β-氨基丁酸抑制草莓低温贮藏过程中灰霉病的效果及其机理

王 雷1,李 华1,张 华1,王 会1,金 鹏2,赵 燕1,郑永华2,*

(1.聊城大学农学院,山东 聊城 252000;2.南京农业大学食品科技学院,江苏 南京 210095)

摘 要:以‘红颜’草莓为实验材料,研究β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid,BABA)对草莓果实采后贮藏在低温((5±1)℃)条件下灰霉病的抑制效果及相关机理。草莓果实经过20 mmol/L的BABA处理后接种灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)孢子,然后在(5±1)℃的条件下贮藏12 d,结果发现BABA显著抑制了灰霉病的发生和病斑直径的扩展,与对照组相比,处理组几丁质酶(chitinase,CHI)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,GLU)的活力分别提高了9.2%和54.9%,多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)和纤维素酶(cellulose,Cel)的活力分别降低了29.3%和24.4%,同时,BABA提高了FaCHI和FaGLU基因的表达,抑制了FaPG和FaCel基因的表达;此外,体外实验的结果发现,BABA能够破坏灰葡萄孢霉孢子的质膜完整性,导致了孢子内部可溶性蛋白质和可溶性糖的泄漏。结果表明,BABA通过诱导抗病相关酶活力来提高抗病性、延缓果实软化并通过对病原菌的直接抑制作用减轻草莓果实采后灰霉病的发生。

关键词:草莓;β-氨基丁酸;灰葡萄孢霉;诱导抗性;基因表达;质膜完整性

草莓(Fragaria ananassa Duch.)属蔷薇科草本植物,果实为浆果类,成熟水果组织娇嫩多汁,采摘和运输过程中易遭受物理损伤和病原菌侵染而发生腐烂变质[1],其中由灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是草莓果实采后贮运过程中最常见的真菌性病害之一[2]。水果采后真菌性病害的传统防治措施主要是使用化学杀菌剂,但随着人们对化学残留以及真菌抗药性的关注,采用绿色的激发子诱导抗病性正越来越受到研究者的重视[3]

通过激发子诱导提高果蔬采后抗病性成为国际上果蔬贮藏保鲜研究的热点。β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid,BABA)是一种结构简单的非蛋白质氨基酸,对多种作物以及水果具有广谱的诱导抗病活性,能够抑制病害的发生[4]。Ton等[5]研究发现BABA提高了拟南芥对霜霉病的抗病性,Šašek等[6]发现BABA处理过的油菜在接种病原菌之后病程相关蛋白(pathogenesis related protein,PR)得到了积累,提高了油菜的抗病性。众多的研究结果表明,BABA处理分别诱导了苹果[7]、葡萄[8]、桃[9]以及冬枣[10]等果实对采后真菌病害的抗性,提高了果实中几丁质酶(chitinase,CHI)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,GLU)等抗病相关酶活性,减轻了贮藏期间的病害。然而关于BABA对草莓果实在冷藏期间抗病保鲜的相关研究鲜见报道,本实验选择‘红颜’果实为实验材料,研究了BABA在草莓果实冷藏过程中对灰霉病的抑制效果及相关机理,为BABA在草莓采后贮运中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

病原菌灰葡萄孢霉分离于自然发病的草莓果实。

草莓品种为‘红颜’(Fragaria ananassa Duch. cv.Hongyan),商业成熟期采摘自聊城市冠县农业生态园,采摘后立即运到实验室,选择大小基本相同、无病虫害和物理损伤的果实。

考马斯亮蓝、牛血清白蛋白、β-巯基乙醇、半胱氨酸、柠檬酸、磷酸氢二钠 国药集团化学试剂有限公司;十六烷基三甲基溴化胺(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB) 美国Biosharp公司。

1.2 仪器与设备

SP-752型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;Axioskop 40荧光显微镜 卡尔蔡司光学(中国)有限公司;Nano Drop 2000分光光度计 美国赛默飞世尔科技公司;SPX-250B生化培养箱 上海博迅实业有限公司;MyCycler普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 原料的预处理

灰葡萄孢霉经鉴定和回接实验后,从草莓果实的病健交界处再次分离纯化所得,将病原菌接种在PDA培养基(马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL,121 ℃灭菌20 min)进行扩大培养,26 ℃条件下培养14 d,随后用无菌生理盐水将菌种的浓度配成1×105CFU/mL(血球计数板计数),现用现配。

