刘羽霏，方 祥，廖振林，王 丽，钟青萍*
（华南农业大学食品学院，广东省食品质量与安全重点实验室，广东 广州 510642）
摘 要：定量检测不同诱导条件下的活的非可培养（viable but non-culturable，VBNC） 状态副溶血弧菌的变化情况，并对VBNC菌的呼吸活性进行分析。采用叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，PMA）与荧光定量聚合酶链式反应（fl uorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）结合的技术（PMA-qPCR）定量检测副溶血弧菌活菌数。结合激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪优化传统CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）呼吸检测法对VBNC状态的副溶血弧菌进行分析。结 果表明PMA-qPCR检测技术结合平板计数的方法，可用于定量检测副溶血弧菌诱导过程中活菌数和可培养菌数的变化情况，并利用差值测定出VBNC细胞的浓度。在不同的温度、NaCl含量和氯霉素含量的诱导条件下，副溶血弧菌在其中的7 种条件下在60 d内进入了VBNC状态。VBNC细胞终浓度最低为5.75×102CFU/mL，最高为1.70×105CFU/mL。在细胞呼吸实验中，采用CTC与4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）双染法能在激光扫描共聚焦显微镜下清晰地观察到VBNC细胞表面的红色荧光，有效区分死活细胞。同时利用流式细胞仪能够根据荧光强度快速区分呼吸活性呈阴性和阳性的细胞。本研究为VBNC细菌的检测和生理特性的研究提供了新的思路和依据。
关键词：副溶血弧菌；活的非可培养（VBNC）状态；PMA-qPCR；流式细胞仪；激光扫描共聚焦显微镜
Abstract: The aims of the study were to quantitatively monitor viable but non-culturable (VBNC) cells of Vibrio parahae molyticus induced by different conditions and to analyze th eir respiratory activity. Fluo rescence quantitative PCR(qPCR) coupled with prop idium monoazide (PMA-qPCR) was used to quantify viable cells of V. parahaemolyticus. A new method combining confocal laser-scanning microscopy (CLSM) and fl ow cytometry with 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC) reduction was applied to detect the respiratory activity of VBNC cells. Results s howed that PMA-qPCR with culture-based method allo wed successful monitoring of the number of VBNC cells of V. parahaemolyticus and then the density of VBNC cells could be calculated. Seven of the tested conditions could entirely induce cells into VBNC state within 60 day. The minimum and maximum density of VBNC cells were 5.75 × 102and 1.70 × 105CFU/mL,respectively. In the respiration test, 5-cyano-2,3-ditol yl tetrazolium chloride/ 4’,6-diamidino-2-phenylindole (CTC/DAPI) staining allowed to clearly distinguish viable cells from dead cells under CLSM by fl uorescent formazan. Flow cytometry enabled rapid discrimination between respiratory active and non-active cells based on fl uorescence intensity.In summary, this study provided new methods for the detection of V. parahaemolyticus in VBNC state and for better understanding of their metabolism.
