芸豆芽菜多酚对氧化损伤小鼠体内抗氧化及肝脏损伤修复作用

王 颖1,2,佐兆杭1,王欣卉1,徐炳政3,朱 磊1,刘淑婷1,宫 雪1

(1.黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江 大庆 163319;2.国家杂粮工程技术研究中心,黑龙江 大庆 163319;3.青岛琅琊台集团股份有限公司,山东 青岛 266400)

摘 要:本实验探究了芸豆芽菜多酚对D-半乳糖造模的氧化损伤小鼠体内抗氧化及肝脏损伤修复作用。腹腔注射D-半乳糖溶液构建氧化损伤小鼠模型,经连续灌胃不同剂量(20、40、60 mg/(kg·d))芸豆芽菜多酚28 d后测定小鼠体质量、肝脏脏器系数、血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)活力及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量并取肝脏制作苏木精-伊红染色切片,观察小鼠肝脏损伤及修复状况。与模型对照组小鼠比较,各灌胃给药组小鼠体质量及肝脏脏器系数无显著性差异(P>0.05),芸豆芽菜多酚中、高剂量组小鼠血清SOD、GSH-Px活力显著上升(P<0.05),MDA含量显著下降(P<0.05),肝脏功能指示指标ALT与AST活力显著下降(P<0.05),且综合肝组织病理学染色切片结果观察发现芸豆芽菜多酚可使肿胀的肝细胞恢复正常形态,并可减少胞间出血点及炎性细胞浸润现象,且作用效果与剂量呈正相关。

关键词:芸豆芽菜多酚;D-半乳糖;氧化损伤;肝脏;修复作用

随环境污染的日益加剧,人们时常处在紫外线暴露、电磁波辐射和大气污染的环境中,且随着生活压力不断增大及化学药剂滥用,人们处于一种高压力下的病理状态[1-4],此种状态下,机体会在一定程度上产生氧化应激反应,导致机体抗氧化功能失衡,无法抵御如·OH和O2-·等自由基的侵袭,最终出现炎症、衰老及机体脏器氧化损伤的现象[5-8]

芸豆又名四季豆,富含营养物质和人体所必需的8 种氨基酸,深受食品消费者青睐[9]。芸豆中除富含氨基酸外还具有较高含量的多酚类物质[10],具有较高的抗氧化活性。研究表明不仅芸豆中含有较高含量的多酚类物质,其生发出的芽菜多酚含量近芸豆的5 倍,是植物来源中人们摄取酚类化合物的重要来源之一[11-12],本实验以抗坏血酸(VC)为阳性对照,探究了课题组自主研发提取的芸豆芽菜多酚对D-半乳糖造模的氧化损伤小鼠的体内抗氧化和肝脏损伤的修复作用,旨在为芸豆芽菜多酚体内抗氧化及对肝脏损伤的修复作用提供理论依据及数据支持。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

健康雄性昆明种鼠:SCXK(吉)2011-0003,体质量(20±2)g,由长春生物制品研究所有限责任公司提供。

芸豆芽菜多酚 黑龙江八一农垦大学食品学院自制[12];抗坏血酸(VC)、D-半乳糖 上海源叶生物科技有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)试剂盒、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)试剂盒南京建成生物工程研究所;二甲苯氨水、苏木精、伊红染液 上海研臣实业有限公司。

1.2 仪器与设备

Sunrise酶标仪 瑞士帝肯公司;YB-P50001型电子天平 北京长拓锐新科技发展有限公司;KD-P型摊片机、KD-BM型生物组织包埋机 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司;XD811F型快速生化分析仪 武汉三丰医疗设备有限公司;1805型切片机(石蜡)、CM1950型组织包埋机 德国Leica公司;CK40型光学显微镜日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与模型建立

健康昆明雄性种鼠60 只,适应性饲养7 d后称体质量,将实验小鼠按照称质量指标随机分组,每组10 只,其中共分为空白对照组(NOR)、模型对照组(MOD)、阳性对照组(VC)和芸豆芽菜多酚低、中、高剂量处理组(DF-L、DF-M、DF-H)。实验小鼠于12 h平行光照,室温(22±2) ℃环境下饲养,并配有专用塑料鼠笼,无菌木屑垫料每日更换。

