番茄NF-Y转录因子生物信息学分析及其与RIN共同调控果实成熟研究

李 珊，许蕙金兰，朱本忠，罗云波*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

摘 要：运用生物信息学分析方法，对番茄NF-Y家族59 个成员的结构域和进化关系进行分析，并比较番茄NF-Y基因在番茄野生型AC及rin突变体果实成熟过程中的表达量变化，结合转录因子RIN对NF-Y基因DNA的结合能力，分析其可能的互作关系。研究结果为阐述番茄NF-Y转录因子与RIN共同调控果实成熟的功能提供理论依据。

关键词：番茄果实；NF-Y；RIN；生物信息学分析

果实成熟是一个复杂的动态过程，涉及果实质构、色泽和风味物质等变化[1]。在这个过程中，许多因子通过调控成熟相关基因的表达，从而发挥了对果实成熟过程的重要调控作用。其中，相关转录因子就是其中很重要的一类调控因子[2]。目前，已经有许多家族的转录因子被研究发现参与了果实的成熟调控过程，如M ADS-box、M YB、AP2/ERF以及SBP/SPL等[2]。在众多转录因子家族中，MADS-box转录因子RIN是果实成熟的关键调控因子之一，因为在RIN转录因子功能缺失的番茄rin突变体中，许多成熟相关的途径受到影响，比如果实乙烯合成受到抑制、果实不能正常软化，以及色泽的形成受到影响，果实的成熟过程无法正常启动，最终导致果实严重不成熟的表型[3-4]。近些年的研究发现，转录因子RIN通过调控许多成熟相关的基因影响果实的成熟进程，比如成熟相关的转录因子基因，包括NOR、HB1、CNR和TDR4等[3]；乙烯合成与代谢相关的基因，包括ACS2、ACS4等[5]；果实细胞壁代谢相关的基因，包括PG2a和EXP1等[3]；果实成熟色素积累相关的基因，比如PSY1等[3,6]；以及果实成熟香气物质形成的相关基因，包括LoxC和ADH 2等[6-7]。此外，RIN转录因子能够与FUL1、FUL2、M ADS1和TAGL1形成异源四聚体，发挥对果实成熟过程的调控作用[3,8-10]。由此可见，RIN转录因子是果实成熟过程中的核心调控因子。

此外，番茄NF-Y转录因子是近年来被发现参与果实成熟的一类家族，较早的研究认为NF-Y主要参与植物生长发育、生物与非生物胁迫相关的途径[11]。研究发现，番茄中存在59 个NF-Y基因，通过表达分析，有13 个NF-Y基因在果实成熟过程中表达量较高，运用病毒诱导基因沉默技术[12]，沉默其中5 个较高表达的NF-Y基因会影响果实成熟表型[13]。由此可见，NF-Y在番茄果实成熟过程中发挥了重要作用，那么NF-Y是否与果实成熟核心调控因子RIN协同调控果实的成熟过程，暂未发现有相关的研究。

综上，为明确番茄NF-Y与RIN转录因子在调控果实的成熟过程中是否存在联系，本研究利用数据库中番茄NF-Y的相关信息，通过生物信息学方法分析番茄NF-Y基因与果实成熟以及与RIN基因表达模式的相关性，并结合RIN转录因子对NF-Y基因DNA的结合分析，阐述NF-Y转录因子在果实成熟过程及其与RIN共同调控果实成熟过程中发挥的重要作用，为进一步研究NF-Y基因的生物学功能提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 植物中NF-Y基因的鉴定

番茄（So la n um ly c o p e rs ic um）和拟南芥（Arabidopsis thaliala）的NF-Y基因信息来源于植物转录因子数据库PlantTFDB database v3.0（http://planttfdb.cbi.edu.cn/）[14]。番茄的基因注释信息来源于茄科基因组数据库Sol Genom ics Network（SGN，ftp://ftp.solgenom ics.net/genomes/Solanum_lycopersicum/annotation/ITAG2.4_release/）。

1.2 番茄NF-Y蛋白结构域与进化分析

番茄和拟南芥NF-Y氨基酸序列源于Plan tTFDB database v3.0（http://planttfdb.cbi.edu.cn/）[14]。运用Vector NTI Advance 14 11.5.1软件（Invitrogen）进行氨基酸序列分析，选用Clustal X 2.1和MEGA 4.0软件进行氨基酸序列聚类和进化分析，采用邻接法构建系统进化树，用1 000 次Bootstrap进行检验[15-16]。

1.3 番茄果实NF-Y基因的表达模式及受到RIN结合的分析

番茄NF-Y基因在果实成熟不同时期，包括花后17、39、42 d及52 d，以及野生型AC和突变体rin果实破色时期的表达量数据来自转录组数据[17]。所有的表达值中，剔除Reads Per Kilobase per M illion mapped reads（RPKM）值为零的基因，并运用R软件（http://www.r-project.org/）进行表达值热图的绘制。RIN转录因子对NF-Y基因DNA的结合数据来源于染色质免疫共沉淀-测序（ChIP-Seq）数据[17]。

