张 平，万鹰昕*，李 楠
（北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023）
摘 要：目的：观察亚硒酸钠与白藜芦醇单独及联合应用对肺癌细胞的影响，并通过细胞周期探讨其作用机理。方法：用四甲基偶氮唑盐法检测亚硒酸钠和白藜芦醇单独及联合应用对细胞增殖和存活的影响；用流式细胞术测定细胞的凋亡率及细胞周期。结果：亚硒酸钠和白藜芦醇对肺癌细胞A549均有拮抗作用，且随浓度的增加，拮抗效果越显著，当亚硒酸钠浓度大于等于5 μmol/L时，拮抗效果极显著（P＜0.01）；当白藜芦醇浓度大于等于65 μmol/L时，拮抗效果极显著（P＜0.01）。亚硒酸钠对A549细胞的半致死率（lethal dose of 50%，LD50）为4.759 μmol/L，白藜芦醇对A549细胞的LD50为45.24 μmol/L。然而亚硒酸钠和白藜芦醇联合用药作用于A549细胞的拮抗效果优于单独用药，且低剂量的亚硒酸钠和白藜芦醇联合就能发挥出高剂量亚硒酸钠对A549细胞的拮抗作用效果，有效地降低了亚硒酸钠对细胞的毒副作用。另外，亚硒酸钠联合白藜芦醇作用可以阻滞A549细胞G0/G1期，最终导致细胞凋亡。
关键词：亚硒酸钠；白藜芦醇；肺癌细胞A549；细胞周期；细胞凋亡
肺癌细胞是常见的导致死亡率最高的恶性肿瘤细胞之一，肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两种，而占死亡率80%以上的肺癌细胞是非小细胞肺癌细胞，即A549细胞[1]。19世纪中期Schwarz等[2]从面包酵母中分离出了一种能阻止肝细胞死亡的生物活性物质，通过研究证实是硒元素，自此人们从另外一个角度认识了硒元素。通过细胞和动物研究可以发现硒对肺癌、甲状腺癌、膀胱癌等均有一定的抑制效果[3-6]。硒的抗癌作用机制比较复杂，它是癌基因和抑癌基因表达的调节因子，对癌细胞具有促分化、抑分裂、诱导癌细胞程序性死亡的作用，明显影响癌基因和抑癌基因的表达。硒元素在生物体内以硒结合蛋白的形式存在。近年的研究证实，亚硒酸钠不仅能够抑制肿瘤细胞的生长，而且还能诱导其凋亡，且存在剂量-效应关系[7]。但其有效作用范围窄，高剂量有毒副作用。
白藜芦醇是一种普遍存在于自然界的植物次级代谢物，通过近年的研究发现，白藜芦醇对机体无毒副作用，另外，白藜芦醇在抗肿瘤[8-9]、心血管疾病治疗[10-12]、抗氧化、抗自由基[13-15]、保肝、影响骨代谢以及调节免疫、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗变态反应、辐射保护、预防急性传染性非典型肺炎等方面有药理作用。但白藜芦醇成本高，且对癌细胞的作用相对于亚硒酸钠效果不明显[16-17]。为减轻硒作用于癌细胞时的毒副作用，本实验探究亚硒酸钠与白藜芦醇联合应用对A549细胞的协同效应。
1.1 材料与试剂
A549细胞购于中国协和医科大学基础医学研究所。
胎牛血清、胰蛋白酶（含与不含乙二胺四乙酸）、DMEM/F12培养基 美国Hyclone公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、细胞周期试剂盒、细胞凋亡分析试剂盒 美国Genview公司。
1.2 仪器与设备
多功能酶标仪、恒温培养箱 美国Thermo公司；超净工作台 北京百剑空气净化设备厂；TE2000-M倒置显微镜 日本Nikon公司；BS110S型电子天平 美国Sartorius公司；恒温水浴锅 上海申顺生物科技有限公司；血球计数板（计数器） 北京鸿跃创新科技有限公司；GI 54 DWS自动压力蒸汽灭菌锅 致微（厦门）仪器有限公司；DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；液氮生物容器 四川乐山市东亚机电工贸有限公司。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
把细胞从液氮生物容器中取出，通过细胞复苏进行传代培养。在进行传代过程中，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）缓慢冲洗1～3 次，避免吹起细胞，用胰蛋白酶酶解细胞，在倒置显微镜下观察，底壁上约80%细胞呈现圆粒状、细胞间连接将要分离时，迅速吸掉胰蛋白酶溶液，避免胰蛋白酶处理过度。然后向直径100 mm、高20 mm的圆形培养皿内加入新鲜培养液4 mL，小心吹起皿底的细胞，尽量避免产生气泡（若有大的气泡，则吸除），保证皿底的所有细胞都吹下来，使其悬浮培养液中，再分装。
1.3.2 实验分组
实验组分为亚硒酸钠组、白藜芦醇组、亚硒酸钠和白藜芦醇联合用药组。亚硒酸钠浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol/L；白藜芦醇浓度为5、25、45、65、85、105、125 μmol/L。空白对照组不含A549细胞，对照组含A549细胞和无血清培养基。在532 nm波长处测定实验组、对照组和空白对照组OD值，按下式计算各实验组作用后A549细胞的存活率。
1.3.3 四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性
