巴莲莲子生物碱提取物（处理组）各重复8 个平行。

采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法。使用Trizol试剂提取癌细胞的总RNA，将各样品组的总RNA质量浓度调整至1 μg/μL。每组各取2 μg的RNA加入到含有Oligo(dT)18、RNase、dNTP和MLV各1 μL，5×buffer 10 μL的PCR试管中合成cDNA（合成条件为37 ℃ 120 min、99 ℃ 4 min、4 ℃ 3 min），然后采用qRT-PCR法检测表达量。在20 μL总反应体系中加入合成出的2 μL cDNA、浓度为10 μmol/L，放入各1 μL的上、下游引物（表1）、10 μL的SYBR Premix ExTaqⅡ （2×）、0.4 μL的ROX reference dye（50×）和5.6 μL的灭菌双蒸水，充分混合后置于定量PCR仪中进行反应。扩增反应条件为95 ℃ 35 s；55～59 ℃ 30 s， 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40 个循环；95 ℃ 15 s。

表1 引物序列
Table 1 Primer sequences used in this study

采用DAPI染色法。收集巴莲莲子生物碱作用后的癌细胞，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗癌细胞2 次后3 000 r/min离心10 min弃去上层液，然后用体积分数3.7%的多聚甲醛常温条件下固定细胞，静置10 min后用DAPI荧光染料溶液染色10 min。最后再用PBS漂洗癌细胞2 次，荧光显微镜下观察癌细胞形态[14]。

使用SAS 9.1统计学软件对3 次平行实验结果的平均值进行分析，采用One-way ANOVA方法分析各组数据是否具有显著差异。

2 结果与分析

以甲基莲心碱回归曲线计算得到巴莲莲子生物碱提取物中生物碱成分的纯度达到67.4%，由此可以看出，在进一步的细胞实验中，起到核心生物活性作用的物质是巴莲莲子生物碱成分。

2.2 巴莲莲子生物碱对肝正常细胞L02、人肝癌细胞HepG2体外增殖的影响

图1 巴莲莲子生物碱对人肝正常细胞L02（A）和人肝癌细胞HepG2（B）增殖的影响（n＝8）8
Fig. 1 Effects of the alkaloids on the proliferation of human normal liver cell line L02 (A) and HepG2 (B) cells (n= 8)

表2 巴莲莲子生物碱对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制效果（n＝8）
Table 2 Inhibitory effects of the alkaloids on the proliferation of HepG2 c e lllss ((n= 8)

注：肩标字母不同表示组间存在显著性差异（P＜0.05）。

从图1可以看出，在质量浓度为0～200 μg/mL之间巴莲莲子生物碱对人肝正常细胞L02的增殖没有明显影响，L02细胞的生长率保持接近100%；在相同质量浓度巴莲莲子生物碱处理下HepG2细胞体外增殖率与巴莲莲子生物碱质量浓度呈负相关，巴莲莲子生物碱质量浓度越高，增殖率越低。结果显示在一定质量浓度范围内巴莲莲子生物碱仅对癌细胞有抑制作用，对正常细胞则没有明显作用。因此，本研究中选择50、100 μg/mL和200 μg/mL巴莲莲子生物碱进行研究。通过MTT法分析结果可知（表2），50、100 μg/mL和200 μg/mL的巴莲莲子生物碱对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制率分别达到20.2%、55.8%和79.6%，巴莲莲子生物碱对体外生长的HepG2细胞具有很好的抑制效果。

图2 巴莲莲子生物碱处理人肝癌细胞HepG2后的细胞凋亡情况
Fig. 2 Appearance of apoptotic body in HepG2 cells treated with the alkaloids

