费 鹏1，杨同香1，姜亦超2，陈俊亮1，罗 磊1，任广跃1，康怀彬1,*，Stephen James FORSYTHE3,*
（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.长白山食品药品检验检测中心，吉林 白山 134500；3.诺丁汉特伦特大学病原体研究中心，英国 诺丁汉 NG11 8NS）
摘 要：克罗诺杆菌原名阪崎肠杆菌，是婴儿配方乳粉中主要的致病菌之一，能感染新生儿，并导致严重的坏死性小肠结肠炎、菌血症和脑膜炎等疾病，致死率高达40%～80%。本文综述了克罗诺杆菌常见的表型分型和分子分型方法，包括生化分型、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分型、血清型分型、脉冲场凝胶电泳分型、多位点序列分型、随机多态性扩增DNA基因分型、核糖体分型、特殊基因分型和全基因组分型，以期增加人们对克罗诺杆菌分型方法的认识，为全面揭示克罗诺杆菌的表型特征和遗传多样性提供方法和依据。
关键词：克罗诺杆菌；表型分型；分子分型；分型技术
克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）属于肠杆科，由阪崎克罗诺杆菌（C. sakazakii）、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌（C. malonaticus）、穆汀斯克罗诺杆菌（C. muytjensii）、苏黎世克罗诺杆菌（C. turicensis）、都柏林克罗诺杆菌（C. dublinensis）、传奇克罗诺杆菌（C. universalis）和调味品克罗诺杆菌（C. condimenti）7 个种组成，具有高度的遗传多样性[1-3]。更重要的是，克罗诺杆菌属于婴儿配方乳粉中的A类致病菌，新生儿尤其是体质量较轻的早产儿摄入被克罗诺杆菌污染的婴儿配方乳粉后，会发生严重的坏死性小肠结肠炎、菌血症和脑膜炎等疾病，死亡率为40%～80%[4-5]。2014年XU Xiaoke等[6]从530 份市售的婴儿配方乳粉中共检测到23 株克罗诺杆菌，污染率高达4.3%。然而并不是所有的克罗诺杆菌都具有致病性，且不同的克罗诺杆菌的致病能力也不相同。据报道，阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌和苏黎世克罗诺杆菌具有致病性，且克罗诺杆菌毒素毒性的强弱与其分型的种类有密切联系[7-8]。
克罗诺杆菌的分型方法包括表型分型和分子分型，其中表型分型包括生化分型和蛋白分型，分型的结果不仅能反映出克罗诺杆菌的形态特征、蛋白结构、血清型等表型特征，也可以对克罗诺杆菌进行鉴定，具有较高的灵敏度，但可能产生一定的假阳性[9]。克罗诺杆菌分子分型的方法多种多样，如脉冲场凝胶电泳分型、多位点序列分型、随机多态性扩增DNA基因分型、核糖体分型、全基因组分型等，可以从基因层面揭示克罗诺杆菌之间相似程度及系统发育关系，并能达到对婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌进行溯源的目的。本文对克罗诺杆菌的分型方法进行了综述，以期为克罗诺杆菌表型和遗传多样性的研究提供理论依据。
1.1 生化分型
克罗诺杆菌的生化分型，早期是依据克罗诺杆菌的不同生理生化反应结果进行，主要的生理生化反应有：福格斯-普里斯考尔实验、甲基红反应、吲哚反应、鸟氨酸脱羧酶反应、乳糖产酸反应、硝酸盐（亚硝酸盐）的减少反应、D-葡萄糖的产气反应、丙二酸利用等[10]。目前最常见的生化分型方法是利用API20E生化鉴定系统，通过20 个不同的生理生化反应来确定克罗诺杆菌的生化表型。李磊等[11]利用API20E对分离自婴儿配方乳粉的野生克罗诺杆菌进行了生化分型，23 株克罗诺杆菌被分为了7 个生化型。LU Yan等[12]则利用API20E对75 株克罗诺杆菌进行了生化鉴定，并将其分成了8 个生化型。虽然API20E有一定的生化分型能力，但是辨识度很低。此外，API20E对克罗诺杆菌也具有一定鉴定能力，但是与基于16S rRNA的分子鉴定方法相比，API20E的鉴定方法可能导致假阳性的情况发生。
1.2 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分型