Key words: Vibrio parahaemolyticus; viable but non-culturable(VBNC); fluorescence quantitative PCR combined with propidium monoazide (PMA-qPCR); fl ow cytometry; confocal laser-scanning microscopy (CLSM)
DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720031
副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种革兰氏阴性兼性厌氧菌，主要存在于海产品和盐渍食品中。人食用了受该菌污染且未煮熟的海产品后，会出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐等症状，重症患者还会脱水、休克昏迷，甚至死亡。该菌引起的食物中毒在我国境内[1-2]乃至全球多地均有报道[3-4]。
活的非可培养（vi able but non-culturable，VBNC）状态是由Xu Huaishu等[5]通过对水环境中大肠杆菌（Escherichia coli）和霍乱弧菌（Vibrio cholera）的研究首次提出的概念。VBNC状态是指细菌于常规条件下培养时，不生长繁殖，但仍具有代谢活性的活菌的一种“休眠状态”[6-7]。研究发现细胞在处于极端温度、营养缺乏、渗透压冲击、甚至是强烈的白光照射等环境压力下，会进入VBNC状态[8-10]。VBNC状态的发现很快引起了微生物学界的重视，不断有新的病原菌被发现能够进入VBNC状态[11]，这无疑对食品安全和人类健康构成了潜在威胁。
VBNC状态细胞的检测与鉴定一直受到研究者的广泛关注。叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，PMA）与荧光定量聚合酶链式反应（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）结合的技术（PMA-qPCR）是近几年兴起的一种能有效区分活细胞与死细胞的检测技术[12-13]。利用PMA不能透过完整的细胞膜，能选择性地与细胞膜破损的死细胞DNA分子结合从而阻断DNA分子的PCR扩增的特点[14]，克服了传统PCR不能区分死活细胞的缺点[15]。这种方法被证实可用于VBNC状态细菌的检测[16-17]，并且该技术具有准确定量的能力。呼吸检测法是根据细胞新陈代谢过程中的氧化还原能力采取的检测手段。CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是一种常用的细胞呼吸指示剂[18]，可用来检测细菌的呼吸活性。但传统的使用单一CTC染料的呼吸检测法因结果不易被观察易造成误检而受到应用上的限制[19]。4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）是一种核酸染剂，能透过细胞膜与DNA结合，发出蓝色荧光，多应用于细胞定位[20]和计数[21]。采用CTC/DAPI双染的方法能在显微镜下清晰地观察到细胞位置及其呼吸活性。多种染料配合作用及结合激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪等新技术的应用，提高了呼吸检测法的准确性，为VBNC检测提供了新思路[22-23]。
本研究采用实验室建立的PMA-qPCR方法对VBNC状态的副溶血弧菌进行定量检测，并采用与激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪结合的细胞呼吸检测法对其生理特性进行分析。为VBNC状态副溶血弧菌的检测和生理特性的研究提供参考资料。
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
本实验所用标准菌株副溶血弧菌ATCC17802，购自广东省菌种保藏中心，贮存于-80 ℃。
1.1.2 培养基
含质量分数3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基（TSB）：胰蛋白胨15 g/L，大豆蛋白胨5 g/L，氯化钠30 g/L，最终pH值为7.3±0.2。在TSB中添加质量分数1.8%的琼脂粉后即为质量分数3%胰蛋白胨大豆肉汤固体培养基（TSA），用于平板计数法测定细菌可培养数。
1.1.3 试剂
PMA 美国Biotium公司；qPCR反应试剂盒（SGExcel FastSYBR Mixture（Plus）） 上海生工生物工程股份有限公司；LIVE/DEAD细胞试剂盒 南京凯基生物科技发展有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒 北京索莱 宝生物技术股份有限公司；CTC日本同仁化学研究所；DAPI 美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
