羟自由基氧化对草鱼肌原纤维蛋白结构和凝胶性质的影响

李学鹏1,刘慈坤1,周明言1,王金厢1,朱文慧1,徐永霞1,仪淑敏1,林 洪2,李钰金3,励建荣1,*

(1.渤海大学食品科学与工程学院,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁 锦州 121013;2.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东 青岛 266003;3.荣成泰祥食品股份有限公司,山东 荣成 264300)

摘 要:以草鱼肉为研究对象,采用芬顿反应体系(H2O2浓度分别为0.1、1.0、5.0、10.0 mmol/L)产生不同浓度·OH对其肌原纤维蛋白进行模拟氧化,研究·OH氧化对草鱼肌原纤维蛋白结构及凝胶性质的影响。结果表明,氧化使肌原纤维蛋白羰基含量显著增加(P<0.05),当氧化剂H2O2的浓度为10.0 mmol/L时,羰基含量比对照组增加了111.35%;随着H2O2浓度的提高,肌原纤维蛋白总巯基、活性巯基、游离氨基含量显著下降(P<0.05);二聚酪氨酸水平和表面疏水性显著增加(P<0.05)。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明氧化使蛋白质分子间发生交联和聚集,产生了分子质量大于200 ku的蛋白聚集体。可见,·OH氧化使草鱼肌原纤维蛋白中巯基、酪氨酸、色氨酸等氨基酸残基发生了显著氧化修饰,蛋白质分子产生了交联和聚集,蛋白质构象发生了显著变化。此外,氧化可进一步影响肌原纤维蛋白的凝胶性质,使其凝胶网络结构变疏松、凝胶孔隙增大,凝胶中部分不易流动水转变为自由水,最终导致凝胶强度和凝胶持水性显著降低。

关键词:草鱼;肌原纤维蛋白;蛋白质氧化;结构特征;凝胶性质

近年来全球鱼糜制品产量和消费量高速增长,我国鱼糜制品产量更是以25%的年均增长率递增,鱼糜制品成为我国增长速度最快的水产加工品之一。传统生产鱼糜的原料主要是鳕鱼等海水鱼类,但海洋鱼类资源日益缺乏,已不能满足各国对鱼糜制品的消费需求。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)又名鲩鱼、草混,属鲤形目、鲤科、草鱼属,是我国重要的淡水经济鱼类,与青、鲢、鳙鱼并称为“四大家鱼”[1-2]。草鱼资源丰富,2014年全国总产量达537.68万 t,且价格低,是生产鱼糜制品的良好原料[3]

为提高淡水鱼鱼糜凝胶强度,国内外学者对淡水鱼肌原纤维蛋白凝胶强度的影响因素进行了大量的研究,但研究主要集中在加工工艺、环境因素及添加物等方面[4]。随着蛋白质氧化成为食品化学领域的研究热点,鱼肉中的蛋白质氧化及其对鱼糜凝胶特性的影响也逐渐被关注[5]。蛋白质在过渡态金属离子、O2-·以及脂质氧化副产物作用下发生氧化,导致其骨架、侧链以及蛋白质一级、二级和三级结构发生变化,进而改变蛋白质的功能性质(如溶解性、乳化性和凝胶性等)及肉类食用品质(嫩度、多汁性、风味和色泽等)[6]。研究表明,适度氧化会增加肌原纤维蛋白的凝胶强度,而过度氧化会降低凝胶强度[7]。鱼糜在生产过程中,鱼肉蛋白质受光照、氧化消毒剂、金属离子、脂质氧化等因素影响,会发生一定程度的蛋白质氧化,进而影响其凝胶性等功能性质[8]。但目前有关肌原纤维蛋白氧化对凝胶性质影响的研究主要集中在畜禽肉和海水鱼等方面[9-11],草鱼肌原纤维蛋白氧化对其结构特征和凝胶性质的影响鲜见报道。鉴于此,本实验以草鱼为研究对象,提取肌原纤维蛋白,采用不同浓度的芬顿氧化体系产生·OH对其进行模拟氧化,通过测定蛋白质中羰基、巯基、游离氨基含量,二聚酪氨酸水平,表面疏水性,内源荧光以及凝胶品质(凝胶强度、持水性、微观结构、水分分布)等指标,研究氧化对草鱼肌原纤维蛋白结构及其凝胶性质的影响,为从蛋白质氧化调控角度改善鱼糜制品品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活草鱼购于锦州市水产市场,平均体长(32±5) cm、体质量(480±50) g。