培养皿中取出处于对数期的A549细胞，在96 孔板中铺板。37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h，然后按照实验分组所设置好的药物浓度配制并依次加入96 孔板中，处理24 h，吸除废液，添加100 μL 5 mg/mL四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）溶液处理4 h，然后每孔加入100 μL DMSO处理10 min，最后用酶标仪检测细胞悬液OD值。
1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期
用对数期的细胞配制成密度为3×105个/mL的细胞悬液，再于6 孔板中按1 mL/孔添加混匀的细胞悬液，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。然后加药，37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h。分别用细胞凋亡和细胞周期试剂盒进行处理，最后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况和细胞周期。
1.4 数据分析
实验数据以
表示，用SPSS软件统计分析数据，单因素方差分析判断各处理组之间的差异显著性，S-N-K检验或Duncan’s检验进行两两比较，并用Origin软件作图。
2.1 亚硒酸钠和白藜芦醇单独用药对A549细胞存活率的影响
2.1.1 亚硒酸钠
亚硒酸钠是最普遍最广泛的硒强化剂，在抗癌方面也有一定的功能。由图1可知，A549细胞的存活率与亚硒酸钠浓度有关，随着亚硒酸钠浓度的升高，肺癌细胞的存活率先升高再逐渐降低，且当实验组亚硒酸钠浓度大于等于5.0 μmol/L时，细胞存活率与对照组差异极显著（P＜0.01）。亚硒酸钠对A549细胞的半致死率（lethal dose of 50%，LD50）为4.759 μmol/L。
图1 亚硒酸钠对A549细胞存活率的影响
Fig. 1 Effect of sodium selenite on survival rate of A549 cells
2.1.2 白藜芦醇
图2 白藜芦醇对A549细胞存活率的影响
Fig. 2 Effect of resveratrol on survival rate of A549 cells
白藜芦醇是植物为了对抗外界刺激如紫外线、机械损伤而产生的一种植物抗毒素，研究发现白藜芦醇具有广泛的生物活性，在抗癌方面具有一定的疗效且无毒副作用[10]。由图2可知，肺癌细胞的存活率与白藜芦醇浓度有关，随着白藜芦醇浓度的升高，A549细胞的存活率先升高再逐渐降低，当白藜芦醇的浓度不小于65 μmol/L时，与对照组相比，实验组A549细胞的存活率差异极显著（P＜0.01）。白藜芦醇对A549细胞的LD50值为45.24 μmol/L。
2.2 亚硒酸钠和白藜芦醇联合用药对A549细胞存活率的影响
图3 亚硒酸和白藜芦醇钠联合用药对A549细胞存活率的影响
Fig. 3 Effect of sodium selenite combined with resveratrol on survival rate of A549 cells
如图3所示，不含亚硒酸钠时，A549细胞的存活率先是随着白藜芦醇浓度的升高而升高，当浓度大于25 μmol/L后，细胞存活率逐渐降低；当加入亚硒酸钠后，随着白藜芦醇浓度的升高细胞存活率先降低，当白藜芦醇浓度升至约25 μmol/L后，存活率随着浓度的升高而升高。当白藜芦醇浓度一定时，随亚硒酸钠浓度的增加，细胞存活率下降，当亚硒酸钠浓度大于等于5 μmol/L时，与对照组相比，实验组A549细胞的存活率差异极显著（P＜0.01），且其细胞存活率在10%～50%之间。当亚硒酸钠浓度小于等于2 μmol/L，白藜芦醇浓度为25、45 μmol/L时，A549细胞的存活率在40%～70%之间；当亚硒酸钠浓度大于2 μmol/L，白藜芦醇浓度在5、25 μmol/L时，A549细胞的存活率在15%～30%之间。
2.3 亚硒酸钠和白藜芦醇联合用药对A549细胞凋亡的影响
图4 亚硒酸钠和白藜芦醇对A549细胞凋亡的影响
Fig. 4 Effect of 2,5 μmol/L sodium selenite combined with 25 μmol/L resveratrol on apoptosis in A549 cells
A. 2 μmol/L亚硒酸钠、25 μmol/L白藜芦醇的各组流式细胞检测图；B. 5 μmol/L亚硒酸钠、25 μmol/L白藜芦醇的各组流式细胞检测图；C. 白藜芦醇25 μmol/L，亚硒酸钠分别为2、5 μmol/L时不同处理组细胞凋亡率。下标1～4.分别为对照组、亚硒酸钠组、白藜芦醇组、联合用药组。＃＃.与联合用药组相比差异极显著（P＜0.01）。
亚硒酸钠是无机硒化合物，据研究发现，亚硒酸钠对机体细胞有一定的毒副作用[18]；白藜芦醇是从植物中提取出来的天然活性物质[19]，在一定浓度范围内，对机体无毒副作用。根据亚硒酸钠和白藜芦醇对A549细胞的LD50设置了2 种研究方案：1）亚硒酸钠浓度为2 μmol/L，白藜芦醇浓度为25 μmol/L；2）亚硒酸钠浓度为5 μmol/L，白藜芦醇浓度为25 μmol/L。
