陈建平1,2，余 苗3，秦小明1，谌素华1，钟赛意1,*
（1.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088；2.广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室，广东 广州 510640； 3.江西省粮油质量监督检验中心，江西 南昌 330046）
摘 要：采用纳米银材料制备负载姜黄素（curcumin，Cur）的β-环糊精（β-cyclodextrin，β-CD）功能化纳米银——Ag@β-CD@Cur，并进一步对其抗肿瘤活性进行测定。运用透射电子显微镜和纳米粒度仪鉴定Ag@β-CD@Cur的表面形貌、粒径大小和稳定性。运用倒置荧光显微镜和3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐法检测Ag@β-CD@Cur对人肝癌细胞HepG2形态和活性的影响，并进一步采用流式细胞术检测细胞凋亡比例。实验结果表明，所制备的Ag@β-CD@Cur是纯度很高的单质银，且大小均一、表面光滑，粒径约为2 nm。同时，Ag@β-CD@Cur具有较好的稳定性，能在水中稳定存在30 d。经Ag@β-CD@Cur处理HepG2细胞24 h后，HepG2细胞的形态出现明显的变圆、细胞核固缩等细胞凋亡特征，同时，细胞存活率从对照组的100%降低到24%，进一步的流式细胞术分析结果表明，细胞凋亡比例从对照组的2.5%增加到51.0%。实验结果表明，纳米化后的Cur具有较强的抗肿瘤活性效果，这为Cur在纳米制剂的应用提供了一定的技术手段和理论数据参考。
关键词：姜黄素；β-环糊精；银纳米粒子；制备；抗肿瘤活性
姜黄素（curcumin，Cur）是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种脂溶性酚类物质[1]。目前，在国内外的食品工业当中，姜黄素是一种重要的香料、色素和抗氧化剂，广泛应用于咖哩、烤肉卷、芥菜酱、面食、糕点、糖果、罐头、饮料、果酒、果汁及烹饪菜肴等[2-6]。研究表明，Cur的结构中含有酚羟基，在细胞膜发生脂质过氧化反应时，其酚羟基可以发生氧化反应，能有效终止自由基反应[4]，因而其表现出诸多生理活性，比如抗氧化[7-8]、抗肿瘤[9-10]、抗炎[11-12]、防止衰老等。然而，由于Cur的水溶性差，存在于食品中的Cur被人体摄入后生物利用度较低，难以发挥应有的抗氧化和抗肿瘤等活性作用，极大地限制了它在抗肿瘤临床方面的应用范围及应用价值。
目前，已有研究证实，可以运用多种方法来提高Cur的生物利用度，比如，将Cur制备成纳米粒子[13-14]、脂质体[15-16]、微球[17]、磷脂复合物[18]和各种Cur的结构衍生物等[19-20]。其中，纳米技术是近年来发展的一种新型技术，纳米银（nano sliver，AgNPs）粒子作为一种新兴的功能纳米材料，在生物学领域有着广泛的应用[21]。AgNPs是指粒径在1～100 nm之间的金属银微粒，是金属银的一种特殊形态。AgNPs具有体积小、比表面积大、物理化学性质独特、对人体细胞毒性低等优点，广泛用作抗癌药物的载药体系[22-23]。然而，目前还未见有关采用AgNPs材料制备Cur纳米粒子的研究报道。为此，本实验采用AgNPs作为药物载体对Cur进行负载制备Cur纳米粒子并进一步考察其抗肿瘤活性。为了提高AgNPs的稳定性，本实验首先采用β-环糊精（β-cyclodetrin，β-CD）对AgNPs进行功能化修饰，然后对Cur进行负载从而制备负载Cur的环糊精功能化银纳米粒子——Ag@β-CD@Cur，并对其抗肿瘤活性进行评价。研究结果对于指导Cur在临床上的合理应用、优化给药方案、改进药物剂型以及质量控制等方面具有重要意义。
1.1 材料与试剂
Cur（质量分数≥99.9%）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料 美国Sigma公司；β-CD（食品级） 山东新大精细化工有限公司产品；硝酸银、VC、无水乙醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）、改良杜氏伊格尔培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清、青霉素和链霉素 美国Hyclone公司；人肝癌细胞HepG2 美国ATCC公司。
1.2 仪器与设备
BP301S电子天平 德国Sartorius公司；Nano-ZS纳米粒度仪 英国Malvern公司；TEANAI-10透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM） 荷兰Philips公司；Centrifuge 5804R离心机 德国Eppendorf公司；倒置显微镜 日本Olympus公司；Versamax酶标仪美国Molecular Devices公司；FACS Aria流式细胞仪美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 AgNPs的合成
AgNPs的合成参照文献[23]。称取AgNO3粉末16 mg溶于40 mL Milli-Q水中配成400 μg/mL AgNO3溶液。称取16 mg VC溶于40 mL Milli-Q水中配成400 μg/mL VC储备溶液。在磁力搅拌的条件下，取0.1 mL 400 μg/mL VC溶液逐滴加入到4 mL AgNO3（400 μg/mL）溶液中，搅拌2 h后，在水中透析24 h除去过量的VC和AgNO3。AgNPs溶液经超声2 min后，用0.2 μm的多孔滤膜进行过滤制得AgNPs。最后，采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES）对AgNPs浓度进行测定。