FeCl3、H2O2、抗坏血酸、盐酸胍、乙酸乙酯、乙醇、尿素、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、乙醚、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB)、2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH)、2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、8-苯胺基-1-萘磺酸铵(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt,ANS)、β-巯基乙醇、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺、N,N’-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵(ammonium persulfate,APS)、溴酚蓝、甘氨酸等,均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

MS105DU分析天平、PL602-L电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;UV-2550紫外-可见光分光光度计 岛津仪器(苏州)有限公司;THZ-D型台式恒温振荡器 太仓市实验设备厂;970CRT荧光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;S4800场发射扫描电子显微镜、CR-400色彩色差计 日本Minolta公司;TA-XT Plus型质构分析仪 英国Stable Micro Systems公司;冷冻高速离心机 美国Thermo公司;mDF-382E(CN)医用低温箱 大连三洋冷链有限公司;JHG-Q60-P100型实验室均质机 上海融合机械设备有限公司;NMI20核磁共振成像仪 上海纽迈电子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纤维的提取及氧化蛋白的制备

肌原纤维蛋白的提取:参考文献[9]的方法,新鲜草鱼电击晕后宰杀去皮,取背部肌肉绞碎,加入5 倍体积的10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2),高速均质3 次,每次30 s,在5 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min,取沉淀,上述过程反复3 次,在最后一次沉淀中加入5 倍体积的10 mmol/L Tris-HCl缓冲液(含0.6 mol/L NaCl,pH 7.2),高速均质,在5 000 r/min 、4 ℃条件下离心20 min,取上清液备用。

将制备的肌原纤维蛋白与不同浓度的芬顿溶液反应(其中FeCl3、抗坏血酸浓度均为0.1 mmol/L,H2O2浓度分别为0.0、0.1、1.0、5.0、10.0 mmol/L),置于37 ℃避光条件下,在恒温水浴中孵育24 h,并充分混匀,使鱼蛋白发生不同程度的氧化。反应结束后,将反应液温度迅速降到4 ℃以下,之后在冷冻干燥机中干燥,备用。

1.3.2 草鱼肌原纤维蛋白氧化程度和结构特征的测定与表征

1.3.2.1 羰基含量的测定

参考Oliver等[12]的方法并稍加修改。用10 mmol/L Tris-HCl(含0.6 mol/L NaCl,pH 7.2)将氧化后的肌原纤维蛋白粉配成5 mg/mL溶液。取1 mL蛋白液放入塑料离心管并加入1 mL 10 mmol/L DNPH溶液(含2 mol/L HCl),室温条件下避光静置1 h(每隔15 min振荡一次),添加3 mL 20% TCA后以10 000 r/min离心5 min,弃上清液,用1 mL乙酸乙酯-乙醇体积比1∶1洗沉淀3 次,加5 mL 6 mol/L盐酸胍溶液,37 ℃保温30 min溶解沉淀,以10 000 r/min离心5 min,最后获得物在370 nm波长处测定吸光度。

1.3.2.2 总巯基和活性巯基含量的测定

采用DTNB法[13]进行测定。取1 mL 5 mg/mL蛋白溶液加入试管中,每管中加入9 mL、50 mmol/L磷酸盐缓冲液(8 mol/L尿素、0.6 mol/L KCl、10 mmol/L EDTA,pH 7.0)。取4.5 mL上述混合液加入0.5 mL 0.1% DTNB,30 min后在412 nm波长处测定吸光度,即为总巯基的吸光度。而活性巯基含量的测定是在不存在尿素的情况下,将反应混合液在4 ℃反应30 min,然后在412 nm波长处测定其吸光度。

1.3.2.3 游离氨基含量的测定

参照Habeeb[14]的方法略加修改。取5 mg/mL的蛋白液1 mL加入到4 mL 0.1 mol/L的四氢硼酸钠缓冲溶液(含1% SDS,pH 9.3)中,室温条件下磁力搅拌2 h后10 000×g离心30 min。取上清液4 mL与1 mL 0.1% TNBS溶液混合均匀,随后在37 ℃水浴中避光反应1 h,反应结束后向反应液中加入2 mL 0.5 mol/L HCl调节pH值,最后取反应液在335 nm波长处测定吸光度,对照为6 mL 20 mmol/L的磷酸盐缓冲液。