生化培养箱 美国Thermo Scientifi c公司；台式高速冷冻离心机 德国Eppe ndorf公司；CFX96 Touch™ qPCR仪美国Bio-Rad公司；卤钨灯（650 W） 德国Osram公司；荧光显微镜 德国Leica公司；LSM 780激光共聚焦扫描显微镜 德国Zeiss公司；Fortessa X-20流式细胞仪美国BD公司。
1.3 方法
1.3.1 副溶血弧菌VBNC状态的诱导
将细菌接种到含质 量分数3% NaCl的TSB培养基中，37 ℃、150 r/min摇床培养14 h至对数生长期。取对数生长期 的菌悬液，8 000 r/min离心5 min，弃去上清液，用灭菌的3% NaCl溶液清洗菌体2 次，将菌体分成3 组，第1组用3% NaCl溶液稀释菌体，诱导温度分别为-20、4、28 ℃和56 ℃；第2组分别用质量分数0.5%、1%、10%和15%NaCl溶液稀释菌体，诱导温度为4 ℃；第3组用3%NaCl溶液稀释菌体，加入一定量的氯霉素溶液使诱导液中氯霉素含量分别达到1/2 MIC、1 MIC、2 MIC和4 MIC（氯霉素MIC为0.625 μg/mL），诱导温度为4 ℃。各诱导液中细菌初始浓度约为1×107CFU/mL。
1.3.2 PMA-qPCR定量检测
1.3.2.1 PMA处理
用ddH2O配制20 mmol/L的PMA贮存液，-20 ℃避光保存。在1.5 mL离心管中加入0.5 mL菌液，加入终浓度为20 μmol/L的P MA，充分混匀，避光处理5 min。然后将离心管开盖置于冰上，在650 W卤钨灯下曝光15 min，样品距离灯管20 cm[24]。处理后的样品12 000 r/min离心5 min并用0.01 mol/L 磷酸缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤除净残留的PMA。按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取DNA，进行qPCR检测。
1.3.2.2 qPCR方法的建立
根据GenBank中已发表的副溶血弧菌ATCC 17802菌株的tlh基因序列（基因序列号JX262976.1），利用Primer 5.0 软件设计一对引物。上游引 物：5’-TCGTGCGAAAGTGCTTGAGATG-3’，下游引物：5’-CGGTGAGTTGCTGTTGTTGGAT-3’，扩增产物长度为288 bp。优化后的qPCR反应体系为25 μL，含DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL（终浓度0.2 μmol/L），预混体系12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反应程序：95 ℃预变性3 min， 95 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40 个循环，同时收集荧光，循环结束后72 ℃保持5 min。溶解曲线分析：65～95 ℃，每5 s升高0.5 ℃。
绘制标准曲线：按细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取副溶血弧菌的DNA，对其进行10～107倍梯度稀释作为qPCR的模板。以循环数Ct值和细菌浓度（平板计数）绘制标准曲线。
1.3.3 VBNC状态副溶血弧菌的确认
可培养菌数用平板计数法测定，活菌数用PMA-qPCR定量检测。每隔一定时间对诱导样品中的可培养菌数和活菌数进行计数。活菌数与可培养菌数的差值即为VBNC状态菌数。当诱导至可培养菌数为0，而活菌数不为0时，即可认为细菌全部进入了VBNC状态。最后用LIVE/DEAD细胞试剂盒染色后在荧光显微镜下观察以确认细胞的死活状态。
1.3.4 细胞 呼吸法分析副溶血弧菌的VBNC状态
将样品分成2 组，一组用于流式细胞仪分析，一组用于激光扫描共聚焦显微镜观察。
根据产品使用说明，在1 mL样品中加入CTC染料37 ℃孵育60 min。然后用500 μL PBS冲洗，4 ℃、10 000 r/min离心5 min，去除上重悬液，用于流式细胞仪的分析。第2组在样品染色离心后加入100 μL PBS重悬细胞，将10 μL细胞放至玻片上。在冰上静置30 min，使细胞黏附于玻片上，然后用10 μL 4%多聚甲醛溶液在冰上固定30 min。用5 μL 5 μg/mL的DAPI给细胞DNA染色10 min，之后用PBS冲洗2 次，盖上盖玻片，用固封剂密封，用于激光扫描共聚焦显微镜的观察。CTC和DAPI的激发波长/发射波长分别为488/650 nm和364/385～470 nm。
2.1 qPCR的标准曲线
在1.2×102～1.2×109CFU/mL的细菌浓度范围内，荧光信号到达设定域值时所经历 的循环数Ct（y）与细菌浓度（lg（CFU/mL））（x）呈现良好的线性关系，y=3.236 4x+45.189，R2=0.999 6，在此范围内可用Ct值对样品中的活菌数进行定量分析。
2.2 不同温度诱导条件下副溶血弧菌的定量检测