细胞凋亡贯穿于肿瘤发生、肿瘤免疫监测、组织细胞代谢等过程的开始。由图4可以看出，与不加亚硒酸钠和白藜芦醇的对照组相比，单独用药组和联合用药组都能促进细胞凋亡，但亚硒酸钠组和联合用药组细胞凋亡率差异极显著（P＜0.01）；当2 μmol/L亚硒酸钠和25 μmol/L白藜芦醇联合用药时，与亚硒酸钠组相比，联合用药组的凋亡率差异极显著（P＜0.01），这说明了与其他组相比，联合用药组对A549细胞抑制作用更显著，差异更明显。当5 μmol/L亚硒酸钠和25 μmol/L白藜芦醇联合用药时，与亚硒酸钠单独用药组相比，细胞凋亡率差异极显著（P＜0.01）。
亚硒酸钠的毒副作用与其浓度有关，高剂量比低剂量的亚硒酸钠毒副作用更显著。当亚硒酸钠浓度为2 μmol/L且白藜芦醇浓度为25 μmol/L时，A549细胞的凋亡率为（3.733±1.038）%；当亚硒酸钠浓度为5 μmol/L且白藜芦醇浓度为25 μmol/L时，A549细胞的凋亡率为（2.217±0.689）%。由此可见，与亚硒酸钠浓度为5 μmol/L的联合用药组相比，亚硒酸钠浓度为2 μmol/L时的联合用药组的效果差异显著（P＜0.05）。
另外，随着研究的不断深入，细胞凋亡的调控和增殖还与众多基因蛋白的表达有关，比如促凋亡基因（P53、Bax）、抑凋亡基因（Bcl-2）等[20-23]。细胞凋亡的早期特征变化主要包括出现水解酶Caspase-3，活化的Caspase-3能够裂解胞内众多酶类，其也能使细胞发生细胞形态学变化[24-27]。这对亚硒酸钠与白藜芦醇联合用药对A549细胞影响的分子机制研究具有重要的借鉴以及指导作用。
2.4 亚硒酸钠和白藜芦醇联合对A549细胞周期的影响
图5 亚硒酸钠联合白藜芦醇对A549细胞周期的影响
Fig. 5 Effect of sodium selenite combined with resveratrol on cell cycle in A549 cells
表2 亚硒酸钠与白藜芦醇联合用药对A549细胞周期的影响
Table 2 Effect of sodium selenite combined with resveratrol on cell cycle in A549 cells cycle
注：同列肩标字母不同表示差异显著（P＜0.05）。细胞比例为各时期细胞数量占有效细胞数量的百分比。
肿瘤细胞的一大特点就是无限增殖，其主要原因是其细胞周期失控所致，因此干扰肿瘤细胞无限增殖是治疗肿瘤的另一个思路。有丝分裂是细胞实现增殖的必须手段。有丝分裂间期分为G1、S、G2 3 个阶段，其中在G1期与G2期细胞进行DNA的复制与有关蛋白质的合成，S期进行DNA的复制。故S期是完成遗传信息复制的最重要阶段。因此，阻止细胞周期由G1期到S期的过渡是抑制肿瘤细胞增殖的有效方法并且在癌症治疗中起到重要的作用[28-30]。如图5和表2所示，与对照组细胞相比，亚硒酸钠组G0/G1期细胞比例显著减少，S期细胞比例显著增大（P＜0.05），说明亚硒酸钠可将细胞周期阻滞在S期。这与王家骏等[31]研究亚硒酸钠与顺铂联合用药作用于体外A549细胞时发现亚硒酸钠中、高剂量组A549细胞的周期被阻滞于G0/G1期的结果相同。而白藜芦醇组与对照组相比，G0/G1期细胞比例显著增大，S期细胞比例显著减少（P＜0.05），提示白藜芦醇可将细胞周期阻滞在G0/G1期。而陈加顺等[32]通过白藜芦醇作用于A549细胞的研究发现，随着白藜芦醇浓度的增加，G0/G1期细胞比例越来越高，抑制细胞从G0/G1期向S期转变，从而抑制肺腺癌细胞的增值。亚硒酸钠和白藜芦醇联合用药作用于A549细胞后，G0/G1期细胞与亚硒酸钠组相比显著增多（P＜0.05）。提示亚硒酸钠联合白藜芦醇作用后，可以对A549细胞形成G0/G1期阻滞，最终诱导细胞凋亡。
本研究分析和评价了亚硒酸钠和白藜芦醇单独用药和联合用药对A549细胞拮抗的效果，通过比较单独用药和联合用药对A549细胞的存活率、细胞凋亡以及细胞周期得出如下结论：亚硒酸钠和白藜芦醇联合用药能抑制A549细胞增殖，在一定的剂量范围之内，与单独用药相比，联合用药的抑制效果显著；亚硒酸钠是无机硒，且其具有一定的毒性，而白藜芦醇无毒，在本研究中，低剂量（2 μmol/L）的亚硒酸钠联合白藜芦醇作用于A549细胞的抑制效果优于高剂量（5 μmol/L）的亚硒酸钠单独使用的作用效果。
通过本研究可以初步判定亚硒酸钠和白藜芦醇的最适宜配比，为进一步研究亚硒酸钠和白藜芦醇联合用药对A549细胞的分子机制研究提供依据。总之，在一定的剂量范围之内，亚硒酸钠和白藜芦醇的联合用药对A549细胞有一定的拮抗作用，而且还能缓解亚硒酸钠的毒副作用，可为对A549细胞的临床研究提供一些依据。然而，亚硒酸钠和白藜芦醇诱导A549细胞凋亡具体机制尚需进一步研究。
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Synergistic Effect of Sodium Selenite and Resveratrol on Lung Cancer Cell Line