1.3.2.4 表面疏水性的测定

采用Saeed等[15]的方法并加以修改。将样品用20 mmol/L含0.6 mol/L KCl的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)稀释至0~1 mg/mL,加入25 µL 8 mmol/L ANS(用20 mmol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液配制)后混合均匀,避光静置10 min,然后用荧光分光光度计测定其荧光强度。测定条件为:激发波长374 nm,狭缝5 nm,扫描范围250~500 nm。以蛋白质量浓度为横轴、荧光强度为纵坐标作图,曲线初始斜率即为所求的表面疏水性指数。

1.3.2.5 二聚酪氨酸水平的测定

参考Davies等[16]方法。取5 mg/mL蛋白液1 mL,用pH 6.0浓度为20 mmol/L高离子强度的磷酸盐缓冲液(含有0.6 mol/L的KCl)稀释到1 mg/mL。溶液用滤纸过滤除去不溶性物质,用双缩脲法测定蛋白质量浓度,然后再利用荧光分光光度计测定二聚酪氨酸的吸光度,二聚酪氨酸水平用相对荧光值表示。测定条件:激发波长选择325 nm,发射波长选择420 nm,狭缝宽度均为10 nm,灵敏度为2。

1.3.2.6 内源荧光的测定

准确量取5 mg/mL的蛋白液1 mL加入9 mL 50 mmol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液。采用F96型荧光分光光度计在激发波长295 nm条件下得到300~450 nm之间的发射光谱(灵敏度为2)。

1.3.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

参考Xiong Youling L.等[17]的方法,分离胶12%、浓缩胶4%,还原剂为β-巯基乙醇,运用Quantity One软件进行分析和处理。

1.3.3 草鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的测定

凝胶制作:将1.3.1节中得到的蛋白粉末,用Tris-HCl(含0.6mol/L NaCl,pH 7.2)将蛋白质质量浓度稀释到160 mg/mL,搅拌均匀后转入25 mm×40 mm(直径×高度)的玻璃杯中,保持厚度约为30 mm,40 ℃水浴保温30 min后转入90 ℃水浴锅中保温30 min,取出迅速冷却后置于4 ℃冰箱中冷却12 h后进行测定。

1.3.3.1 凝胶白度的测定

参照Sánchez-González等[18]方法略作修改,测量前取出样品,在室温条件下恢复30 min,将凝胶样品切成5 mm×5 mm×5 mm的方块,采用色差计测定L*、a*和b*值。样品测定3 次。白度值根据式(1)进行计算。

1.3.3.2 凝胶强度的测定

用TA.XT Plus质构仪对蛋白凝胶强度进行测定,采用P/5S探头,参数设定为下压距离8.0 mm,触发力为10.0 g,测试前速率为1.0 mm/s,测试速率为1.0 mm/s,测试后速率为1.0 mm/s。

1.3.3.3 凝胶持水性的测定

参考文献[19]的方法,称取5 g蛋白凝胶样品,用滤纸包好固定在50 mL离心管中间,3 000 r/min离心10 min,称量离心后的样品质量。凝胶持水性(waterholding capacity,WHC)根据式(2)计算。

式中:m1为离心前凝胶质量/g;m2为离心后凝胶质量/g。

1.3.3.4 凝胶微观结构的观察

参考文献[20]的方法,采用扫描电子显微镜进行观察。将肌原纤维蛋白凝胶切成大小均匀薄片,用2.5%、pH 6.8的戊二醛固定24 h,再用磷酸盐缓冲液(100 mmol/L,pH 7)漂洗3 次,每次10 min。然后分别采用体积分数50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液梯度脱水,每次10 min,迅速放入冷冻干燥机中干燥。扫描时将粉末用双面胶粘在扫描电子显微镜样品台上,用离子溅射镀膜仪进行离子溅射喷金,进行扫描观察。