除正常对照组外,其余各组小鼠每日腹腔注射D-半乳糖生理盐水溶液120 mg/(kg·d),以体质量计,后同,正常对照组注射等量生理盐水,连续28 d,建模同时各组小鼠均按表1进行药剂灌胃。实验期间,小鼠食用标准饲料,自由饮水,腹腔注射及灌胃给药量根据小鼠每日体质量进行调整,各组小鼠药剂分配见表1。

表1 实验小鼠药剂分配
Table 1 Drugs and their doses administered to experimental mice

1.3.2 动物指标测定

实验过程中,每日测量小鼠体质量并观察其形态特征变化,实验小鼠末次给药并禁食24 h后,摘除眼球取血分离血清,XD811F型快速生化分析仪测定小鼠血清中SOD活力、GSH-Px活力、MDA含量、ALT活力及AST活力,实验小鼠肝脏称质量后,根据公式(1)计算肝脏脏器系数,并制作病理学组织切片,用以观察小鼠肝脏氧化损伤及芸豆芽菜多酚对小鼠肝脏修复情况。

式中:m1为肝脏湿质量/g;m为小鼠体质量/g。

1.4 数据统计分析

数据采用表示,SAS 9.1统计学软件进行统计学分析(t检验),P<0.05具有统计学意义,Excel软件绘制相关图表。

2 结果与分析

2.1 芸豆芽菜多酚对氧化损伤小鼠体质量及肝脏脏器系数的影响

芸豆芽菜多酚对D-半乳糖造模的氧化损伤小鼠体质量及肝脏脏器系数影响如表2所示,与正常对照组小鼠比较,模型对照组小鼠体质量及肝脏脏器系数均有所下降,表明D-半乳糖可抑制小鼠正常生长及肝脏发育,但未造成显著性差异。灌胃给药后,相较于模型对照组,除芸豆芽菜多酚低剂量处理组外,中、高剂量组体质量和肝脏脏器系数均有所上升,此现象说明芸豆芽菜多酚对氧化损伤小鼠体质量及肝脏脏器系数的改善效果与剂量呈正相关。阳性对照组与芸豆芽菜多酚中剂量处理组肝脏脏器系数相近,且略低于芸豆芽菜多酚高剂量处理组,但组间并无明显差异。

表2 实验小鼠体质量及肝脏脏器系数
Table 2 Body weights and liver indexes of mice

2.2 芸豆芽菜多酚对氧化损伤小鼠血清SOD活力、GSH-Px活力及MDA含量的影响

图1 芸豆芽菜多酚对小鼠血清SOD活力(A)、GSH-Px活力(B)、MDA含量(C)的影响
Fig. 1 Effect of kidney bean sprout polyphenols on SOD (A),GSH-Px (B) and MDA (C) in serum of mice

由图1可知,相较于正常对照组小鼠,经腹腔注射D-半乳糖溶液后,模型对照组小鼠血清SOD及GSH-Px活力显著下降(P<0.05),血清MDA含量显著上升(P<0.05),经灌胃给药处理后,各给药组小鼠血清SOD及GSH-Px活力较模型对照组均不同程度增加,血清MDA含量也有所下降,其中,阳性对照组血清SOD、GSH-Px活力及MDA含量与芸豆芽菜中剂量处理组无显著性差异(P>0.05),芸豆芽菜多酚中、高剂量处理组小鼠血清SOD活力及GSH-Px活力与空白对照小鼠无显著性差异(P>0.05),此结果表明,芸豆芽菜多酚使氧化损伤小鼠血清SOD及GSH-Px活力提升,同时可降低血清MDA含量,其改善效果与剂量呈正相关。

2.3 芸豆芽菜多酚对氧化损伤小鼠血清ALT及AST活力的影响

图2 芸豆芽菜多酚对小鼠血清ALT(A)、AST(B)活力的影响
Fig. 2 Effect of kidney bean sprout polyphenols on ALT (A) and AST (B)in serum of mice

