荧光微球免疫层析技术定量检测河鲀毒素

张世伟,王士峰,姚添琪,杨国武,赖心田

(深圳市计量质量检测研究院,广东 深圳 518102)

摘 要:建立河鲀毒素的荧光微球免疫层析检测方法。基于抗体亲和位点保护标记方法制备抗河鲀毒素抗体偶联荧光微球,方法简单稳定,所有结合分离步骤均在亲和柱中完成,避免了亲和位点被破坏而且荧光信号更强,将检测灵敏度提高至原来的8 倍左右。所建立的河鲀毒素检测方法IC50为18.4 ng/mL,线性范围为2~200 ng/mL(y =-0.15ln x+0.95,R2=0.98)。检测河鲀样本的最低检出限为10 μg/kg,平均相对标准偏差小于25%(n=6)。该方法适用于热加工样品的检测,整个检测过程仅需15 min,且无需使用大型设备,为河鲀餐前速测提供了一定技术手段。

关键词:河鲀毒素;亲和位点保护;荧光微球;免疫层析

Abstract: A microsphere-based fluorescence immunochro matographic assay was established for the detection of tetrodotoxin. A binding site prote ction procedure was developed for antibody labeling with fl uorescent microspheres, which prevented damage to the antibody binding site and consequently enhanced the fl uorescence signal. The whole process of binding and separation was effi ciently completed on an affi nity spin column. The sensitivity of the antibody-microsphere conjugate was nine times higher than that prepared by direct labeling. The immunochromatographic assay exhibited a linear range from 2 to 200 ng/mL for the detection of tetrodotoxin (y = -0.15lnx + 0.95, R2= 0.98) with an IC50of 18.4 ng/mL. The limit of detection (LOD) for tetrodotoxin was 10 μg/kg in puffer with an average relative standard deviation ( RSD) of less than 25% (n = 6). The assay method could be applied on heat-processed products without the need for large-scale equipment.The whole analysis process took only 15 min for each sample.

Key words: tetrodotoxin; binding site protection; fl uorescent microspheres; immunochromatography

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720046

河鲀毒素(tetrodotoxin,TTX)是一种剧毒的天然非蛋白质类神经毒素,分布广泛,不仅存在河鲀鱼中,也存在于其他海洋动物体内,如织纹螺,是已知毒性最强的海洋生物毒素之一[1]。它通过对钠离子通道的阻断作用而抑制神经冲动的传导,使感觉神经麻痹,四肢瘫痪,呼吸困难,最后因呼吸抑制而死亡,其毒力比氰化钠大1 000 倍,人畜误食后均能致死[2-4]

由于河鲀肉味鲜美,营养丰富,因此被人们视为美味,尤其在亚洲国家,人们自古就有嗜吃河鲀的习惯。近年来主要东方鲀品种(如暗纹东方鲀、红鳍东方鲀等)的人工繁殖和苗种培育的成功,加速推进了我国河鲀人工养殖的发展,产量和外销量不断增加。目前我国养殖的河鲀已占世界河鲀产量的70%,每年大量外销日本、韩国等国,河鲀已成为我国一种具有较高经济价值和发展潜力的特色水产品。河鲀体内含有的TTX化学性质稳定,一般烹调手段难以破坏,中毒后也缺乏有效的解救措施,严重威胁到消费者的食用安全,因此河鲀加工时必须完全去除毒性富集部位,如内脏、眼球、表皮。尽管加工河鲀有着严格的规定,TTX中毒的案例仍然时有发生[5-7]。解决这一问题的方法就是建立TTX的前端预警体系,在消费者食用前对所加工的河鲀进行毒性速测。

免疫学检测技术的快速发展为小分子海洋毒素的快速检测提供了良好的技术基础[8-11]。Kawatsu等[12]曾以甲醛作为交联剂合成了TTX人工抗原并首次制备了TTX单克隆抗体。刘燕婷等[13]采用戊二醛作为交联剂制备了TTX抗原,但并未见后续检测方法的报道。Ling Sumei等[14]建立了TTX的酶联免疫吸附法快速检测方法,灵敏度达到5 ng/mL,使TTX免疫学检测方法达到了实际应用的要求。然而,酶联免疫吸附法检测步骤仍然较为繁琐,无法应用于现场速测。目前TTX的现场速测主要采用胶体金免疫层析法,但其灵敏度较差。荧光素作为抗体标记物能有效的放大免疫反应信号,与胶体金标记相比灵敏度提高了10~100 倍[15-18]。然而,其容易被食品中的基质干扰,目前成功商品化的食品免疫荧光检测试剂仍然较少。近年来兴起的荧光微球材料(fluorescent microspheres,FM)为提高免疫层析灵敏度提供了新的解决方案,其通过将荧光素包裹在荧光微球中,避免了基质和荧光素的近距离接触,从而避免了荧光信号的淬灭[19-22]。本研究采用荧光微球标记的免疫层析技术,提高了TTX免疫层析技术的灵敏度,使其能实际用于TTX的现场速测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