1.3.3.5 凝胶中水分状态的分析

参考文献[21]的方法,采用低场核磁共振(low fieldnuclear magnetic resonance,LF-NMR)仪通过测定凝胶中水分的横向弛豫时间T2进行分析。将肌原纤维蛋白凝胶切成5 mm×5 mm×10 mm左右的凝胶块并装入核磁管中,采用LF-NMR仪弛豫测定凝胶样品的横向弛豫时间T2。测定条件:质子共振频率为22 MHz,测定温度为32 ℃,参数设定为:τ-值150 us,重复扫描8 次,重复间隔时间4 000 ms,所得脉冲系列(Carr Purcell Meiboom Gill,CPMG)指数衰减曲线仪,采用仪器自带的软件进行反衍得到T2图谱。

1.4 数据统计分析

除了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)和扫描电子显微镜外,其他指标均至少设置3 个重复。采用SPSS Statistics 19分析软件中的ANOVA程序进行显著性分析,数据绘图采用Origin 8.5软件。

2 结果与分析

2.1 ·OH氧化对肌原纤维蛋白氧化程度和结构特征的影响

2.1.1 对肌原纤维蛋白羰基含量的影响

图1 ·OH氧化对肌原纤维蛋白羰基含量的影响
Fig. 1 Effect of ·OH oxidation on carbonyl content of myofibrillar protein

小写字母不同表示相同指标间差异显著(P<0.05),下同。

不同浓度·OH对草鱼肌原纤维蛋白羰基含量的影响由图1可知,对照组羰基含量为5.37 nmol/mg,随着H2O2浓度的增加羰基含量显著增加(P<0.05),当H2O2浓度增至10.0 mmol/L时,羰基含量达到11.35 nmol/mg,与对照组相比增加了111.35%,这与李艳青等[22]研究鲤鱼肌原纤维蛋白氧化所得的结果一致。在·OH氧化体系中,H2O2浓度越高,·OH浓度也越高,羰基含量的增加说明·OH对草鱼肌原纤维蛋白具有氧化修饰作用,且自由基浓度越高氧化程度也越高。羰基含量增加可能是因为·OH攻击了蛋白质的侧链或肽键,形成了蛋白过氧化物,进而转化成羰基,从而使羰基含量增加[23]

2.1.2 对肌原纤维蛋白巯基含量的影响

图2 ·OH氧化对肌原纤维蛋白巯基含量的影响
Fig. 2 Effect of ·OH oxidation on sulfhydryl group content of myofibrillar protein

不同氧化程度的草鱼肌原纤维蛋白巯基含量的变化情况从图2可以看出,未氧化蛋白的总巯基含量为39.18 nmol/mg,H2O2浓度在0.1 mmol/L时,总巯基含量变化不大;当H2O2浓度达到1.0 mmol/L时,总巯基含量开始显著下降(P<0.05);当H2O2浓度为10.0 mmol/L时,总巯基含量下降至29.98 nmol/mg。活性巯基含量也呈下降趋势,但降低幅度小于总巯基含量。巯基含量的降低一方面可能是因为氧化使蛋白质分子之间或内部形成了二硫键,或者是进一步氧化成磺酸类或其他氧化产物[24];另一方面可能是氧化使蛋白质变性形成聚集体,堆积在蛋白质表面使检测到的巯基含量下降[25]。另外,活性巯基含量下降的幅度比总巯基含量小,可能是因为在草鱼肌原纤维蛋白中活性巯基含量占总巯基含量比例较小[26]

2.1.3 对肌原纤维蛋白游离氨基含量的影响

图3 ·OH氧化对肌原纤维蛋白游离氨基含量的影响
Fig. 3 Effect of ·OH oxidation on free amine content of myofibrillar protein

由图3可知,游离氨基对·OH氧化较为敏感,0.1 mmol/L H2O2的氧化作用即可使其含量发生显著下降(P<0.05),但在较低H2O2浓度范围内(0.1~1.0 mmol/L),含量下降并不显著(P>0.05),而当H2O2浓度达到5.0 mmol/L以上时,游离氨基含量才发生显著下降(P<0.05)。这可能是因为·OH将蛋白质中赖氨酸残基的ε-氨基转化成为羰基,与蛋白质氨基反应形成席夫碱,从而使得游离氨基含量下降[27-28]

2.1.4 对肌原纤维蛋白二聚酪氨酸水平的影响

图4 ·OH氧化对肌原纤维蛋白二聚酪氨酸水平的影响
Fig. 4 Effect of ·OH oxidation on bityrosine level of myofibrillar protein