ZHANG Ping, WAN Yingxin*, LI Nan
(College of Biochemical Engineering, Beijing Union University, Beijing 100023, China)
Abstract:Objective: To investigate the effect of sodium selenite, resveratrol and their combination on the proliferation and apoptosis of lung cancer cell line A549 cells and to explore the underlying mechanisms. Methods: Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to assess the individual and combined effects of sodium selenite and resveratrol on proliferation and survival of A549 cells. The cell apoptosis rate and cell cycle were determined by flow cytometry. Results indicated that sodium selenite and resveratrol had an antagonistic effect on A549 cells in a concentration-dependent manner,and the effect was very significant at a concentration ≥ 5 μmol/L for sodium selenite and ≥ 65 μmol/L for resveratrol (P ＜0.01). The median lethal doses of (LD50) of sodium selenite and resveratrol for A549 cells were 4.759 and 45.24 μmol/L,respectively. However, when sodium selenite and resveratrol were used in combination, a synergistic effect was observed.The combination of low-dose sodium selenite and resveratrol inhibited A549 cells as effectively as high-dose sodium selenite, greatly reducing the cytotoxicity of high-dose sodium selenite. In addition, the combination of sodium selenite and resveratrol arrested the cell cycle at the G0/G1 phase and ultimately led to cell apoptosis.
Key words:sodium selenite; resveratrol; lung cancer A549 cells; cell cycle; cell apoptosis
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721035
中图分类号：TS201.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）21-0217-06
引文格式：张平, 万鹰昕, 李楠. 亚硒酸钠与白藜芦醇联合应用对肺癌细胞的协同效应分析[J]. 食品科学, 2017, 38(21): 217-222.
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201721035. http://www.spkx.net.cn
ZHANG Ping, WAN Yingxin, LI Nan. Synergistic effect of sodium selenite and resveratrol on lung cancer cell line[J]. Food Science,2017, 38(21): 217-222. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721035. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2017-05-03
基金项目：北京市教委面上项目（KM201711417008）；北京联合大学“启明星”大学生科技创新项目
作者简介：张平（1989—），男，硕士研究生，研究方向为微量元素成分提取加工及其性能。E-mail：2369248122@qq.com
*通信作者：万鹰昕（1976—），女，教授，博士，研究方向为微量元素富硒活性成分提取加工及其性能。E-mail：wyx@buu.edu.com