ALT及AST是肝脏功能指示指标,能够反映出肝脏功能基本状况,通常用来评价肝脏组织损伤及炎症状况。由图2所示,与空白对照组比较,模型对照组小鼠血清ALT与AST活力显著升高(P<0.05),经灌胃给药后,与模型对照组小鼠比较,各灌胃给药组小鼠血清ALT与AST水平均有所下降,其中,阳性对照组小鼠与芸豆芽菜多酚中剂量处理组无显著性差异(P>0.05),除芸豆芽菜多酚低剂量处理组外,中、高剂量处理组小鼠血清ALT与AST活力均较模型对照组小鼠显著下降(P<0.05),且高剂量芸豆芽菜多酚处理组与空白对照组小鼠血清ALT活力无显著性差异(P>0.05)。

2.4 芸豆芽菜多酚对氧化损伤小鼠肝脏损伤的修复情况

图3 实验小鼠肝脏组织病理学观察(×200)
Fig. 3 Pathological observation of liver tissues from experimental mice (× 200)

各组小鼠肝脏组织病理学观察如图3所示。空白对照组小鼠肝脏组织结构完整,肝索走向清晰,肝细胞体积正常且细胞核完整,模型对照组小鼠肝细胞水肿变形,肝小叶界限模糊且局部出现坏死现象,肝细胞间伴有出血点及炎性细胞浸润现象。经灌胃给药后,各给药组小鼠肝脏损伤情况均有不同程度改善,阳性对照组小鼠肝脏细胞形态趋于正常,但细胞间仍存在炎性细胞团块。芸豆芽菜多酚处理组中,低剂量处理组小鼠肝脏细胞肿胀程度有所减轻;中剂量处理组小鼠肝脏肿胀细胞恢复正常形态,但胞间存在炎性细胞团;高剂量处理组小鼠肝脏细胞形态完整,炎性细胞浸润现象减轻,肝索走向正常。结果表明,芸豆芽菜多酚可修复受损的肝脏细胞,且其修复受损肝脏细胞能力与剂量呈正相关。

3 讨 论

由于现代环境、紫外、电磁辐射及自身压力的影响,人类常受到氧化应激的威胁,人体氧化应激反应可造成体内积累过多的由于氧化应激所产生的自由基(ROO·、·OH、O2·)[13-15],自由基可直接或间接地损伤细胞内DNA及蛋白质功能,是许多疾病发生的病理基础。自由基是极为活跃的离子基团,可攻击体内抗氧化酶活性中心,导致SOD、GSH-Px在内的抗氧化酶结构改变,失去其原有活性[16-17];其可与DNA分子带电中心结合,从而使DNA分子碱基取代或丢失,造成转录障碍或基因突变[18-19];造成脂质过氧化,形成脂质过氧化终产物MDA[20];破坏细胞膜结构的氧化还原特性,使胞内外物质运输及代谢功能紊乱,造成细胞损伤、水肿变性[21-22],危害甚大。

多酚是一类广泛存在于植物中的次生代谢类物质[23],研究表明,多酚类物质中含有大量酚羟基[24],其极易被氧化同时可作为氢供体(·H)对多种自由基具有有效的清除作用,并可将单线态氧自由基还原成活性较弱的三线态氧[25],参与自由基淬灭减少自由基的产生[26]。多酚类物质具有较高的抗氧化及抗癌活性,并可通过信号转导途径调控机体氧化酶基因表达[27-29],可参与调节Nrf2(NF-E2-related factor 2)转录因子活性,从而增强Nrf2激活抗氧化基因或蛋白表达的特性,提高机体细胞及抗氧化系统氧化应激能力,发挥抗氧化作用[30]

