阪崎克罗诺杆菌单克隆抗体的制备及其间接竞争-ELISA检测方法

翟绪昭1,曾海娟1,王广彬2,董庆利1,谢曼曼1,丁承超1,刘武康1,王淑娟1,李 杰1,刘 箐1,*

(1.上海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093;2.徐州绿健乳品饮料有限公 司,江苏 徐州 221006)

摘 要:以阪崎克罗诺杆菌标准菌株ATCC 29004免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,经过两次细胞融合共制备出7 株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1E9、2A7、2D10、3E5、5B10、6E3、12A2)。其中2A7、2D10、3E5、12A2的效价达到了1∶256 000,6E3的效价为1∶128 000,5B10的效价为1∶64 000,1E9的效价为1∶32 000。亚型鉴定结果显示1E9的亚型为IgG1,6E3的亚型为IgG2b,其余抗体2A7、2D10、3E5、5B10、12A2的亚型均为IgG2a。对7 株抗体进行特异性检测结果显示,2A7能与3 株阪崎克罗诺杆菌(ATCC 29004、ATCC 29544、ATCC 12868)都结合,1E9能与其中两株(ATCC 29004、ATCC 12868)结合,且与其他11 株类似菌和常见致病菌交叉反应结果显示7 个抗体均有良好的特异性。用2A7建立的间接竞争酶联免疫吸附测定法对阪崎克罗诺杆菌的检测灵敏度可达到106CFU/mL。

关键词:阪崎克罗诺杆菌;单克隆抗体;间接竞争ELISA

Abstract: BALB/c mice were immunized with Cronobacter sakazakii type strain ATCC 29004. Seven strains (1E9, 2A7,2D10, 3E5, 5B10, 6E3, and 12A2) of hybridoma cell lines that secreted monoclonal antibodies were prepared by two cycles of cell fusion using hybridoma technique. The titers of 2A7, 2D10, 3E5 and 12A2 reached 1∶256 000, the titer of 6E3 was 1∶128 000, the titer of 5B10 was 1∶64 000 and the titer of 1E9 was 1∶32 000. The results of subtype identifi cation showed that the subtype of 1E9 was IgG1, the subtype of 6E3 was IgG2b, and the subtypes of the other antibodies 2A7, 2D10, 3E5,5B10 and 12A2 were all IgG2a. 2A7 could specifi cally bind to 3 strains of Cronobacter sakazakii (ATCC 29004, ATCC 29544, and ATCC 12868), and 1E9 could specifi cally bind to two of them (ATCC 29004 and ATCC 12868). The results of crossreaction with 11 other similar pathogens showed that 7 antibodies had good specifi city. The sensitivity of indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) using 2A7 reached 106CFU/mL for the detection of Cronobacter sakazakii.

Key words: Cronobacter sakazakii; monoclonal antibodies; indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720039

阪崎克罗诺杆菌原名阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii,Cs),是一种革兰氏阴性无芽孢杆菌,兼性厌氧,通过周生鞭毛运动,是肠道正常菌群的一种,属于条件致病菌,婴幼儿特别是低出生体质量的早产儿(出生体质量低于2 500 g)以及免疫缺陷的成年人和老人是其易感人群[1]。Cs感染的临床症状包括坏死性小肠结肠炎、菌血症、脑膜炎等,致死率高达40%~80%,并且一些幸存者可能遭受严重的神经系统并发症[2-3]。Cs感染事件爆发的污染源主要包括婴幼儿配方奶粉、动植物来源的原材料以及生鲜、冷冻食品等[4-5]

目前,Cs的检测主要依靠传统的生化检测和分子生物学检测。现今通用的ISO-TS 22964-2006检测方法得到检测结果需要5~7 d[6]。法国梅里埃公司的API 20E、ID 32E等自动化检测系统由于数据库的限制也被证明检测结果不够准确[7]。实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)[8-9]、环介导等温扩增技术[10]、荧光原位杂交[11]、变性高效液相色谱[12]等方法虽然特异性和灵敏度较好,但存在操作复杂,对操作人员技术要求较高,设备昂贵等问题,不易于推广应用。

免疫分析技术主要是利用抗体能够与相应抗原及半抗原发生自发、高选择性的特异性结合这一性质,通过将特定抗体(或抗原)作为选择性试剂来对相应待测抗原(或抗体)进行分析测定的方法,具有分析时间短、灵敏度高、特异性好的优点[13-14]。用于Cs检测的免疫学方法主要包括酶联免疫[15]、胶体金试纸条[16]、免疫磁珠[17]等,这些方法的灵敏度和特异性依赖于所使用抗体的性能。基于高性能单克隆抗体的免疫分析技术为快速准确检测Cs提供了可能。本实验拟制备亲和力高,特异性好的抗Cs单克隆抗体,并在此基础上设计一种间接竞争酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定法用于Cs的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 菌种