1.3.2 Ag@β-CD及Ag@β-CD@Cur和Ag@Cur的制备
将0.1 mL VC储备溶液逐滴加入到4 mL AgNO3溶液中，经磁力搅拌2 h后，加入3.792 mg β-CD，磁力搅拌6 h，然后经透析后获取纯化后的AgNPs负载体系。取上述溶液，于10 000 r/min离心10 min，去离子水洗3 遍，样品冷冻干燥得到Ag@β-CD。
将0.1 mL VC储备溶液逐滴加入到4 mL AgNO3溶液中，经磁力搅拌2 h后，加入3.792 mg β-CD和80 μL 1 mmol/L Cur，磁力搅拌6 h，然后经透析后获取纯化后的AgNPs负载体系。取上述溶液，于10 000 r/min离心10 min，去离子水洗3 遍，样品冷冻干燥得到Ag@β-CD@Cur。
将0.1 mL VC储备溶液逐滴加入到4 mL AgNO3溶液中，经磁力搅拌2 h后，加入80 μL 1 mmol/L Cur，磁力搅拌6 h，然后经透析后获取纯化后的AgNPs负载体系。取上述溶液，于10 000 r/min离心10 min，去离子水洗3 遍，样品冷冻干燥得到Ag@Cur。
1.3.3 Ag@β-CD@Cur物理性质测定
1.3.3.1 TEM观察Ag@β-CD@Cur形貌
将样品Ag@β-CD@Cur均匀分散滴在铜网上，TEM测定样品微粒的大小、形貌和均匀性。同时，采用能量色散X射线光谱仪（energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX）扫描分析Ag@β-CD@Cur的元素组成。
1.3.3.2 纳米粒度仪测定Ag@β-CD@Cur的粒径及稳定性
用Nano-ZS纳米粒度仪测定Ag@β-CD@Cur的粒径变化及相应Zeta电位，与AgNPs和Ag@β-CD相比较。测试条件：入射光为氦氖激光，波长λ为633 nm，入射角为90°，测量稳定温度为（25.0±0.1）℃。
1.3.4 Ag@β-CD@Cur抗肿瘤活性测定
1.3.4.1 细胞培养
HepG2细胞复苏后培养在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和50 U/mL链霉素的DMEM完全培养液中，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，根据细胞的生长状态传代，取对数生长期细胞用于以下MTT实验。
1.3.4.2 MTT法测定细胞存活率
细胞存活率的测定根据Chen Tianfeng[24]、Chen Jianping[25]等的方法进行操作。取对数生长期的细胞进行实验，经细胞传代后，调整细胞密度。将HepG2细胞以2×104个/孔接种于96 孔培养板，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h。向不同的96 孔板中分别加入2.5 µg/mL AgNPs工作液、Ag@β-CD工作液、Ag@Cur工作液、Ag@β-CD@Cur工作液处理HepG2细胞，以不添加工作液的细胞培养液作为对照组。经不同方式处理的HepG2细胞分别培养24 h后，采用倒置显微镜观察细胞的形态变化。然后，往96 孔细胞培养板中加入5 mg/mL MTT，每孔20 μL，放入37 ℃培养箱中孵育4 h后除去上层清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，在摇床上振荡10 min，待紫色结晶物充分溶解后，用酶标仪在570 nm波长处测定各孔OD值。以对照组的OD值为100%，计算不同处理组中的细胞存活率。
式中：ODi表示不同处理组的OD值；OD0表示对照组的OD值。
1.3.4.3 流式细胞术检测细胞凋亡比例
细胞凋亡率的测定根据Su Jianyu等[26]的方法进行操作。取对数生长期的HepG2细胞，经消化离心、计数，接种到6 cm的培养皿中，细胞密度为6×104个/mL，培养箱中孵育24 h后，分别用2.5 µg/mL AgNPs工作液、Ag@β-CD工作液、Ag@Cur工作液、Ag@β-CD@Cur工作液处理HepG2细胞24 h，以不添加工作液的细胞培养液作为对照组。然后用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，用磷酸盐缓冲液洗2 次，离心后得到的细胞用-20 ℃预冷的75%乙醇固定，吹打均匀后置于-20 ℃过夜，次日1 000×g离心5 min，倒掉上清液，加入500 μL PI染料，置于4 ℃中避光染色20 min后上机待测。流式细胞仪激发波长为488 nm，发射波长为630 nm，每个样品至少分析10 000 个细胞，用软件Multi Cycle分析细胞周期。
2.1 Ag@β-CD@Cur的鉴定
图1 AgNPs（A）、Ag@β-CD（B）和Ag@β-CD@Cur（C）的TEM结果图
Fig. 1 TEM images of AgNPs (A), Ag@β-CD (B) and Ag@β-CD@Cur (C)
用TEM观察所制备的Ag@β-CD@Cur，实验结果如图1所示。Ag@β-CD@Cur大小均一，粒径约为2 nm，且表面光滑，说明Ag@β-CD@Cur是粒径均匀的纳米球。
图2 Ag@β-CD@Cur的EDX元素分析
Fig. 2 EDX analysis of Ag@β-CD@Cur
对Ag@β-CD@Cur表面元素进行分析。由图2可知，Ag是主要元素，占了21%，而C、O分别占了18%和11%，后两者很可能来自于β-CD和Cur，此外无其他元素的信号（所检出Cu为铜网所致），表明Ag@β-CD@Cur纯度很高。