实验中所用草莓随机分成2 组(处理组和对照组),为避免交叉感染,先用酒精(75%)擦拭草莓果实表面需要接种的部位,用灭菌铁钉在果实的赤道部位打孔(深3 mm、直径2 mm)。处理组用移液枪注入20 µL、20 mmol/L的BABA(预实验最优浓度),对照组注入等量的无菌水,3 h后在果实的打孔处注入15 µL的病原菌孢子悬液。接种后,将果实用塑料盒分装,并用0.01 mm厚的聚乙烯保鲜袋保湿,将果实贮藏于(5±1)℃、相对湿度为90%的培养箱中12 d,每隔4 d测定果实的发病率和病斑直径,并在去除腐烂组织后用液氮取样保存在-80 ℃的冰箱中,测定其他生化指标。每个处理组60 个果实,实验重复3 次。

1.3.2 发病率和病斑直径的测定

发病率的测定参考龙清红等[8]的方法,草莓果实上灰霉病的病斑直径大于2 mm时,认定为发病,其计算如式(1)所示。

病斑直径用游标卡尺进行测定。

1.3.3 BABA对病原菌灰葡萄孢霉孢子质膜完整性的影响

BABA对灰葡萄孢霉质膜完整性的实验参考Liu Jia等[11]的方法并作改进。用移液枪取100 μL灰霉孢子菌悬液加入到含20 mmol/L BABA的PDB培养基(20 mL)中,使得灰葡萄孢霉孢子的终浓度为5×105CFU/mL,不含BABA的试管作为对照。试管在26 ℃、200 r/min的恒温摇床中培养,4 ℃、10 000×g离心20 min,收集培养时间为0、2、4、6 h的病原菌孢子。用磷酸缓冲液(50 mmol/L、pH 7.0)冲洗2 次以去除残留培养基,灰葡萄孢霉孢子悬液用10 mg/mL的碘化丙啶(propidium iodide,PI)在30 ℃条件下染色5 min,离心收集孢子并用缓冲液冲洗去除残留染料。在荧光显微镜下观察孢子的染色情况,并依据公式(2)计算质膜完整性。

1.3.4 BABA对灰葡萄孢霉孢子可溶性蛋白质和可溶性糖泄漏的影响

BABA对灰葡萄孢霉孢子内可溶性蛋白质和可溶性糖泄漏的测定按照Zhang Changfeng等[12]的方法并作改进。100 μL灰霉孢子菌悬液转移到含有100 mL PDB培养基的三角瓶中,灰葡萄孢霉孢子终浓度为5×105CFU/mL,在26 ℃、200 r/min的摇床培养,3 d后收集菌丝体。用双蒸水冲洗3 次去除剩余的培养基,称取3 g菌丝体转移到含BABA(20 mmol/L)的20 mL双蒸水的锥形瓶中,不含BABA作为对照,26 ℃、200 r/min的摇床上培养2、4、6 h后,用0.2 μm的微孔膜过滤,收集滤液测定总可溶性蛋白质和可溶性糖的含量。可溶性蛋白质含量的测定依据Bradford[13]的方法,使用考马斯亮蓝法进行测定,牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)作为标准,结果表示为mg/g(以菌丝体质量计)。可溶性糖含量的测定参考Dubois等[14]的方法,用苯酚-硫酸法测定,以葡萄糖作为标准,结果表示为mg/g(以菌丝体质量计)。

1.3.5 CHI、GLU、多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶活力的测定

称取1.0 g果肉,冰浴条件下用5 mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)匀浆,4 ℃、12 000×g离心20 min,取上清液用于测定CHI和GLU的活力。按照Wang Lei等[15]的方法,测定2 种酶的活力。以524 nm波长处反应混合物每分钟增加0.001吸光度所需要的酶量为1 个CHI活力单位(U);使用3,5-二硝基水杨酸法,测定反应体系在540 nm波长处的吸光度,以每小时生成1 mg葡萄糖为1 个GLU活力单位(U),结果以U/mg pro表示。

称取1.0 g果肉组织,冰浴条件下用5 mL、40 mmol/L的乙酸钠缓冲液(pH 5.5,其中含有100 mmol/L NaCl、体积分数2% β-巯基乙醇、体积分数0.2%半胱氨酸和质量分数1%聚乙烯吡咯烷酮)研磨,4 ℃、12 000×g离心20 min,取上清液测定多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)活力,参照Zhou Hongwei等[16]的方法,以半乳糖醛酸作为标准,测定276 nm波长处的吸光度,每小时水解释放1 μmol/L半乳糖醛酸定义为1 个酶活力单位(U)。