Cs标准菌株(ATCC 29004、ATCC 29544、ATCC 12868)、产气肠杆菌(ATCC 13048)、甲型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50093)、乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094)、肺炎克雷伯菌(CMCC(B)46117)、蜡样芽孢杆菌(CMCC(B)63303)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)、鲍氏志贺菌(ATCC 9207)、宋氏志贺菌(ATCC 25931)、肠出血性大肠埃希菌O157:H7(ATCC 43895)、单核细胞性李斯特菌(ATCC 19114)、小肠结肠炎耶尔森菌(ATCC 23715)为上海理工大学有害微生物危害与控制研究所保存。

1.1.2 实验动物

小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为上海理工大学有害微生物危害与控制研究所保存;6~8 周龄雌性BALB/c小鼠购自第二军医大学动物中心。

1.1.3 试剂

液体石蜡、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、HAT(50×)培养基、HT(50×)培养基、HRP标记羊抗鼠IgG抗体 美国Sigma公司;Taq DNA聚合酶及其他PCR试剂 上海生工生物工程有限公司;DMEM高糖培养基 美国Gibco公司;胎牛血清 上海Biosun公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、青链霉素混合液(双抗) 美国Hyclone公司;单克隆抗体亚类鉴定二抗 洛阳佰奥通实验材料中心;Protein G亲和层析柱 美国GE Healthcare公司;25 mL细胞培养瓶、细胞冻存管、酶标板 无锡耐思生物科技有限公司;96 孔细胞培养板、24 孔细胞培养板美国Costar公司;其余常规试剂均为国产分析纯。

1.1.4 仪器与设备

PCR仪 美国Applied Biosystems公司;凝胶成像仪英国Syngene公司;CO2恒温培养箱 美国Thermo公司;多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司;Mini-power电泳仪、蛋白纯化仪、Mini-PROTEAN Tetra电泳仪 美国伯乐公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原准备

将3 株Cs复苏划平板,挑选典型单个菌落进行PCR鉴定,PCR鉴定引物由生工生物工程股份有限公司合成,其核苷酸序列为WFB1:GGG TTG TCT GCG AAA GCG AA;WFB2:GTC TTC GTG CTG CGA GTT TG。确定菌株的准确性后将细菌养至饱和,测定3 株菌的饱和菌液在600 nm波长处的OD值,选取OD值最高的一株菌用0.3%甲醛溶液进行灭活处理,灭活后将细菌用PBS洗涤3 次,调整菌液浓度至OD600nm为0.6。

1.2.2 小鼠免疫

选用6 只状态良好的6~8 周龄雌性BALB/c小鼠用制备好的菌液进行全菌免疫,采用腹腔注射的方式,按免疫剂量分为3 组,每组2 只,免疫剂量分别为0.2、0.3、0.4 mL。初次免疫过后分别于第14天、第28天、第42天进行加强免疫,第4次免疫过后第7天进行断尾取血,收集小鼠血清,将小鼠血清分别倍比稀释400、800、1 600、3 200、6 400、12 800、25 600、51 200 倍用间接ELISA方法进行血清效价测定,以实验组OD450nm/阴性对照组OD450nm大于等于2.1判定为阳性,以结果为阳性的最大稀释倍数为小鼠血清效价。选取效价最高的一组小鼠分别于融合前72 h进行冲击免疫,免疫剂量适当增加。

1.2.3 细胞融合及筛选

融合前30 d进行小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的复壮筛选。融合前1 d,取正常BALB/c小鼠的腹腔巨噬细胞为饲养层细胞。将超免3 d后的小鼠脊椎脱臼致死后摘取脾脏,冲洗研磨出脾细胞,将SP2/0和脾细胞按1∶5的比例用50%的PEG作为融合剂进行细胞融合,融合后按1×105个/孔铺于已铺饲养层细胞的96 孔板中,放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。用含HAT的培养基进行杂交瘤细胞的筛选,待细胞铺满50%孔底的时候,用间接ELASA法对细胞上清液进行效价测定,选取阳性孔用有限稀释法进行亚克隆。亚克隆过程中改用HT培养基对杂交瘤细胞进行进一步的筛选,共进行两次以上亚克隆,每次克隆的阳性孔细胞都扩大培养并冻存。

1.2.4 单克隆抗体腹水的制备

采用动物体内诱生法[18],选用状态良好8 周龄BALB/c小鼠,每只小鼠腹腔注射0.5 mL液体石蜡。7 d后,将扩大培养的杂交瘤细胞用生理盐水重悬后,按106个/只腹腔注射小鼠,待小鼠腹部明显膨大后,收集腹水,4 000 r/min离心5 min,取上清液。腹水用饱和硫酸铵法粗提后,用Protien G柱亲和层析进行纯化,纯化后的抗体用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)进行纯度分析。