硝酸纤维膜(NC膜)、荧光硅球垫、样品垫、吸水纸及PVC底板 美国Millipore公司;FluoSpheres®羧基修饰的荧光微球(直径0.2 μm、激发波长540 nm、发射波长560 nm)、AminoLink Plus Immobilization Kit 美国Thermo公司;TTX 成都曼斯特生物科技公司;大田软海绵酸、石房蛤毒素、微囊藻毒素、双鞭甲藻毒素、软骨藻酸 日本和光纯药工业株式会社。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

XYZ3100点膜仪 美国Bio-Dot公司;试纸条读取仪深圳市三方圆生物科技有限公司;Milli-Q水处理系统美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 TTX抗体制备

以Zhou Jie等[23]报道的甲醛交联法合成TTX抗原,单克隆抗体制备参照文献[24]报道的方法。采用辛酸硫酸铵纯化抗体。

1.3.2 TTX抗体-荧光微球偶联物的制备

采用保护亲和位点法标记荧光微球,标记流程如图1所示。使用AminoLink Plus Immobilization Kit将TTX偶联于含醛基活化的琼脂糖凝胶上后,用氰基硼氢化钠还原所形成的不稳定碳氧双键,具体操作步骤见试剂盒说明书。将2 mL 5 mg/mL的TTX抗体和2 mL上述偶联完成的琼脂糖凝胶混合,室温孵育10 min后,装入离心柱,离心去除为结合的抗体,使用6 mL 0.01 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)分3 次洗涤凝胶。0.2 mg的荧光微球加入到2.7 mL、0.01 mol/L PBS中,加入1.0 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺进行活化,然后加入含琼脂糖凝胶的离心柱中,涡旋混匀,静置室温孵育1 h后离心去除液体。使用4 mL 0.1 mol/L pH 3.0的甘氨酸盐酸缓冲液作为洗脱液分两次淋洗琼脂糖凝胶。洗脱液立即用0.1 mol/L氢氧化钠调节至pH 7.0,得到标记好的TTX抗体-荧光微球偶联物。同时,按传统的标记方法,分别以投料比为1∶10、1∶30、1∶100标记荧光微球[25]。偶联后的抗体分别使用下述不同配方的荧光抗体稀释液稀释用于试纸条 制备:

配方1:pH 7.4,0.01 mol/L PBS,含2%果糖、1%聚乙二醇标准品(polyethylene glycol,PEG)40000、5%蔗糖、1%牛血清白蛋白(albumin bovine serum,BSA)、0.4%吐温-20[26];配方2:pH 7.4,0.01 mol/L PBS,含2%果糖、1% PEG 40000、5%蔗糖、BSA、0.4%吐温-20、0.1% NaN3;配方3:pH 7.4,0.01 mol/L PBS,含5%海藻糖、1% PEG 40000、1% BSA、0.4%吐温-20、0.1% NaN3;配方4:pH 7.4,0.01 mol/L PBS,含5%海藻糖、1% PEG 40000、1% PVP K-40、1% BSA、0.4%吐温-20、0.1% NaN3;配方5:pH 7.4,0.01 mol/L PBS,含5%海藻糖、0.2%精氨酸、1% PEG 40000、1% PVP K-40、1% BSA、0.4%吐温-20、0.1% NaN3

图1 抗体亲和位点保护标记流程
Fig. 1 Schematic illustration of the binding site protection procedure for antibody

1.3.3 荧光试纸条的制备

荧光试纸条结果如图2所示。首先将样本垫浸泡于20 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.4,含1.0% BSA,0.25% Tween-20、1% PVP K-40、0.5% PEG 40000和0.1% NaN3)中,于60 ℃干燥2 h;将TTX-BSA偶联物(2.5 mg/mL)和羊抗鼠多抗(0.3 mg/mL)喷涂于NC膜上,分别作为TTX试纸条检测线(T线)和质控线(C线),于37 ℃真空干燥12 h。结合垫喷有TTX抗体偶联荧光微球,室温真空干燥12 h。最后将吸水纸、NC膜、结合垫和经过预处理的样本垫顺序粘贴在PVC底板上,用自动切条机切成4 mm宽的试纸条,室温条件下真空干燥,备用。

图2 荧光微球免疫层析试纸检测原理示意图
Fig. 2 Schematic illustration of detection of TTX by microsphere-based fl uorescence immunochromatographic strip