称取1.0 g草莓果肉组织,冰浴条件下用5 mL NaCl(0.4 mol/L)充分研磨,4 ℃条件下12 000×g离心20 min,取上清液测定纤维素酶(cellulose,Cel)活力,根据朱树华[17]使用的方法进行测定。以1 h催化纤维素水解生成1 μg的葡萄糖所消耗的酶量为1 个酶活力单位,用U/mg pro表示。

1.3.6 FaCHI、FaGLU、FaPG和FaCel基因的表达

草莓果实抗病相关基因的表达根据Jiang Lulu等[18]的方法进行测定,测定的抗病相关基因包括FaCHI、FaGLU、FaPG和FaCel,根据美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)数据库中相关基因的序列,利用Primer 5.0设计相关基因的PCR引物序列,由上海赛百盛生物基因技术有限公司合成,引物序列的相关信息见表1。果肉组织(5.0 g)在液氮中充分研磨,在15 mL含体积分数2%巯基乙醇的CTAB提取液(65 ℃)中混匀提取20 min,4 ℃离心20 min,所得上清液用等体积氯仿提取并离心,上清液用10 mol/L的氯化锂沉淀,随后4 ℃、12 000×g离心15 min,所得沉淀用SSTE溶液(内含1.0 mol/L NaCl、质量分数0.5%SDS、10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)和1 mmol/L乙二胺四乙酸)溶解,并用氯仿抽提2 次。抽提后的上清液用无水乙醇沉淀,所得的RNA用Nano Drop 2000分光光度计测定260 nm和280 nm波长处的光密度值并计算RNA含量。反转录过程按照2步法反转录(reverse transcription,RT)-PCR程序操作,以18S rRNA基因作为管家基因,对草莓果实相关基因的表达情况进行分析,用Quantity One v4.6软件计算目的基因光密度值和内参基因光密度值,按照式(3)计算基因相对表达量。

表1 草莓果实抗病相关基因引物
Table 1 Primers for the defense-related genes in strawberry fruits

1.4 数据统计分析

采用Origin 8.5软件对实验数据进行分析,用Duncan多重比较方法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 BABA对草莓果实灰霉病的抑制效果

如图1所示,草莓果实在低温((5±1)℃)贮藏过程中,发病率和病斑直径在贮藏过程中随时间延长而增加,贮藏第12天时处理组和对照组的发病率均达到100%,但BABA处理能够显著抑制灰霉病病斑直径的增大,贮藏期间处理组果实的病斑直径都显著小于对照组(P<0.05),5 ℃贮藏12 d后,对照组和处理组病斑直径分别为12.54 mm和6.87 mm,处理组的病斑直径仅为对照组的54.8%。

图1 BABA对草莓果实灰霉病发病率(A)和病斑直径(B)的影响
Fig. 1 Effect of BABA on disease incidence (A) and lesion diameter (B)of gray mold in strawberry fruits

2.2 BABA对病原菌灰葡萄孢霉孢子质膜完整性的影响

图2 BABA对灰葡萄孢霉孢子质膜完整性的影响
Fig. 2 Effect of BABA on plasma membrane integrity of B. cinerea spores

从图2可以看出,对照组的灰葡萄孢霉孢子在培养过程中,质膜完整性基本没有变化,而在含有BABA的PDB培养基中,病原菌孢子的质膜完整性在培养2 h内略有下降,随后处理组的孢子质膜完整性急剧下降。这说明20 mmol/L的BABA处理破坏了灰葡萄孢霉孢子的质膜完整性。

2.3 BABA对病原菌灰葡萄孢霉孢子内可溶性蛋白质和可溶性糖泄漏的影响

从图3可以看出,随着培养时间的延长量,病原菌孢子中的可溶性蛋白质和可溶性糖的泄露在培养期间呈现上升的趋势。在整个培养过程中,BABA处理组中的可溶性蛋白质和可溶性糖的泄露量都显著高于对照组(P<0.05)。培养6 h后,处理组和对照组中可溶性蛋白质含量分别为0.40、0.19 mg/g,处理组是对照组的2.1 倍;处理组和对照组中可溶性糖含量分别为1.95、0.90 mg/g,处理组是对照组的2.2 倍。这说明BABA处理促进了灰葡萄孢霉孢子内蛋白质和糖的泄露。

图3 BABA对灰葡萄孢霉孢子内可溶性蛋白质(A)和可溶性糖(B)泄漏的影响
Fig. 3 Effect of BABA on protein (A) and sugar (B) leakage from B. cinerea spores

2.4 BABA对草莓果实CHI和GLU活力的影响

图4 BABA对草莓果实CHI(A)和GLU(B)活力的影响
Fig. 4 Effect of BABA on CHI (A) and GLU (B) activities in strawberry fruits