1.2.5 抗体亚型测定

采用间接ELISA方法,按照抗体亚型(IgA、IgG 1、IgG 2a、IgG 2b、IgG 3、IgM)测定试剂盒说明书进行抗体亚型的测定。

1.2.6 抗体效价测定

将纯化后的抗体倍比稀释1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000、64 000、128 000、256 000 倍用间接ELISA法进行抗体效价的测定,结果以阳性的最大稀释倍数为抗体的效价。

1.2.7 抗体特异性测定

采用间接ELISA方法,测定抗体与3 株Cs(ATCC 29004、ATCC 29213、ATCC 29544)以及产气肠杆菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、鲍氏志贺菌、宋氏志贺菌、肠出血性大肠埃希菌O157:H7、单核细胞性李斯特菌等共14 株菌是否有交叉反应。

1.2.8 间接竞争ELISA检测方法的建立

间接竞争ELISA的过程为饱和Cs 100 μL/孔包被96 孔板,37 ℃孵育2 h,用磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered saline with Tween 20,PBST)洗3 次,然后用3%脱脂奶粉封闭1 h,将待测样品与一抗混合,37 ℃孵育1 h,PBST洗3 次,加入HRP标记的羊抗鼠二抗,孵育1 h后用PBST洗3 次,3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)显色液显色15 min,加入终止液后测定OD450nm值。选用两块96 孔板A、B进行包被,A板为实验组,B板为对照组,以实验组OD450nm值/对照组OD450nm值为0.5时对应的菌浓度为IC50值。本实验选用对照组OD450nm值为1.0时一抗的稀释倍数为一抗的工作浓度,因而结果判定以OD450nm值低于0.5时判定为阳性。

2 结果与分析

2.1 抗原鉴定

选用Cs标准菌株(ATCC 29004、ATCC 29544、ATCC 12868)复苏划平板,挑选典型单个菌落进行PCR鉴定,鉴定结果如图1所示,3 株Cs标准菌株均在282 bp处出现明显电泳条带,与Cs特异性基因条带大小一致,说明3 株菌株均为Cs。

图1 克罗诺菌株PCR鉴定
Fig. 1 PCR identifi cation of Cronobater sakazakii

2.2 小鼠血清效价

表1 小鼠血清效价(OD450 nm
Table 1 Serum antibody titers of mice (OD450 nm)

第4次免疫后,小鼠血清效价测定结果如表1所示,阴性对照OD450nm为0.070 35,1~6号小鼠的血清效价分别为1∶51 200、1∶51 200、1∶25 600、1∶25 600、1∶25 600、1∶25 600,免疫剂量为0.2 mL的一组小鼠血清效价最高,因而选用该组小鼠进行杂交瘤细胞融合。

2.3 单克隆抗体纯化效果分析

如图2所示,经饱和硫酸铵沉淀和Protien G柱亲和层析后,7 个抗体SDS-PAGE图均在25 kD左右出现一条轻链,在50~60 kD左右出现一条重链,且无明显杂带,这表明7 个抗体纯化效果较好,纯化后的抗体纯度较高。

Fig. 2 SDS-PAGE patterns of monocolonal antibodies from serum of mice

2.4 抗体亚型鉴定结果

表2 抗体亚型测定结果(OD450 nm
Table 2 Identifi cation of antibody subtypes (OD450 nm)

7 个抗体亚型鉴定结果如表2所示,1E9的亚型为IgG1,6E3的亚型为IgG2b,其余5 个抗体2A7、2D10、3E5、5B10、12A2的亚型均为IgG2a。

2.5 抗体效价测定结果

图3 抗体效价
Fig. 3 Titers of seven antibodies

如图3所示,7 个抗体中2A7、2D10、3E5、12A2的效价达到了1∶256 000,6E3的效价为1∶128 000,5B10的效价为1∶64 000,1E9的效价为1∶32 000。

2.6 抗体特异性测定结果

7 个抗体分别与3 株Cs以及产气肠杆菌、肠出血性大肠埃希菌O157∶H7、肺炎克雷伯菌等11 株菌交叉反应的结果如表3所示,其中2A7能够和3 株Cs都交叉,1E9能够和Cs ATCC 29004以及Cs ATCC 12868两株克罗诺杆菌结合,且7 个抗体均有较好的特异性。鉴于2A7能够实现对3 株Cs的全检,因而选用2A7进行间接竞争ELISA检测方法的建立。