二聚酪氨酸的形成是因为氧化过程中蛋白质酪氨酸残基氧化,通过共价键和非共价键作用形成蛋白质聚集物,可用来反映蛋白质氧化的程度和蛋白结构的变化[29-30]。草鱼肌原纤维蛋白经·OH氧化后二聚酪氨酸水平的变化由图4可知,0.1 mmol/L H2O2的氧化同样可使二聚酪氨酸水平显著增加(P<0.05),说明酪氨酸残基对·OH也较为敏感。与游离氨基含量的变化相似,低H2O2浓度范围内二聚酪氨酸含量变化不明显,当H2O2浓度达5.0 mmol/L以上时才显著增加(P<0.05)。

2.1.5 对肌原纤维蛋白内源荧光的影响

图5 ·OH氧化后肌原纤维蛋白内源荧光图谱
Fig. 5 Effect of ·OH oxidation on intrinsic fluorescenceof myofibrillar protein

沿箭头方向H2O2浓度分别为0.0、0.1、1.0、5.0、10.0 mmol/L。

内源荧光主要反映蛋白质分子中色氨酸等荧光基团的氧化程度及其所处环境变化的情况,进而用来表征氧化对蛋白结构和构象的影响[31-32]。·OH氧化对草鱼肌原纤维蛋白内源荧光的影响如图5所示,可以看出随着H2O2浓度的增加蛋白荧光强度显著下降,浓度为0.1 mmol/L时下降尤为显著,说明草鱼肌原纤维蛋白色氨酸残基对·OH也较为敏感。之后下降趋势缓慢,当H2O2浓度为10.0 mmol/L时,荧光强度仅下降了28.57%。蛋白质内源荧光强度下降的原因,一方面可能是由色氨酸残基包埋引起的,并且在氧化初期,这种包埋程度受氧化剂浓度的影响相对较大,随着时间的延长,包埋效率会越来越低;另一方面可能是氧化使蛋白质侧链中的荧光氨基酸被猝灭[31]

2.1.6 对肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

图6 ·OH氧化对肌原纤维蛋白表面疏水性的影响
Fig. 6 Effect of ·OH oxidation on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

蛋白质的表面疏水性能反映表面疏水性氨基酸的相对含量,其变化可以间接反映蛋白质空间结构的变化[33]。从图6可以看出,草鱼肌原纤维蛋白表面疏水性随着H2O2浓度的升高而逐渐增大,且H2O2浓度达10.0 mmol/L时增加尤为显著(P<0.05)。Sun Weizheng[34]、Liu Qian[35]等分别在广东腊肠和鲤鱼肉中发现蛋白质氧化也会使蛋白质表面疏水性增加。表面疏水性的增加,是由于氧化使蛋白结构和构象发生了变化,一些疏水性的脂肪族与芳香族氨基酸侧链基团从蛋白分子内部暴露出来,使蛋白质发生去折叠,导致了疏水性的增加[8]。与此同时,暴露出来的疏水性氨基酸也会进一步被·OH氧化,氨基酸间的疏水相互作用以及氧化导致的蛋白质聚集也会影响蛋白质的疏水性,因此蛋白质疏水性的变化是蛋白质侧链氧化、去折叠及其聚集三者竞争的结果[8]

2.1.7 SDS-PAGE分析

图7 不同氧化程度的肌原纤维蛋白SDS-PAGE图谱
Fig. 7 SDS-PAGE pattern of myofibrillar protein at different oxidation degrees

从图7可以直观地看出蛋白质之间的交联、聚集及降解情况[36]。从图7a中可以看出,随着H2O2浓度的增加,肌球蛋白重链和肌动蛋白条带逐渐变浅,而在分离胶的顶端形成了聚合物条带。当加入还原剂β-巯基乙醇后(图7b),分离胶顶端聚合物条带减弱,肌球蛋白重链、肌动蛋白、原肌球蛋白条带明显加粗,说明氧化促使肌原纤维蛋白分子之间发生了交联或聚集,从而形成分子质量较大且不可溶的聚集体。同时说明二硫键是主要交联方式,但聚合物并未完全被还原,说明形成的聚集体中还有其他交联方式(如形成二聚酪氨酸等)的存在[37]