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一种用于鉴定食源性致病微生物的新兴技术，MS仪的高灵敏度及准确度使其非常适合应用于微生物化学分类的研究。它的原理在于通过电离待检微生物的表面蛋白质，得到电离离子的质核比（m/z），以离子的m/z为横坐标，离子峰强度为纵坐标形成质谱图，并将质谱图中的数据与数据库中的数据进行比对，确定最终的检测结果[13]。2014年，赵贵明等[14]建立了克罗诺杆菌MALDI-TOF MS数据库，并对135 株克罗诺杆菌进行MALDI-TOF MS分型，进而分析这些菌株与其来源的关系。LU Yan等[12]利用MALDI-TOF MS技术对分离自婴儿配方乳粉的克罗诺杆菌进行了蛋白分型，将被检的75 株克罗诺杆菌分为了36 个MALDI-TOF MS型，且全部鉴定为克罗诺杆菌。上述研究表明MALDI-TOF MS分型已经广泛地应用到了克罗诺杆菌的分型中，且具有较高的辨识度，此外MALDI-TOF MS分型对样品的纯度要求不高，且具有自动化程度高、快速高效等特点。
1.3 血清型分型
克罗诺杆菌的血清型分型是其表型分型的重要组成部分，克罗诺杆菌具有致病性，而脂多糖与克罗诺杆菌的毒素和特异性抗原有关，因此对克罗诺杆菌进行基于脂多糖和O-抗原的血清型分型显得尤为重要[15]。2011年，Jarvis等[16]利用限制性内切酶片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术对克罗诺杆菌进行了基于脂多糖的血清型分型，即检测目的DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，根据RFLP图谱之间的相似性对克罗诺杆菌进行血清型分型。2011年，SUN Yamin等[17]建立了基于O-抗原的血清型分型方法，即通过设计代表不同血型的特异性引物，利用多重扩增，根据扩增产物基因条带分子质量的大小确定克罗诺杆菌的血清型。2013年，Andrea等[18]利用多重扩增的方法对分离自瑞士婴儿配方乳粉厂的克罗诺杆菌进行了血清型分型，发现主要的血清型为阪崎克罗诺杆菌血清型O1和O2。相比RFLP技术，多重扩增的方法简便快捷、耗时短，但不能对未知的血清型进行分型[19]。
2.1 脉冲场凝胶电泳分型
脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）是传统的细菌分型方法之一，被称为细菌分型的金标准[20]。PFGE分型通常选用1～2 种限制性能内切酶（Xba Ⅰ和Sep Ⅰ）对克罗诺杆菌进行酶切，在交替变换的电场中对克罗诺杆菌的DNA片段进行分离，得到PFGE指纹图谱，最后通过聚类分析对克罗诺杆菌进行分型[21]。由于PFGE分型技术具有高度的辨识度，因此一直被作为重要的分型方法应用于克罗诺杆菌分型之中[22]。2014年，柴云雷等[23]利用PFGE技术对分离自婴儿配方乳粉的克罗诺杆菌进行了分型，将12 株克罗诺杆菌（包含2 株参考菌株）分为了11 个脉冲场型，可见PFGE分型技术的辨识度之高。同时，利用PFGE分型结果的相似性，可以对克罗诺杆菌进行溯源分析，即根据菌株的来源信息和图谱中条带分布的相似性，寻找该致病菌可能的来源，从而达到溯源的目的[12]。但PFGE分型也具有一定的局限性，并不是所有的克罗诺杆菌都能进行PFGE分型，如果基因组上不存在Xba Ⅰ或Sep Ⅰ的限制性内切酶位点，则不能进行PFGE分型[24-25]。此外，它虽然属于分子分型，但并不能反映克罗诺杆菌之间的系统发育关系，也不能起到鉴定的作用[26]。
2.2 多位点序列分型
多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是一种基于DNA序列的分子分型方法，它选择能反映全基因组系统发育关系的看家基因，对其进行特异性的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），并对扩增的产物进行基因测序，将得到的序列信息在数据库中进行比对，得到其序列型，完成微生物的分子分型，并能利用生物学信息软件进行系统发育分析。在克罗诺杆菌MLST方案中，7 个看家基因被选取，分别为：atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和ppsA[10]。克罗诺杆菌的MLST已经成为最为有效和普遍的分型方法之一，目前已经建立了克罗诺杆菌MLST数据库（http://www.pubmlst.org/cronobacter），其中包含1 000多株不同来源的克罗诺杆菌，并被分为400多个序列型，所有的研究者都可以通过克罗诺杆菌MLST数据库分享研究结果，并和其他研究者的研究结果进行比较[27]。