结合平板计数和PMA-qPCR的方法，对在不同温度诱导条件下的副溶血弧菌的可培养菌数和活菌数的变化进行测定。样品分别在4 种温度（-20、4、28 ℃和56 ℃）条件下进行诱导。诱导60 d的情况如图1所示。-20、4 ℃和56 ℃的样品在60 d内进入VBN C状态，可培养菌数为0时活菌数不为0，此时的所有活菌均进入VBNC状态。诱导时间从短到长依次为56、-20、4 ℃，VBNC状态细胞终浓度从多到少依次为4、56、-20 ℃。3 种诱导条件下VBNC状态细胞终浓度均在5.75×102CFU/mL以上，其中4 ℃达到约1×105CFU/mL。在28 ℃诱导条件下，副溶血弧菌并未在60 d内进入VBNC状态。其可培养菌数与活菌数的变化曲线几乎一致，无明显差异（P＞0.05）。
图1 不同温度诱导条件下副溶血弧菌可培养菌数和活菌数的变化
Fig. 1 Quantitative detection of V. parahaemolyticus induced at different temperatures
2.3 不同NaCl含量诱导条件下副溶血弧菌的定量检测
图2 不同盐浓度诱导条件下副溶血弧菌可培养菌数和活菌数的变化
Fig. 2 Quantitative detection of V. parahaemolyticus induced by different salinities
如图2所示，60 d内细胞进入VBNC状态的诱导条件为质量分数0.5%、10%、15% NaCl。在0.5% NaCl的诱导条件下副溶血弧菌在第40天完全进入VBNC状态，在10% NaCl和15% NaCl的诱导条件下诱导时间则缩短至5 d。3 种诱导条件下VBNC状态细胞终浓度均达到约104CFU/mL，其中在15% NaCl条件下最高，为1.7×105CFU/mL。在1% NaCl诱导条件下，副溶血弧菌并未在60 d内全部进入VBNC状态。但活菌数与可培养菌数间差异明显（P＜0.05）。
2.4 不同氯霉素含量诱导条件下副溶血弧菌的定量检测
图3 不同氯霉素含量诱导条件下副溶血弧菌可培养菌数和活菌数的变化
Fig. 3 Quantitative detection of V. parahaemolyticus induced by different concentrations of chloramphenicol
如图3所示，60 d内细胞全部进入VBNC状态的诱导条件只有4 MIC，诱导时间为50 d，VBNC状态细胞终浓度为2.5×103CFU/mL。在1/2 MIC、1 MIC和2 MIC诱导条件下，副溶血弧菌均未在60 d内全部进入VBNC状态。可培养菌数与活菌数的变化曲线几乎一致，差异不明显（P＞0.05）。
2.5 荧光显微镜观察结果
利用LIVE/DEAD细胞试剂盒能在荧光显微镜下观察染色后的细胞，确认细胞的死活状态。在荧光显微镜中，不同波长激发光下，活细胞呈现绿色，死细胞呈现红色。对副溶血弧菌的正常状态、VBNC状态和死亡状态的观察结果如图4。正常状态下的副溶血弧菌主要呈现绿色；死亡状态下的副溶血弧菌呈现红色。而处于VBNC状态下的副溶血弧菌仍有大部分呈现绿色。可见完全处于VBNC状态下的副溶血弧菌中仍存在相当多的活细胞，从而可以确认这些VBNC状态的细胞具有活性。
图4 荧光显微镜下不同状态的副溶血弧菌
Fig. 4 Morphological features of V. parahaemolyticus in different states under fl uorescence microscope
2.6 细胞呼吸活性检测结果
CTC实验能够通过分析细胞的呼吸活性确定细胞的活力。本研究利用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪共同分析了正常状态、VBNC状态和死亡状态的副溶血弧菌的呼吸活性。
图5 CTC/DAPI细胞双染的激光扫描共聚焦显微镜观察结果
Fig. 5 Confocal laser-scanning micrographs of the cells stained with CTC/DAPI
如图5所示，通过呼吸活动中电子递质的作用，CTC被还原成CTC甲臜，在细胞表面发出红色荧光；DAPI能与DNA结合发出蓝色荧光，确定细胞位置用于细胞计数。正常状态下，细胞的电子传递活跃，细胞表面呈现较多红色荧光，红色荧光强度大；死亡状态下，细胞电子传递停止，没有红色荧光生成。而处于VBNC状态的细胞表面能够观察到明显的红色荧光，且红色荧光强度较大，说明此时的细胞仍具有良好的呼吸活性。
流式细胞仪的分析结果与之相似（图6）。正常状态下，大部分细胞位于P2；死亡状态下，细胞则集中在P1。而处于VBNC状态的细胞中有9.27%分布于阳性区域，具有呼吸活性。
图6 CTC细胞染色的流式细胞仪分析结果
Fig. 6 Cytograms of the cells stained with CTC
VBNC状态是一种细菌处于环境压力下采取的生存机制。因具有不可培养的特点，对其检测和鉴定方法的研究受到广泛的关注。本研究采用PMA-qPCR的检测技术结合平板计数的方法，定量监控副溶血弧菌 诱导过程中活菌数和可培养菌数的变化情况，同时测定出VBNC状态细胞的浓度。研究设置了3 组共12 种条件诱导副溶血弧菌进入VBNC状态，其中7 种条件下副溶血弧菌在60 d内进入了VBNC状态。通过活菌数和可培养菌数的差值得出VBNC状态细胞的浓度，7 种诱导条件中VBNC状态细胞终浓度最低为5.75×102CFU/mL，最高为1.70×105CFU/mL。从活菌数和可培养菌数的差值也可看出，VBNC状态的细胞在诱导过程中已经出现，而非等到全部细胞进入不可培养状态时才出现[25]。另外有5 种条件在小于60 d内诱导副溶血弧菌进入VBNC状态。其中，部分条件下可培养菌数与活菌数的曲线变化差异不明显（P＞0.05），这些条件可能不足以使副溶血弧菌进入VBNC状态；另一部分条件下可培养菌数与活菌数的曲线变化差异明显（P＜0.05），说明在大于60 d的足够诱导时间下这些条件可能使副溶血弧菌进入VBNC状态[26]。