1.3.4 定量曲线的建立

将阴性条件下T线荧光信号/C线荧光信号(FIT/FIC)值记为B0,TTX标准溶液的FIT/FIC记为B,以B/B0为纵坐标,TTX标准溶液质量浓度的对数为横坐标,使用Origin 8.0建立四参数拟合曲线。以B/B0在0.2~0.8的标准点建立基于最小二乘法的线性回归方程。

1.3.5 方法稳定性评价

选取色谱确证为TTX阴性的黑鳃兔头鲀肉样,TTX加标量为0.5 mg/kg。使用同批和不同批次荧光试纸条连续6 d对加标和未加标样品其进行测定。

1.3.6 真实样品的方法比对

取1 g均质的河鲀组织,加入4 mL 0.01 mol/L pH 7.4的PBS,涡旋振荡2 min,0.45 μm过滤上清液,取上清液0.1 mL滴加至荧光免疫层析试纸的样品垫,10 min后读取结果。液相色谱法为GB/T 23217—2008《水产品中河鲀毒素的测定 液相色谱-荧光检测法》所规定的方法[27]

2 结果与分析

2.1 标记方法的对比

抗体的荧光微球标记一直是建立荧光免疫层析方法的重点也是实验难点。荧光微球和抗体的投料比过高会导致抗体活性的丧失,而过低则影响荧光信号强度,均会导致检测灵敏度的降低,因此,过去一直需要摸索一系列的投料比,工作量非常大且结果不稳定,试剂的批间差较大。本研究建立的保护抗体亲和位点标记法,将抗体亲和于固定化抗原的琼脂糖凝胶上,保护了抗体活性位点,再加入超过量的活化荧光微球,在抗体上尽可能地标记上荧光微球,从而在不影响抗体活性的基础上,大大增加了抗体的荧光信号,并且由于荧光微球和抗体的投料比超过量,因此每批制备的标记抗体荧光信号均一。图3对比了本研究建立的抗体活性位点保护标记法和传统标记方法对检测灵敏度的影响。传统方法考察了3 个投料比,其中1∶30获得了最佳的灵敏度,其IC50为156 ng/mL。而本研究使用的方法IC50为18.4 ng/mL,灵敏度提高至原来的8 倍左右。该方法标记洗脱后的亲和柱可重复使用4~5 次,过量加入的荧光微球离心回收后可继续使用,大大降低了标记成本。本课题组使用该策略还进行了抗体的酶标记和生物素标记,均取得了良好的效果。

图3 不同标记方法标记抗体的荧光免疫层析标准曲线(n=6)
F ig. 3 Representative detection standard curves for different labeled antibodies (n = 6)

2.2 检测方法参数

图4 肉眼观察TTX荧光微球免疫层析条抑制情况
Fig. 4 Inhibition of TTX fl uorescent immunochromatography observed by naked eye

基于保护标记的荧光微球标记抗体所建立的免疫层析方法,其检测不同质量浓度TTX的试纸条在580 nm激发波长下如图4所示。根据图3计算其线性范围为2~200 ng/mL(R2>0.98),回归方程为y = -0.15lnx+0.95(R2= 0.98)。如表1所示,该方法与各海洋毒素的交叉反应率小于1.0%,特异性良好。以线性范围的最低点2 ng/mL乘以其样本前处理稀释倍数5得到其最低检出限为10 μg/kg。

表1 与各 海洋毒素的交叉反应率
Table 1 Cross-reactivity of antibody with marine toxins

2.3 荧光抗体稀释液配方对试剂有效期的影响

荧光免疫层析技术由于灵敏度比传统的胶体金免疫层析方法大大提高,被越来越多地用于体外诊断领域。然而,食品样品基质比临床样本更加复杂,直接标记荧光素容易被基质干扰导致信号的淬灭。近年来,随着商品化的荧光微球的上市,为荧光免疫层析技术在食品检测领域的应用提供了有效的工具。荧光微球通过将大量的荧光物质包裹于聚合物材料中,表现出更高的荧光强度,并且能有效防止基质对荧光信号的干扰,提高了荧光物质的光学稳定性[28]。然而由于其颗粒直径为胶体金颗粒的10~100 倍,这种大直径的颗粒长期放置后容易聚集并吸附在结合垫上,无法有效地层析。目前常用的策略是将荧光微球标记的抗体另外加入于酶标孔中,临用时手动混匀,使用较为不便[29]。本研究将荧光抗体喷在结合垫上,并置于样品垫前端(图2),考察了5 个配方荧光抗体稀释液对试剂有效期的影响(图5)。配方1为目前较为通用的荧光抗体稀释液配方,然而将其喷于结合垫后,荧光信号大幅度衰减,在配方2加入防腐剂和在配方3加入海藻糖保护抗体后,虽然结果有所提高,但仍然不能满足商品化要求。观察试纸条后发现,荧光微球在结合垫形成了无法层析的沉淀。配方4加入1%的PVP K-40提高荧光微球的分散性,6 个月后的荧光信号大幅度提高。配方4加入了0.2%的精氨酸保护荧光信号,使其6 个月的荧光衰减小于30%,基本满足商品化条件。