由于克罗诺杆菌MLST技术操作简便、辨识度较高，且具有高度的共享性，越来越多的研究者采用此项技术对克罗诺杆菌进行分型研究。由于MLST技术的优越性，自2009年此法建立之后，克罗诺杆菌分型的大量研究都采用此法。2012年，Joseph等[7]对美国50 年间的325 株克罗诺杆菌进行了遗传多样性分析，发现阪崎克罗诺杆菌序列型（sequence type，ST）4是主要的ST，且与新生儿脑膜炎的引发有关。2013年Andrea等[18]利用MLST技术对分离自瑞士婴儿配方乳粉厂的克罗诺杆菌进行分型研究，发现其主要的序列型为ST4和ST83，结合血清型分型的结果发现ST4和O-抗原血清型O2、ST83和O7有关。2014年，CUI Jinghua等[28]对我国境内分离自临床、婴儿食品和饮用水等的克罗诺杆菌进行分型研究，将105 株克罗诺杆菌分为71 个序列型。2015年，FEI Peng等[25]对分离自我国婴儿配方乳粉的克罗诺杆菌进行了MLST分型，将70 株克罗诺杆菌分为19 个序列型，并发现中国地区婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的优势序列型为ST4、ST1和ST64。可见，MLST已经广泛应用到了克罗诺杆菌的分型中，并被充分地认可。此外，由于MLST是基于核酸序列的分型，因此能够通过系统发育树的建立分析克罗诺杆菌间的遗传进化关系[27]。
2.3 随机多态性扩增DNA基因分型
随机多态性扩增DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）基因分型技术是在聚合酶的催化下，先利用随机引物对细菌基因组DNA扩增，再利用电泳对PCR产物片段分离，最后根据电泳图谱中每个泳带中DNA片段的浓度大小和位置等反映细菌的多态性[29]。2010年，研究者利用RAPD技术对克罗诺杆菌进行了分子分型研究，如果将阈值设为80%，则22 株供试克罗诺杆菌能被分为18 个RAPD型[30]。此外，有研究者利用RAPD技术对克罗诺杆菌进行了分子分型，筛选出了用于区分不同种的克罗诺杆菌的特异性引物，并在之后食品中克罗诺杆菌的研究中发现该方法的辨识度为99.9%。在50%阈值的情况下，通过生物信息学软件的分析将38 株克罗诺杆菌分为8 个簇[31]。RAPD方法具有较高的辨识度，但不能像MLST分型技术一样实现全球信息共享，也不能精确到每个碱基，而且引物的设计和反应条件会直接影响实验的结果，不利于实验结果的重复性[29]。
2.4 核糖体分型
核糖体分型方法可以用于大多数食源性致病菌的分型，但是非自动的核糖体分型操作复杂，重复性和稳定性较差，并且缺少标准化的方法、统一的命名和数据库，很难达到数据的共享[32]。因此RiboprinterTM基因指纹图谱分析技术应运而生，该技术以EcoRⅠ和PvuⅡ为标准内切酶，将细菌的细胞溶解并对DNA进行酶切，通过凝胶电泳将DNA酶切结果显示出来，最后对其图谱进行分析，由于这些步骤都是利用机器自动化操作，所有的标准都均一，因此可以排除其他外界因素的干扰，并可以利用BioNumefics数据库软件对图谱进行处理和分析，从而建立细菌的指纹图谱数据库[33]。裴晓燕等[34]利用核糖体分型对分离自食品的克罗诺杆菌进行了核糖体分型，30 株克罗诺杆菌被分为了26 个核糖体型，不同供试菌株之间的相似度在31.58%以上。RiboprinterTM基因指纹图谱分析的优点在于重复性和稳定性高，且可以建立数据，方便信息在实验室之间的共享，具有易操作、耗时短、结果易比较、人为误差少等优点，可以广泛应用于公共卫生事件的相似性查询和初步溯源等[35]。但是，此种方法对克罗诺杆菌的辨识度没有PFGE和MLST分型高。
2.5 特殊基因分型