对Ag@β-CD@Cur的稳定性进行分析后发现，Ag@β-CD@Cur在水溶液中保持稳定，在30 d内粒径维持在2 nm左右，提示所合成的纳米载药体系是稳定的纳米溶胶系统，有利于贮存和使用（图3A）。对Ag@β-CD@Cur体系的Zeta电位分析结果（图3B）显示，AgNPs的Zeta电位为-15 mV，在纳米粒子表面连接了β-CD后Ag@β-CD的Zeta电位变为50 mV。在体系中负载了Cur后，Ag@β-CD@Cur的Zeta电位减至36 mV，说明β-CD和Cur存在于AgNPs纳米体系中。
图3 Ag@β-CD@Cur稳定性
Fig. 3 Stability of Ag@β-CD@Cur
2.2 Ag@β-CD@Cur的抗肿瘤活性
图4 Ag@β-CD@Cur对HepG2细胞生长的影响
Fig. 4 Effect of Ag@β-CD@Cur on the growth of HepG2 cells
A. HepG2细胞的生长状态；A1. 对照组；A2. AgNPs；A3. Ag@β-CD；A4. Ag@Cur；A5. Ag@β-CD@Cur；B. HepG2细胞存活率；*.与对照组相比差异显著（P＜0.05）；**.与对照组相比差异极显著（P＜0.01）。下同。
从图4A的倒置荧光显微成像可以看出，对照组细胞均呈不规则多边形贴壁生长，经过2.5 μg/mL AgNPs、2.5 μg/mL Ag@β-CD、2.5 μg/mL Ag@Cur和2.5 μg/mL Ag@β-CD@Cur处理HepG2细胞24 h后，HepG2细胞的生长状态均受到了抑制。然而，相比AgNPs、Ag@β-CD和Ag@Cur，Ag@β-CD@Cur抑制HepG2细胞生长更明显，表现为细胞形态出现了明显的变化，细胞出现更多的变圆、细胞核固缩等细胞凋亡的生物学特征。为了验证这一实验结果，进一步采用MTT法检测细胞的存活率，实验结果如图4B所示。当用2.5 μg/mL AgNPs和2.5 μg/mL Ag@β-CD处理HepG2细胞24 h后，其细胞存活率分别为80%和72%。而当2.5 μg/mL的Ag@Cur处理HepG2细胞24 h后，其细胞存活率降低到51%。然而，用2.5 μg/mL的Ag@β-CD@Cur处理HepG2细胞24 h后，其细胞存活率达到最低，为24%。这一实验结果与观察到的细胞形态的实验结果（图4A）相一致。由此可知，相比AgNPs、Ag@β-CD和Ag@Cur，Ag@β-CD@Cur表现出更强的抗肿瘤活性。
2.3 细胞凋亡比例
图5 Ag@β-CD@Cur对HepG2细胞中细胞凋亡比例的影响
Fig. 5 Effect of Ag@β-CD@Cur on the population of Sub-G1 cells in HepG2 cells
为了验证MTT的结果，进一步采用细胞流式术检测细胞凋亡比例，结果如图5所示。当用2.5 μg/mL AgNPs和Ag@β-CD处理HepG2细胞24 h后，SubG1细胞凋亡比例分别从对照组的2.5%提高到12.6%和27.1%。而当2.5 μg/mL Ag@Cur处理HepG2细胞24 h后，SubG1细胞凋亡比例增加到34.7%。然而，相比Ag@Cur，用2.5 μg/mL的Ag@β-CD@Cur处理HepG2细胞24 h后，SubG1细胞凋亡比例为51.0%，这表明Ag@β-CD@Cur抑制肿瘤细胞增殖主要是通过诱导细胞凋亡而实现的。
原发性肝癌，俗称“肝癌”，是世界上第5大常见的恶性肿瘤，且其死亡率高居所有癌症中第3位[27]。目前，治疗肝癌的常用化疗药物有表柔比星、丝裂霉素、5-氟尿嘧啶、顺铂等。近年来，大量研究表明，Cur对肝癌细胞具有较强的抑制效果[28]。然而，相比化疗药物，Cur对正常细胞却表现出较低的毒副作用[29-30]。这为Cur作为一种理想的抗癌药物提供了可能，然而由于其水溶性低，限制了其在临床方面的应用。本实验通过银纳米技术提高了Cur的水溶性，发现Ag@Cur能够很好地溶解在水中，并且，在水中能够稳定存在30 d，这为Cur的临床应用提供了可能。同时，Ag@β-CD@Cur处理HepG2细胞后，能极显著抑制HepG2细胞的生长（P＜0.01），且抑制率达到了76%（由于细胞存活率仅为24%），且SubG1细胞凋亡比例达到了51%，表明Ag@β-CD@Cur具有较强的抗肿瘤活性效果。然而，关于Ag@β-CD@Cur抑制HepG2细胞增殖及诱导其细胞凋亡的机制还有待于进一步的研究。
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Preparation and Anticancer Activity of Cyclodextrin-Functionalized Curcumin-Loaded Silver Nanoparticles
CHEN Jianping1,2, YU Miao3, QIN Xiaoming1, CHEN Suhua1, ZHONG Saiyi1,*
(1. College of Food and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 2. Guangdong Province Key Laboratory for Green Processing of Natural Products and Product Safety, Guangzhou 510640, China; 3. Grain and Edible Oil Products Quality’s Supervision and Inspection Center in Jiangxi Province, Nanchang 330046, China)