表3 抗体的特异性分析
Table 3 Specifi city of antibodies

注:+.有交叉反应;-.无交叉反应。

2.7 间接竞争ELISA检测方法的建立

采用2A7进行间接竞争ELISA检测方法的建立,当抗体稀释倍数为16 000时,OD450nm值为1.0,因而选用1∶16 000为一抗的工作浓度,即抗体用量为12.5 ng。灵敏度检测结果如图4所示,可知对Cs的检测灵敏度可达到106CFU/mL。

图4 间接竞争ELISA方法的检测限分析
Fig. 4 Detection limit of indirect-competitive ELISA

3 讨 论

克罗诺杆菌是污染婴幼儿配方奶粉的主要致病菌,是一种较低致病剂量的致病菌,关于克罗诺杆菌的检测一直是全世界研究的热点[19-20]。免疫学检测方法是检测致病菌的一种快速、有效的方法,主要包括酶联免疫技术、量子点荧光免疫技术、放射免疫技术、荧光偏振免疫技术、胶体金免疫层析技术、蛋白芯片技术等。由于免疫分析技术是以抗原抗体的特异性结合为 基础的,因而制备性能良好的抗体是免疫分析技术应用于克罗诺杆菌检测的关键。除了传统的杂交瘤细胞技术外,近年来出现了多种新的单克隆抗体制备技术,如嵌合单克隆抗体技术[21]、转基因小鼠技术[22-23]、噬菌体展示技术[24-25]、核糖体展示技术[26]、共价展示技术[27]等,但由于这些技术尚未发展成熟,并且传统的杂交瘤细胞技术具有易于操作、成本低等优点,因而本实验仍然选用传统杂交瘤技术。

关于克罗诺杆菌抗体的制备之前已有研究,周鹤峰[28]和汪琳[29]等由于实验中筛选所用抗原为单株抗原,所得到的抗体并没有检测能否实现多株抗原覆盖。Ishikawa等[30]在制备多抗的过程中,以ATCC 29544免疫新西兰白兔,检测所得抗体与ATCC 29544和其他12 株分离菌株的交叉反应性,结果抗体只与免疫菌株和另外1 株分离菌株结合。袁成刚等[31]尝试用混合免疫的方法进行克罗诺杆菌单克隆抗体的制备,结果所得抗体虽然与多株克罗诺杆菌结合,但也与其他所有阴性菌株有交叉反应。

本实验首先通过OD600nm比较3 株Cs的生长快慢,选取生长状态最好的一株菌株免疫小鼠。然后通过不同的免疫剂量优化免疫条件,实验发现免疫剂量为0.2 mL的一组小鼠反而血清效价最高,这可能是由于过高的免疫剂量会影响小鼠的生长状态甚至导致小鼠死亡。经过两次细胞融合之后进行杂交瘤细胞筛选,腹水制备,抗体纯化共获得7 个Cs单克隆抗体,其中2A7能够和实验室现有的3 株Cs全交叉,1E9能够与其中两株菌交叉。并且除了2A7与乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094)有微弱交叉外,7 个抗体与其他相似菌和常见致病菌都没有交叉反应,这对于免疫分析技术应用于克罗诺杆菌的检测意义重大。实验最后还建立了一种间接竞争ELISA检测方法用于Cs的快速检测,其检测限可达到106CFU/mL。

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Preparation of Monoclonal Antibodies against Cronobacter sakazakii and Development of an Indirect Competitive ELISA for Detection of This Bacterium

ZHAI Xuzhao1, ZENG Haijuan1, WANG Guangbin2, DONG Qingli1, XIE Manman1, DING Chengchao1,LIU Wukang1, WANG Shujuan1, LI Jie1, LIU Qing1,*
(1. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Sc ience and Technology, Shanghai 200093, China;2. Xuzhou Lüjian-Dairy Beverage Co. Ltd., Xuzhou 221006, Chi na)

中图分类号:TS207.4

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)20-0268-05

引文格式:

翟绪昭, 曾海娟, 王广彬, 等. 阪崎克罗诺杆菌单克隆抗体的制备及其间接竞争-ELISA检测方法[J]. 食品科学, 2017,38(20): 268-272. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720039. http∶//www.spkx.net.cn

ZHAI Xuzhao, ZENG Haijuan, WANG Guangbin, et al. Preparation of monoclonal antibodies against Cronobacter sakazakii and development of an indirect competitive elisa for detection of this bacterium[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 268-272. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720039. http∶//www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-11-03

基金项目:上海市科委“科技创新行动计划”长三角科技联合攻关领域项目(15395810900);

徐州绿健乳品饮料有限公司“乳制品生产体系致病菌快速检测”项目(3A15308006)

作者简介:翟绪昭(1992—),女,硕士研究生,研究方向为食源性致病菌的快速检测。E-mail:huzhxzh@126.com

*通信作者:刘箐(1970—),男,教授,博士,研究方向为食源性致病菌致病机理、疫苗及快速检测技术。E-mail:liuq@usst.edu.cn