一些特殊的基因也可以用于克罗诺杆菌的分型中，比如16S rRNA、内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）、rpoB、外膜蛋白A（outer membrane proteins，OmpA）基因ompA等。利用16S rRNA对克罗诺杆菌进行分析，既可以对其进行鉴定，也可以起到分型的作用[36]。ITS序列是操纵子上16S rDNA与23S rDNA间的一段间隔序列，可用于对克罗诺杆菌的分类鉴定[37]。上述两个基因不但能够用于克罗诺杆菌的鉴定，还能够在一定程度上用于对该致病菌进行分型，但是由于两个基因所携带的遗传信息不多，因此基于上述基因的分型方法辨识度并不高。rpoB基因是细菌RNA聚合酶β亚基的编码基因，大量的研究表明可以利用此基因对克罗诺杆菌进行鉴定和分型[38-39]。在病原体黏附和侵入宿主的过程中，OmpA起至关重要的作用，可通过胞移作用使克罗诺杆菌穿过肠上皮细胞[40-41]，因此对克罗诺杆菌进行ompA基因的分型可以为其致病能力及致病机理的研究提供理论基础。FEI Peng等[25]利用rpoB和ompA两个基因对克罗诺杆菌进行了分型研究，结果证明了利用这两类基因对克罗诺杆菌进行分型的可行性。综上，利用特殊基因可以对克罗诺杆菌进行分型，并可结合特殊基因的功能性挖掘更多的信息，但是这种方法的辨识度不高，不能用于进行溯源研究。
2.6 全基因组分型
全基因组测序是对未知基因组序列的物种进行个体的基因组测序。目前，最为成熟的全基因组测序技术是二代测序即高通量测序技术。与一代测序相比，二代测序不仅能够保证测序结果具有较高的准确性，而且测序成本也明显低于一代测序[42]。一些研究学者已经利用二代测序技术对克罗诺杆菌的分离株或模式株进行了测序。YAN Qiongqiong等[43]利用二代测序技术对持续出现在婴儿配方乳粉工厂设备环境中的一株阪崎克罗诺杆菌（C. sakazakii SP291）进行了全基因组测序分析，得到了该株致病菌基因组的生物信息学数据，为增加对新生儿克罗诺杆菌感染的理解和洞察与环境持久性相关的功能基因提供了帮助。Grim等[44]利用二代测序技术对克罗诺杆菌属进行了pan基因和核心基因分析，揭示了该属不同种之间清晰的系统发育关系，并阐明了克罗诺杆菌与分离植物的环境相关性。CAI Liping等[45]则利用二代测序技术揭示了阪崎克罗诺杆菌酰基转移酶的基因编码序列。全基因组测序技术是最为理想的分子分型方法，它以细菌的整个基因组为研究对象，对基因组中的全部基因进行测序，测定其DNA的碱基序列，从而获得更为丰富的生物学信息。全基因组测序是研究克罗诺杆菌分型最有效的方法，并可以对该致病菌进行精确的溯源，但这项技术耗时长、成本高，较难普及[29]。
对克罗诺杆菌进行分型研究可以增加对克罗诺杆菌的了解，并能为克罗诺杆菌的深层研究提供理论基础。上述的几种分型方法是近些年来常见的分型手段，其中生化分型、MALDI-TOF MS分型和血清型分型属于克罗诺杆菌的表型分型。相比API20E和血清型分型，MALDI-TOF MS分型具有较高的辨识度，其中API20E和MALDI-TOF MS均具有较高的鉴定能力，但是血清型分型不能达到鉴定的效果。克罗诺杆菌分子分型的方法较多，其中PFGE分型应用最为广泛，主要用于克罗诺杆菌等食源性致病菌的分型、溯源及临床研究[16]。虽然PFGE具有较高的分型辨识度，但不能反映克罗诺杆菌间的系统发育关系，也无法起到鉴定的作用，因此需要其他的方法进行辅助。MLST分型不仅有较高的辨识度，而且能够用于进行系统发育关系的研究，并且在7 个看家基因中，可以利用fusA基因对克罗诺杆菌进行鉴定[5]。一些特殊基因的分型可以帮助我们对克罗诺杆菌一些功能性基因进行了解，从而为相关研究提供理论基础。此外，克罗诺杆菌的全基因组分析从整个基因组的层面对克罗诺杆菌进行生物信息挖掘，得到更多的生物学信息，可以更全面地解决克罗诺杆菌的遗传进化问题，但资金花费较大。综上所述，一些辨识度较高的分型方法，如MALDI-TOF MS分型、PFGE分型、MLST分型和全基因组分型等方法可以用于克罗诺杆菌的溯源研究，并具有较高的稳定性，可以帮助我们找到克罗诺杆菌的污染源，减少克罗诺杆菌对婴儿配方乳粉及其他婴儿食品的污染，从而及时对克罗诺杆菌能引起的疾病进行防控。
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Progress in Typing Methods for Cronobacter spp.
FEI Peng1, YANG Tongxiang1, JIANG Yichao2, CHEN Junliang1, LUO Lei1, REN Guangyue1, KANG Huaibin1,*, Stephen James FORSYTHE3,*