LIVE/DEAD细胞试剂盒能将死细胞和活细胞染上不同的颜色，在荧光显微镜下观察染色后的细胞，可以确认细胞的死活状态。这种方法常被用于确认VBNC状态细胞的存在。在荧光 显微镜下可以看出大量VBNC状态细胞发出绿色荧光，从而证实它们的活性。
根据细菌处于VBNC状态下仍然具有代谢活性这一特点，本研究采用CTC染色结合激光扫描共聚焦显微镜观察和流式细胞仪的方法，证实并分析了VBNC状态副溶血弧菌的呼吸活性。在CTC/DAPI的双染实验中，在激光扫描共 聚焦显微镜下可以清晰地看出VBNC状态细胞与死亡 细胞的差异。VBNC状态细胞表面呈现明显的红色荧光，说明它们仍然具有较强呼吸活性。与传统的CTC呼吸法相比，DAPI能帮助确定细胞的位置，更直观和清晰地观察具有呼吸活性的细胞[27]。在流式细胞仪的分析中，代表VBNC状态的样品中有9.27%的细胞处于阳性区域，而死细胞中处于阳性区域的细胞几乎为零。这进一步证实处于VBNC状态的副溶血弧菌仍然具有呼吸活 性。然而，实验中所用的样品是诱导后的菌液，故样品中可能混有一定量的死细胞。若能采取进一步的措施将样品中的死细胞与VBNC状态细胞区分开，例如结合能区分死活细胞的染料的使用[28]，便可在利用流式细胞分析技术快速定量检测VBNC细胞同时对其代谢活性进行测定[29-30]。
本研究应用PMA-qPCR技术定量检测了副溶血弧菌在诱导过程中活菌数的变化情况，结合平板计数法定量检测出处于VBNC状态的细胞的浓度，证明该方法能够快速准确地测定处于VBNC状态的细菌。其次将CTC呼吸实验结合激光扫描共聚焦显微镜和流式细 胞分析技术证实了处于VBNC状态的副溶血弧菌仍然具有呼吸活性，为VBNC状态细菌的检测和生理特性分析提供了新的思路和依据。
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Quantitative Detection of Viable but Non-Culturable (VBNC) Vibrio pa rahaemolyticus Cells Ind uced by Different Conditions Using PMA-q PCR and Respiratory Activity Analysis
LIU Yufei, FANG Xiang, LIAO Zhenlin, WANG Li, ZHONG Qingping*
(Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, College of Food Science,South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)
中图分类号：TS201.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）20-0215-07
收稿日期：2017-04-12
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31271956）；广东省自然科学基金项目（2017A030313146）
作者简介：刘羽霏（1992—），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物。E-mail：230742195@qq.com
*通信作者：钟青萍（1967—），女，副教授，博士，研究方向为食品安全、食品微生物。E-mail：zhongqp@scau.edu.cn
引文格式：
刘羽霏 , 方祥, 廖振林, 等. 不同诱导条件下的VBNC状态副溶血弧菌的PMA-qPCR定量检测及其 呼吸活性分析[J].食品科学, 2017, 38(20): 215-221. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720031. http://www.spkx.net.cn
LIU Yufei, FANG Xiang, LIAO Zhenlin, et al. Quantitative detection of viable but non-culturable (VBNC) Vibrio parahaemolyticus cells induced by different conditions using PMA-qPCR and respiratory a ctivity analysis[J]. Food Science, 2017,38(20)∶ 215-221. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720031. http∶//www.spkx.net.cn