如图4所示,在低温贮藏过程中,对照组草莓果实CHI的活力呈逐渐上升趋势,处理组果实在贮藏的前8 d逐渐上升并达到最大值,随后略有下降,贮藏结束时,处理组和对照组CHI活力分别为20.2、18.5 U/mg pro,处理组比对照组活力高9.2%;处理组的GLU活力在贮藏期间呈上升趋势,而对照组的GLU活力在贮藏的第8天达到最大值后下降,贮藏结束时,处理组和对照组GLU活力分别为10.6、6.8 U/mg pro,处理组比对照组的高55.9%。整个贮藏过程,处理组的CHI和GLU活力都显著高于对照组(P<0.05),说明BABA处理能够提高草莓果实中CHI和GLU的活力。

2.5 BABA对草莓果实PG和Cel活力的影响

图5 BABA对草莓果实PG(A)和Cel(B)活力的影响
Fig. 5 Effect of BABA on PG (A) and Cel (B) activities in strawberry fruits

从图5可以看出,草莓果实的PG和Cel活力在贮藏期间逐渐上升,BABA处理可以抑制酶活力的升高。在整个贮藏期间,处理组果实的PG活力均显著低于对照组(P<0.05),贮藏结束时(12 d),处理组和对照组的PG活力分别为1.45、2.05 U/mg pro,处理组的PG活力仅为对照组的70.7%;处理组果实Cel活力从贮藏的第8天开始显著低于对照组(P<0.05),贮藏结束时(12 d),处理组和对照组的Cel活力分别为65.6、86.8 U/mg pro,处理组的Cel活力仅为对照组的75.6%。这说明BABA处理能够延缓草莓果实的软化。

2.6 BABA对草莓果实抗病相关基因表达的影响

图6 BABA对草莓果实抗性相关基因表达的影响
Fig. 6 Effect of BABA on the expression of defense-related genes in strawberry fruits

从图6可以看出,贮藏第4天时,对照组果实的FaCHI和FaGLU基因表达量略有升高,而处理组果实的FaCHI和FaGLU基因表达量急剧升高,并维持在较高的水平;对照组草莓果实FaPG和FaCel基因的表达量随着贮藏时间的延长逐渐增加随后下降,而整个贮藏过程中,处理组果实的FaPG和FaCel基因表达量总体均低于对照组。这说明BABA处理抑制了FaPG和FaCel基因的表达。

3 讨 论

诱导抗病性是植物在长期进化过程中形成的一种重要的抗病机制。采用各种物理、化学或者生物激发子处理提高果蔬的抗病性被认为是减少病害侵染的有效方式[19]。BABA作为一种新型的化学激发子,被认为是调节植物诱导抗性中的重要信号分子,参与了众多抗病反应的过程[20]。在本研究中,BABA处理显著抑制了草莓果实采后灰霉病的发病率(贮藏前期)和病斑直径的扩展,实验结果说明,BABA处理提高了草莓果实的抗病性,减轻了草莓采后灰霉病的发生。

激发子对病原菌的直接抑制作用有助于减轻病原菌对水果的侵染[21]。离体实验证明,BABA破坏了灰葡萄孢霉孢子的质膜完整性,造成孢子内部可溶性蛋白质和可溶性糖的泄漏。Wang Lei等[22]研究结果表明,蜡样芽孢杆菌在体外实验中抑制了青霉孢子的生长,减轻了甜樱桃果实的采后病害。此外,茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)也通过抑制某些采后致病真菌离体条件下的生长,提高了抗病性[23-24]。这些结果说明,直接抑制灰葡萄孢霉孢子的生长是BABA能够抑制草莓采后灰霉病发生的原因之一。

水果采后抗病性的提高与PR的含量密切相关[25]。GHI和GLU是2 种重要的PR蛋白,在植物体中这2 种酶能够水解真菌细胞壁中的几丁质和葡聚糖从而破坏病原菌细胞的结构,抵抗真菌侵染[26]。Wang Kaituo等[27]的研究结果证实,杨梅果实经过热空气处理3 h后,果实中GHI和GLU活性显著提高,降低了果实的自然腐烂率和青霉病的发生。葡萄果实采后经过MeJA处理诱导提高了果实中CHI和GLU的活性和相关基因的表达,增强了果实对灰霉病的抗性[18]。在本研究中,BABA处理组果实中的CHI、GLU的活性和FaCHI、FaGLU基因的表达在低温贮藏过程中都显著高于对照组(P<0.05),果实的发病率和病斑直径也都显著小于对照果实(P<0.05),这说明BABA处理可以通过诱导草莓果实抗病相关酶活性的提高和增强相关基因表达来抑制灰霉病的发生和发展。