由图2可以看到，对照组的HepG2细胞的细胞核荧光亮度均匀，并且细胞核边缘较为清晰；经过巴莲莲子生物碱处理后的HepG2细胞的增殖数量减少，并且癌细胞的荧光状态显示癌细胞的边缘开始出现不规则，细胞的结构不完整，且随着质量浓度的提高癌细胞的结构越不完整，200 μg/mL处理条件下大部分的癌细胞的结构被完全破坏。可见巴莲莲子生物碱具有很好的癌细胞凋亡诱导作用。

图3 巴莲莲子生物碱对人肝癌细胞HepG2中相关基因mRRNNAA表达的影响（n＝33）
Fig. 3 Effects of the alkaloids on mRNA expression of relative genes in HepG2 cells (n=3)

由图3A～C可知，用50、100、200 μg/mL的巴莲莲子生物碱对体外培养的HepG2细胞进行处理后，Bax相对表达量均高于对照组，而Bcl-2和Bcl-xL相对表达量低于对照组。同时，随着巴莲莲子生物碱质量浓度的增加，Bax的表达强度也增加，而Bcl-2和Bcl-xL的表达呈现相反的趋势。由图3D～F可知，200 μg/mL的巴莲莲子生物碱处理的人肝癌细胞HepG2中caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达均强于50、100 μg/mL处理组的HepG2细胞，且巴莲莲子生物碱处理组的caspase-3、caspase-8和caspase-9表达均高于对照组。由图3G、H可知，对照组HepG2细胞中的p21和p53表达强度最低，随着巴莲莲子生物碱处理质量浓度的增加，HepG2细胞中的p21和p53表达逐步增加，200 μg/mL处理组的表达强度最高。

3 讨论

莲子心作为中药和保健食品已经被广泛使用，同时我国莲子心产量很大，现阶段的开发利用程度不够。前期已有研究表明巴莲莲子生物碱具有体外鼻咽癌细胞抑制效果[1]，本研究也得到了相似的结果，巴莲莲子生物碱对体外培养的人肝癌细胞HepG2具有较好的抑制效果。DAPI染色法染色后的凋亡癌细胞核能能发出蓝色荧光，通过从形态学上观察癌细胞蓝色荧光的情况可检测癌细胞的凋亡状态[12]。通过DAPI法也进一步证明巴莲莲子生物碱的抗肝癌作用源于其较好的癌细胞凋亡诱导能力。

Bcl-2家族蛋白是凋亡调节蛋白，在细胞凋亡中起关键性作用[15]。Bcl-2和Bcl-xL是典型的凋亡抑制因子，能阻止线粒体释放细胞色素c从而促进细胞增殖[16]。相反的，Bax是典型的凋亡促进因子，Bax与Bcl-2和Bcl-xL与机体的平衡，对癌症治疗的成功率有关[17]。正常组织中Bcl-2的分布有限，仅在胚胎早期组织、成熟淋巴细胞、上皮细胞和神经元等部位有少量表达，但是在包括肝癌组织的癌组织中表现出很强的表达[18]。而Bax则大量分布在人体正常组织和细胞中，癌组织中含量很少，Bcl-2和Bax的表达情况常被用以评价癌变程度[18-19]。巴莲莲子生物碱通过显著下调Bcl-2、Bcl-xL表达和上调Bax表达来实现促进肝癌细胞凋亡（P＜0.05）。

Caspases家族作为哺乳动物细胞中程序性死亡的介导者和执行者参与癌细胞的凋亡[20]。caspase-3、caspase-8和caspase-9均是参与细胞凋亡的蛋白酶，caspase-8和caspase-9是细胞凋亡通路的上游半胱天冬酶，可以激活下游的caspase-3[21]。caspase-3可引起癌细胞的周期阻滞、破坏癌细胞的修复，使癌细胞体系解体。且大多引起细胞凋亡需要通过caspase-3介导的信号传递途径诱导癌细细胞凋亡[22]。线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路是癌细胞凋亡的通路，且均需要Caspase家族激活后发生作用。caspase-9是重要的凋亡启动因子，能够起到激活下游Caspase和放大级联反应的作用，在凋亡通路中起到非常重要的作用[23]。caspase-8可激活Bax诱导线粒体和裂解Bcl-2家族成员Bid释放细胞色素c，进一步激活caspase-9和caspase-3，促进癌细胞凋亡[24-25]，同时使死亡受体通路和线粒体通路结合，放大凋亡信号促进癌细胞凋亡[26]。巴莲莲子生物碱通过增加肝癌细胞中的caspase-3、caspase-8、caspase-9表达促进癌细胞凋亡，起到体外抗癌效果。