2.2 ·OH氧化对肌原纤维蛋白凝胶性质的影响

2.2.1 对肌原纤维蛋白凝胶强度、持水性和白度的影响

图8 ·OH氧化对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响
Fig. 8 Effect of ·OH oxidation on gel properties of myofibrillar protein

由图8可知,草鱼肌原纤维蛋白的凝胶强度、凝胶持水力和凝胶白度均随着H2O2浓度增加呈下降趋势,其中凝胶持水性的变化呈现明显的H2O2浓度依赖效应,低浓度范围内凝胶强度和凝胶白度受H2O2浓度影响不显著(P>0.05)。值得注意的是,本研究中并未出现Xiong Youling L.等[38]报道的低浓度氧化有助于提高凝胶强度的现象,这可能与蛋白质组成上的差异以及氧化引起的蛋白质交联程度和方式的不同有关。氧化虽然能使部分蛋白质通过二硫键和二聚酪氨酸等方式发生交联和聚集,但同时改变了蛋白质的结构和构象,因此会影响肌原纤维蛋白正常凝胶过程中的有序聚集,破坏凝胶三维网状结构的均匀性,使凝胶结构变得疏松、孔隙增大,使凝胶保持水分的毛细管作用力下降,进而引起持水性的下降[39]

2.2.2 对肌原纤维蛋白凝胶微观结构的影响

图9 不同氧化程度的肌原纤维蛋白凝胶的微观结构
Fig. 9 Scanning electron microscopy of myofibrillar protein gel

由图9可以看出,不同氧化程度的草鱼肌原纤维蛋白形成的凝胶微观结构明显不同。未氧化的肌原纤维蛋白形成的凝胶三维网状结构细腻、均匀、孔隙较小;而氧化蛋白形成的凝胶网状结构粗糙、不均匀、孔隙较大且氧化程度越大,凝胶网状结构破坏越严重。蛋白质热诱导凝胶主要是通过二硫键、疏水相互作用、静电作用和其他相互作用促使蛋白聚集而形成的,而氧化使蛋白质结构和构象发生变化,改变其表面疏水性及电荷,使蛋白分子间的吸引力和排斥力受到影响,导致蛋白形成较大的聚集体,不同程度地阻碍凝胶形成过程中分子间的交联,进而影响凝胶中蛋白质分子间作用力,使凝胶网状结构失去均匀性[40]

2.2.3 对肌原纤维蛋白凝胶中水分分布的影响

图10 不同氧化程度下肌原纤维蛋白凝胶水分子的T2弛豫特性
Fig. 10 T2relaxation of water from heat-induced myofibrillar protein gel

表1 ·OH氧化对肌原纤维蛋白热诱导凝胶水分子弛豫峰比例的影响
Table 1 Effect of ·OH oxidation on peak area fraction of water from heat-induced myofibrillar protein gel

注:同列肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。峰面积比例为单峰面积与总峰面积的比值。

研究表明,蛋白质凝胶中水分主要呈3 种状态分布:结合水、不易流动水和自由水[41-42]。其中,结合水主要通过化学作用力结合到蛋白质分子上,不易流动水是指被束缚在凝胶致密的空间网络结构内部的水分,自由水是在凝胶空间网络结构外部、可以自由移动的水分。结合水含量很低,不是决定凝胶持水性的关键因素。存在于凝胶孔径中的不易流动水是蛋白质凝胶中含量最多的水分,它与自由水的变化直接关系到凝胶的持水性能[43]。因此凝胶网络对水分子的包埋是凝胶保持水分的主要原因,凝胶网络的结构特征(孔径大小、均匀程度等)显著影响产品的持水性能[44]。草鱼肌原纤维蛋白凝胶经低场核磁扫描、反衍得到4 个峰T21、T22、T23、T24(图10),其中T21、T22被认为代表结合水,T23和T24代表不易流动水及自由水。不同氧化程度的草鱼肌原纤维蛋白形成凝胶中结合水变化不大,不易流动水和自由水发生了显著变化(表1),从峰面积可以看出,不易流动水T23比例显著减小(P<0.05),自由水T24比例显著增大(P<0.05)。凝胶中水分状态的分布与凝胶网络结构密切相关,氧化导致草鱼肌原纤维蛋白凝胶网络结构变疏松且孔隙增大,导致凝胶保持水分的毛细管作用力降低,使部分不易流动水转变为自由水,这也是凝胶持水性降低的主要因素[39]