水果的软化是水果成熟和贮藏过程中的正常现象,是一个不可逆的过程,包括众多分子、生化和生理等方面的变化,水果软化与果实的抗病性密切相关[28]。果实的软化主要是由细胞壁的降解造成,这些变化与水果中细胞壁降解酶有关,PG和Cel在果胶的降解中起着重要的作用。PG水解多聚半乳糖醛酸,使细胞壁分解,Cel水解细胞壁中的纤维素和半纤维素,最终影响果实内部的结构,导致果实软化[29]。Cantu等[30]的研究发现,抑制番茄果实的软化能够降低番茄果实对灰霉病的敏感性。Wang Lei等[24]的研究也发现,MeJA熏蒸抑制了甜樱桃果实PG活力的升高,下调了与软化相关基因的表达,提高了其抗病性。本研究中,BABA处理抑制了PG、Cel活性的升高和FaPG、FaCel基因的表达,提高了果实的抗病性,这说明BABA处理可以通过延缓草莓果实的软化来提高其抗病性。

综上所述,20 mmol/L的BABA处理能够显著降低低温贮藏过程中草莓果实采后灰霉病的发病率和病斑直径。BABA通过破坏灰葡萄孢霉孢子的质膜完整性、诱导抗病相关酶活性升高和相关基因的表达以及延缓草莓果实的软化共同促进了果实抗病性的提高,减轻了草莓果实腐烂的发生。

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Inhibitory Effect and Mechanisms of β-Aminobutyric Acid on Grey Mold (Botrytis cinerea) in Strawberry Fruits during Low Temperature Storage

WANG Lei1, LI Hua1, ZHANG Hua1, WANG Hui1, JIN Peng2, ZHAO Yan1, ZHENG Yonghua2,*

(1. College of Agriculture, Liaocheng University, Liaocheng 252000, China;2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract:The inhibitory effects of β-aminobutyric acid (BABA) on gray mold decay caused by Botrytis cinerea in harvested strawberry fruits stored at (5 ± 1) ℃ and the possible mechanisms were investigated. The strawberry fruits were pretreated with 20 mmol/L BABA, inoculated with the spores of Botrytis cinerea, and then stored at (5 ± 1) ℃ for 12 days. The results showed that the fruits treated with BABA had significantly lower disease incidence and smaller lesion diameters than the control fruits. The fruits treated with BABA showed 9.2% higher activity of chitinase (CHI) and 54.9% higher activity of β-1,3-glucanase (GLU) than the control fruits at the end of storage. BABA-treated fruits showed 29.3% lower activity of polygalacturonase (PG) and 24.4% lower activity of cellulose (Cel) than the control fruits. BABA treatment upregulated the expression of FaCHI and FaGLU and downregulated the expression of FaPG and FaCel. Moreover, BABA damaged the plasma membrane integrity of B. cinerea spores and caused the leakage of protein and sugar from the pathogen mycelia in vitro.The results indicated that BABA could effectively inhibit gray mold decay in strawberry fruits, which may be related to increased defense-related enzyme activities in fruits, suppressed PG and Cel activities and direct fungitoxic property against the pathogen.

Key words:strawberry; β-aminobutyric acid; Botrytis cinerea; induced resistance; gene expression; plasma membrane integrity

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721043

中图分类号:TS255.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)21-0272-07

引文格式:王雷, 李华, 张华, 等. β-氨基丁酸抑制草莓低温贮藏过程中灰霉病的效果及其机理[J]. 食品科学, 2017, 38(21): 272-278.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721043. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-12-21

基金项目:公益性行业(农业)科研专项(201303073);国家自然科学基金青年科学基金项目(31601521);山东省高等学校科技计划项目(J16LF61);聊城大学博士启动基金项目(318051535);聊城大学大学生科技文化创新基金项目(26312168812)

作者简介:王雷(1981—),男,讲师,博士,研究方向为果蔬采后生理与贮藏保鲜。E-mail:freshair928@163.com

*通信作者:郑永华(1963—),男,教授,博士,研究方向为果蔬采后生理与贮藏保鲜。E-mail:zhengyh@njau.edu.cn

WANG Lei, LI Hua, ZHANG Hua, et al. Inhibitory effect and mechanisms of β-aminobutyric acid on grey mold (Botrytis cinerea) in strawberry fruits during low temperature storage[J]. Food Science, 2017, 38(21): 272-278. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721043. http://www.spkx.net.cn