(1. College of Food and Biological Engineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;2. Changbai Mountain Food and Drug Inspection Testing Center, Baishan 134500, China;3. Pathogen Research Centre, Nottingham Trent University, Nottingham NG11 8NS, United Kingdom)
Abstract:Cronobacter spp., which was formerly defined as Enterobacter sakazakii, is one of the main pathogenic bacteria that easily contaminates powdered infant formula (PIF) and can infect newborns and cause severe necrotizing enterocolitis,bacteremia and meningitis, with a high mortality rate of 40%-80%. This article reviews the commonly used methods for the phenotypic and molecular typing of Cronobacter spp. including biotyping, matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, serological typing, pulsed field gel electrophoresis, multilocus sequence typing, random amplification of polymorphic DNA, ribotyping, special genotyping and whole-genome typing with the aim of providing a better understanding of these methods, which will offer a basis for revealing the phenotypic characteristics and genetic diversity of Cronobacter spp..
Key words:Cronobacter spp.; phenotyping; molecular typing; typing methods
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721048
中图分类号：TS252.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）21-0308-05
引文格式：费鹏, 杨同香, 姜亦超, 等. 克罗诺杆菌分型技术研究进展[J]. 食品科学, 2017, 38(21): 308-312.
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201721048. http://www.spkx.net.cn
FEI Peng, YANG Tongxiang, JIANG Yichao, et al. Progress in typing methods for Cronobacter spp.[J]. Food Science, 2017,38(21): 308-312. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721048. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-08-16
基金项目：河南科技大学博士科研启动基金项目（13480066）；河南科技大学青年科学基金项目（2015QN038）
作者简介：费鹏（1986—），女，讲师，博士，研究方向为乳品科学。E-mail：736422337@qq.com
*通信作者：康怀彬（1963—），男，教授，硕士，研究方向为畜产品加工。E-mail：khbin001@163.com Stephen James Forsythe（1958—），男，教授，博士，研究方向为致病菌微生物及遗传多样性。E-mail：stephen.forsythe@ntu.ac.uk