Abstract:In this study, cyclodextrin-functionalized curcumin-loaded silver nanoparticles (Ag@β-CD@Cur) were prepared with silver nanomaterials and its anticancer activity was also studied. The surface morphology, particle size and stability of Ag@β-CD@Cur were detected by transmission electronic microscopy and Zetasizer Nano. Moreover, the effect of Ag@β-CD@Cur on morphological and viability changes of HepG2 cells were detected by phase-contrast microscopy and(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide assay. Moreover, the population of apoptotic cells was detected by flow cytometric analysis. The experimental results showed that Ag@β-CD@Cur was obtained as highly pure,uniformly sized silver nanoparticles with a smooth surface. The average size of Ag@β-CD@Cur was 2 nm. Moreover,Ag@β-CD@Cur had good stability in water for 30 days. After treatment of HepG2 cells with Ag@β-CD@Cur for 24 h,apoptosis characteristics appeared such as cell swelling and cell nuclei pyknosis. At the same time, the cell viability reduced to 24% of the control group. Further flow cytometric analysis showed that the population of apoptotic cells increased from 2.5% (control) to 51.0%. The results demonstrated that after nanoparticlization, curcumin has stronger anticancer activity,which will provide a technical means and theoretical data for curcumin nano-formulation.
Key words:curcumin; β-cyclodextrin; silver nanoparticles; preparation; anticancer activity
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721006
中图分类号：TS201.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）21-0038-05
收稿日期：2016-09-28
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（21602034）；广东省自然科学基金博士启动项目（2016A30310332）；广东省公益研究与能力建设项目（2015A020209166）；广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室开放基金项目（201617）
作者简介：陈建平（1986—），男，讲师，博士，研究方向为天然产物活性物质及其生物利用。E-mail：cjp516555989@126.com
*通信作者：钟赛意（1979—），男，副教授，博士，研究方向为天然产物活性物质及其生物利用。E-mail：zsylxc@126.com
引文格式：陈建平, 余苗, 秦小明, 等. 环糊精功能化修饰纳米银负载姜黄素的制备及其抗肿瘤活性[J]. 食品科学, 2017, 38(21):38-42.
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201721006. http://www.spkx.net.cn
CHEN Jianping, YU Miao, QIN Xiaoming, et al. Preparation and anticancer activity of cyclodextrin-functionalized curcumin-loaded silver nanoparticles[J]. Food Science, 2017, 38(21): 38-42. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721006. http://www.spkx.net.cn