图5 荧光抗体稀释液对荧光信号衰减的影响
Fig. 5 Infl uence of fl uorescent antibody diluents on fl uorescent signal reduction

2.4 方法稳定性评价

本研究需用同批次和不同批次(实验当天制备)的试纸条对同一样品进行测定,阴性样品均为未检出,检测添加样品的结果见表2。同批次的试纸条6 d内的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为11%,不同批次的RSD为16%。回收率均在60%~100%之间,平均回收率为78%,能对河鲀中的TTX进行有效的餐前监控。

表2 TTX荧光试纸的批内、批间的RSD
Table 2 Intra- and inter-assay variations of TTX test strip

2.5 真实样品检测结果

表3 2 种方法检测河鲀鱼组织中TTX含量(n=6)
Table 3 Comparison of TTX contents in puffer tissue determined by two methoddss (n=6)mg/kg

从市场随机购买野生的黑鳃兔头鲀和养殖的暗纹东方鲀,用本研究建立的荧光免疫层析法和GB/T 23217—2008规定的液相色谱法对其肌肉、肝脏、皮中的TTX进行检测(表3)。在野生黑鳃兔头鲀的肌肉、肝脏、皮以及养殖暗纹东方鲀的肝脏中,上述两种方法均检出TTX。低质量浓度下荧光免疫层析法和液相色谱法符合性较好,相对误差低于20%(以液相色谱法结果作为真值),高质量浓度下则偏离较大,其原因在于本研究所使用的前处理方法仅使用PBS一步提取,而TTX在PBS中微溶,导致高质量浓度下大部分TTX不能转移进提取液。据文献报道,河鲀鱼有无毒的判定阈值为1.65 mg/kg,在此阈值附近,荧光免疫层析法的相对误差低于30%(以液相色谱法结果作为真值),而该方法检测实际样品的RSD小于25%[30],因此,作为快速初筛方法,该技术可现场10 min内判断样品是否有TTX中毒风险。本研究还使用建立的荧光免疫层析法对沸水浴处理10 min后的野生黑鳃兔头鲀肌肉进行检测,仍能检测到0.037 mg/kg的TTX,说明该方法也可适用于生产和餐饮环节热加工河鲀产品的检测。

2016年9月7日,我国发布了《关于有条件放开养殖红鳍东方鲀和养殖暗纹东方鲀加工经营》的通知,先行放开了养殖红鳍东方鲀和暗纹东方鲀的加工和销售。本研究对养殖的暗纹东方鲀的肌肉、肝脏、皮进行了检测,仅肝脏检出微量毒素,但远低于中毒风险的阈值。可见该项政策的出台是基于河鲀去毒养殖技术已达到一定水平的背景下做出的,是科学合理的。然而,河鲀去毒养殖对水体、环境、饲料投放的要求较高,为防止未达到规范要求的公司或个人进行河鲀养殖及销售,对市售河鲀的风险调查仍然不可放松。

3 结 论

本研究基于抗体亲和位点保护标记方法制备的抗TTX-荧光微球,具有亲和力好、荧光强度大、批间差异小等优点,从而将TTX的检测灵敏度提高至原来的8 倍左右。并且研究了荧光抗体稀释液配方,使荧光标记抗体一体式组装在测试卡上6 个月荧光衰减小于30%,从而使该技术能够以测试卡的形式商品化应用。配合简单的一步提取前处理方法,整个检测过程仅需15 min,且无需使用大型设备,从而弥补了河鲀中TTX餐前现场监测技术的短板。

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Microsphere-Based Fluorescence Immunochromatographic Assay for Quantitative Detection of Tetrodotoxin

ZHANG Shiwei, WANG Shifeng, YAO Tianqi, YANG Guowu, LAI Xintian
(Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection, Shenzhen 518102, China)

中图分类号:TS207.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)20-0312-06

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张世伟, 王士峰, 姚添琪, 等. 荧光微球免疫层析技术定量检测河鲀毒素[J]. 食品科学, 2017, 38(20)∶ 312-317.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720046. http∶//www.spkx.net.cn

ZHANG Shiwei, WANG Shifeng, YAO Tianqi, et al. Microsphere-based fluorescence immunochromatographic assay for quantitative detection of tetrodotoxin[J]. Food Scien ce, 2017, 38(20)∶ 312-317. (in Chinese with English abstract)DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720046. http∶//www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-10-08

基金项目:深圳市科技计划项目(JCY20150626104807916)

作者简介:张世伟(1985—),男,高级工程师,硕士,研究方向为食品质量安全。E-mail:zsw_8506@163.com