3 结 论

草鱼肌原纤维蛋白经过·OH氧化后形成了较多的羰基,羰基含量显著增加,同时部分酪氨酸残基发生聚合形成了二聚酪氨酸。氧化可引起蛋白质构象的变化,疏水性氨基酸发生暴露,导致表面疏水性的增加。巯基被氧化形成二硫键或磺酸类产物,导致巯基含量降低。游离氨基、色氨酸残基等荧光基团对氧化也较为敏感,使蛋白内源荧光强度显著下降。由SDS-PAGE分析结果得知,氧化使肌原纤维蛋白发生了交联或聚集,产生了分子质量大于200 ku的聚集体。进一步,·OH氧化显著影响草鱼肌原纤维蛋白的凝胶性能,使凝胶网络结构变疏松、凝胶孔隙增大,凝胶中部分不易流动水转变为自由水,最终导致凝胶强度和凝胶持水性的显著降低。氧化能改变草鱼肌原纤维蛋白结构特征、降低其凝胶性能,因此在贮藏加工过程中应该采取有效措施防止鱼肉蛋白发生氧化,减少氧化引起的鱼肉品质和加工性能的劣变,以保障鱼肉加工产品的品质。

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Effect of Hydroxyl Radical Oxidation on Structural and Gel Properties of Myofibrillar Protein from Grass Carp

LI Xuepeng1, LIU Cikun1, ZHOU Mingyan1, WANG Jinxiang1, ZHU Wenhui1, XU Yongxia1, YI Shumin1, LIN Hong2, LI Yujin3, LI Jianrong1,*
(1. National and Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products, College of Food Science and Engineering, Bohai University, Jinzhou 121013, China; 2. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 3. Rongcheng Taixiang Food Co. Ltd., Rongcheng 264300, China)

Abstract:In this paper, myofibrillar protein from grass carp was artificially oxidized in hydroxyl radical-generating system with H2O2concentrations of 0.1, 1.0, 5.0 and 10.0 mmol/L, and the effect of oxidization on the structural characteristics and gel properties of myofibrillar protein was investigated. The results showed that the carbonyl content increased significantly(P 〈 0.05) after oxidization by 111.35% compared to the initial value when the concentration of H2O2was 10.0 mmol/L.With the increase in H2O2concentration, the total thiol group level, free thiol group level, and free amine content decreased significantly (P 〈 0.05), while bityrosine content and surface hydrophobicity increased significantly (P 〈 0.05). The sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) result showed that hydroxyl radical oxidation could induce the crosslinking and aggregation of protein molecules, thereby forming aggregates with molecular mass higher than 200 ku. The above results indicated that the thiol group, tyrosine and tryptophane residues of myofibrillar protein were modified after hydroxyl radical oxidation, thus leading to a significant change in protein structure. In addition, the gel properties of myofibrillar protein were also influenced by oxidation, the network structure of the gel was damaged, and the portable water in the gel was converted to free water. These changes finally induced apparent decreases in the gel strength and water-holding capacity.

Key words:grass carp (Ctenopharyngodon idellus); myofibrillar protein; protein oxidation; structural characteristics;gel properties

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721005

中图分类号:TS254.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)21-0030-08

收稿日期:2016-07-20

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31771999);中国博士后科学基金项目(2015M582143);“十二五”国家科技支撑计划项目(2015BAD17B03);辽宁省教育厅重点实验室基础研究项目(LZ2014047)

作者简介:李学鹏(1982—),男,副教授,博士,研究方向为水产品贮藏加工。E-mail:xuepengli8234@163.com

*通信作者:励建荣(1964—),男,教授,博士,研究方向为水产品贮藏加工与食品安全。E-mail:lijr6491@163.com

引文格式:李学鹏, 刘慈坤, 周明言, 等. 羟自由基氧化对草鱼肌原纤维蛋白结构和凝胶性质的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(21):30-37.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721005. http://www.spkx.net.cn

LI Xuepeng, LIU Cikun, ZHOU Mingyan, et al. Effect of hydroxyl radical oxidation on structural and gel properties of myofibrillar protein from grass carp[J]. Food Science, 2017, 38(21): 30-37. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721005. http://www.spkx.net.cn