本实验以抗氧化活性物质VC为阳性对照,通过腹腔注射D-半乳糖溶液构建氧化损伤小鼠模型,探究了芸豆芽菜多酚对氧化损伤小鼠体内抗氧化及修复受损肝脏的作用。实验结果表明,D-半乳糖造模后,相较于空白对照组小鼠,模型对照组小鼠血清抗氧化酶SOD及GSH-Px活力显著下降(P<0.05),肝功能指示指标ALT及AST活力显著上升(P<0.05),肝脏病理学切片显示,肝脏细胞出现严重水肿变性,细胞间存在出血点和炎性细胞浸润现象。经灌胃给药后,与模型对照组小鼠相比较,芸豆芽菜多酚处理组小鼠血清中SOD及GSH-Px活力提高,且MDA含量下降,血清ALT及AST活力也有所下降,病理学切片显示,肝脏细胞肿胀程度有明显的好转,出血点及炎性细胞浸润现象减少,肝索脉络清晰,且不同剂量芸豆芽菜多酚处理组小鼠指标显示,芸豆芽菜多酚对于氧化损伤小鼠血清SOD、GSH-Px、MDA、ALT及AST水平的改善效果及对受损肝脏的修复情况与剂量呈正相关。本实验中,芸豆芽菜多酚可提高氧化损伤小鼠体内抗氧化酶含量并降低脂质过氧化产物的产生,同时可修复受损的肝脏组织细胞,显示了较为突出的体内抗氧化能力,并且芸豆芽菜多酚具有易提取、原材料丰富易得的优点,这将使芸豆芽菜多酚在体内抗氧化及修复机体脏器组织氧化损伤方面具有广阔的应用及市场前景。

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Effects of Kidney Bean Sprout Polyphenols on Restoring Antioxidant System and Oxidative Liver Injury in Mice

WANG Ying1,2, ZUO Zhaohang1, WANG Xinhui1, XU Bingzheng3, ZHU Lei1, LIU Shuting1, GONG Xue1
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. National Coarse Cereals Engineering Research Center, Daqing 163319, China; 3. Qingdao Langyatai Co. Ltd., Qingdao 266400, China)

Abstract:This experiment explored the effect of kidney bean sprout polyphenols on restoring the antioxidant system and D-galactose-induced liver injury in mice. Intraperitoneal injection of D-galactose solution was conducted to construct a mouse model of oxidative injury. Body weight, liver coefficient and superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase(GSH-Px), alanine aminotransferase (ALT) and aspartate transaminase (AST) activities and malondialdehyde (MDA)concentration in serum were determined after 28 days of continuous administration of different doses (20、40、60 mg/(kg·d))of kidney bean sprout polyphenols, and liver tissue sections were stained with hematoxylin-eosin and examined for the degree of liver damage and recovery. Compared with the model control group, oral administration of kidney bean sprout polyphenols showed no significant differences in body weight or liver coefficient (P 〉 0.05); however, serum SOD and GSH-Px activities in the middle- and high-dose groups were increased significantly (P 〈 0.05), MDA concentration was decreased significantly (P 〈 0.05),and the liver function indicators ALT and AST activities were reduced significantly (P 〈 0.05). Histopathological observation indicated that swollen hepatocytes were restored to normal by the administration of kidney bean sprout polyphenols and the number of intercellular bleeding points and inflammatory cell infiltration were reduced dose-dependently.

Key words:kidney bean sprout polyphenols; D-galactose; oxidative damage; liver; restoring effect

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721034

中图分类号:TS202.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)21-0212-05

引文格式:王颖, 佐兆杭, 王欣卉, 等. 芸豆芽菜多酚对氧化损伤小鼠体内抗氧化及肝脏损伤修复作用[J]. 食品科学, 2017, 38(21):212-216.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721034. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-10-13

基金项目:大庆市科技局创新项目(sjh-2013-65);国家星火计划项目(2015GA670008);黑龙江省应用技术研究与开发计划重大项目(GA15B301)黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目(YJSCX2017-Y56;YJSCX2017-Y57)

作者简介:王颖(1979—),女,副教授,博士,研究方向为农产品加工与贮藏工程及食品质量安全。E-mail:wychen156@163.com

WANG Ying, ZUO Zhaohang, WANG Xinhui, et al. Effects of kidney bean sprout polyphenols on restoring antioxidant system and oxidative liver injury in mice[J]. Food Science, 2017, 38(21): 212-216. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721034. http://www.spkx.net.cn