p53是一个主要的肿瘤抑制基因，能调节控制细胞周期和修改DNA，同时能够诱导癌细胞凋亡，p53作为转录因子，能促进Bax参与线粒体介导的细胞凋亡通路[27]。p53的凋亡诱导作用是通过上调Bax和下调Bcl-2等过程来实现的。Bcl-2和p53有特异性的依赖，Bcl-2/Bax比值也是通过p53进行调节，从而调控癌细胞的凋亡过程[28]。p21蛋白可促进细胞凋亡，且在细胞凋亡过程中p21与Bax密切相关，能够增强Bax的表达[29]。p21还能够促使癌细胞发生周期阻滞，从而阻止癌细胞DNA损伤的修复[30]；同时，进一步的研究还显示p21对癌细胞的凋亡作用强于 Bcl-2对癌细胞的凋亡抑制作用[31]。可见，p53和p21都是重要的促凋亡因子。巴莲莲子生物碱通过提升p53和p21的表达来促进癌细胞凋亡，达到分子程度上的癌细胞凋亡条件。

巴莲莲子生物碱能够有效地抑制体外生长的人肝癌细胞HepG2，且对人正常肝细胞L02无明显的毒性作用。巴莲莲子生物碱能起到促进HepG2细胞凋亡的作用，随着巴莲莲子生物碱质量浓度的提高，更多的癌细胞被诱导出现凋亡。同时，进一步的实验结果证实巴莲莲子生物碱可以上调肝癌细胞的Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9、p53、p21的mRNA表达和下调Bcl-2、Bcl-xL的表达，从而起到促进HepG2细胞凋亡的作用。由此可见，巴莲莲子生物碱是一类具有抗癌活性的生物活性成分，具有良好的保健食品开发价值。

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In VitroAnticancer Activity of Alkaloids Extracted from Ba Lotus Seeds against Human Hepatoma HepG2 Cells

FENG Xia1, YI Ruokun1, SUN Peng1, PENG Deguang2, ZHAO Xin1,*
(1. Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food, Chongqing Engineering Research Center of Functional Food, Chongqing Engineering Laboratory for Research and Development of Functional Food, College of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China; 2. Chongqing Enterprise Engineering Research Center of Ba-lotus Breeding and Deep Processing, Chongqing 400041, China)

冯霞, 易若琨, 孙鹏, 等. 巴莲莲子生物碱提取物对人肝癌细胞HepG2的体外抗癌效果[J]. 食品科学, 2017, 38(19):206-211. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201719033. http://www.spkx.net.cn

FENG Xia, YI Ruokun, SUN Peng, et al. In vitro anticancer activity of alkaloids extracted from Ba lotus seeds against human hepatoma HepG2 cells[J]. Food Science, 2017, 38(19): 206-211. (in Chinese with English abstract)

基金项目：重庆高校创新团队建设计划资助项目（CXTD201601040）；

重庆市工程技术研究中心建设项目（cstc2015yfpt_gcjsyjzx0027）；重庆第二师范学院校级科研项目（KY201523B）

作者简介：冯霞（1976—），女，副教授，硕士，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：fengxiacqec@126.com

*通信作者：赵欣（1981—），男，教授，博士，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：zhaoxin@cque.edu.cn

巴莲莲子生物碱提取物对人肝癌细胞HepG2的体外抗癌效果

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨 论

3 讨论