2 结果与分析

2.1 番茄NF-Y因子的鉴定

通过植物转录因子数据库PlantTFDB database v3.0（http://p lanttfdb.cbi.edu.cn/）获得59 个番茄NF-Y基因的信息，根据其具有的亚基进行分类，包括10 个NF-YA、29 个NF-YB和20 个NF-YC，见表1。番茄NF-Y基因编码的氨基酸长度具有差异，如NF-YA基因编码的氨基酸长度为154～325个，NF-YB基因编码的氨基酸长度为86～357 个，而NF-YC基因编码的氨基酸长度为93～677 个。番茄NF-Y基因编码的蛋白理论等电点也具有明显的差异，如NF-YA蛋白预测等电点均大于7.0，为酸性氨基酸；NF-YB蛋白的预测等电点范围为4.18～9.61，包括25 个酸性氨基酸和4 个碱性氨基酸，其中编码NF-YB3的3 个不同基因编码的蛋白，酸碱性存在明显差异，具有NF-YB亚基的13 个NF-YB6蛋白中，有11 个为酸性氨基酸，另2 个为碱性氨基酸；而NF-YC蛋白的预测等电点范围为4.05～10.94，包括14 个酸性氨基酸和6 个碱性氨基酸，其中4 个NF-YC1和8 个NF-YC4具有酸碱性差异的氨基酸。通过等电点的分析，可以预知番茄不同NF-Y蛋白在不同酸碱环境中的稳定性，从而进行更进一步的功能分析。

表1 番茄NF-Y转录因子的分类及基本特征
Table 1 Classifi cation and characteristics of NF-Y genes in tomato

注：表中基因名称与茄科基因组数据库The So l Genom ics Netw ork（solgenomics.net）一致。

2.2 番茄NF-Y氨基酸序列比对及进化分析

图1 番茄和拟南芥NF-Y氨基酸序列比对
Fig. 1 Am ino acid sequence alignment of tomato and Arabidopsis NF-Y domains

由于拟南芥中NF-Y因子的功能研究得较为透彻，因此将番茄的59 个NF-Y因子与拟南芥的NF-Y家族进行多重序列比对进而进行功能域的分析（图1）。拟南芥NF-Y家族是由10 个A tNF-YA、13 个A tNF-YB和14 个A tNF-YC组成。根据NF-Y亚基的不同，包括NF-YA、NF-YB和NF-YC，分别进行多重氨基酸的序列比对，每个亚家族都有一个或多个核心区域，具有明显的同源结构域，据文献报道，这些保守的结构域与亚基之间的联系，以及对DNA的结合起到很重要的作用[18-20]，见图1中加以强调标注的部分。此外，运用番茄和拟南芥NF-Y全长的氨基酸序列，基于不同的NF-Y亚基，构建了无根的进化树，通过进化分析对番茄中相应的NF-Y进行功能预测，见图2。

番茄和拟南芥的NF-YA蛋白都具有两个典型的保守结构域（图1），根据已有研究表明，在动物和酵母中，第一个结构域包含有20 个保守的氨基酸，该结构域能够与NF-YB或者NF-YC发生结合，另一个结构域包含21 个氨基酸，则能够特异性的识别靶基因DNA序列上的CCAAT元件[21]。而在保守的结构域以外，氨基酸的保守性很低。但是，NF-YA氨基酸序列富含谷氨酰胺和丝氨酸/苏氨酸残基，据研究其与增强转录激活作用紧密相关。

番茄和拟南芥NF-YB蛋白具有一段多于90 个氨基酸的保守域，该结构域能够与NF-YC以及NF-YA亚基发生作用，同时起到结合DNA的功能（图1）。在保守域以外番茄NF-YB因子的氨基酸长度以及氨基酸的种类差异较大。基于进化分析，可以预测进化树同一分支中蛋白的功能。比如拟南芥A tNF-YB，又名为LEC1-LIKE（L1L），是调控胚胎发育的关键因子，编码该蛋白的基因在发育的胚胎中具有明显的富集[22]。类似地，番茄中L1L的同源基因，包括L1L1～L1L13，在种子和发育的果实中，具有相类似的表达模式，因此可以预测其可能具有类似的功能[23]（图2）。

番茄和拟南芥NF-YC亚家族具有一个近80 个氨基酸的保守域（图1），已有研究表明，该结构域参与靶基因DNA的结合，以及与其他NF-Y因子的互作中起关键作用。这种机制存在于植物拟南芥[24]、二穗短柄草[25]以及其他植物[26]中。此外，在酵母和真菌中发现，绝大多数NF-YC蛋白具有含量较高的谷氨酰胺残基，能够作用于增强转录激活[27-28]。

2.3 番茄NF-Y基因在果实成熟过程中的表达

图2 番茄和拟南芥NF-Y进化树
Fig. 2 Phylogenetic relationships based on am ino acid sequence sim ilarity of NF-Y in tomato and Arabidopsis

图3 番茄NF-Y基因在果实成熟不同时期的表达量热图
Fig. 3 Heat map of NF-Y expression in tomato during various ripening stages

番茄果实的转录组数据（RNA-Seq）已公开发表[17]，本研究选用自花后17、39、42 d及52 d的番茄果实转录组数据，分别对应于果实未熟、绿熟、破色以及红熟期的基因表达情况，着重关注番茄NF-Y基因的表达模式，剔除基因表达RPKM值在4 个时期均为零的基因，并对其余45 个NF-Y基因进行表达量的可视化，并构建了表达模式聚类图，如图3所示。结果表明，有21 个NF-Y基因的表达与成熟过程相关，包括7 个NF-YA、7 个NF-YB以及7 个NF-YC。具体如下：

番茄NF-YA基因表达与成熟相关的7 个基因中，3 个基因在成熟过程具有明显的上调表达，包括Solyc12g009050、So lyc01g008490和So lyc11g065700，因此这3 个基因表达模式与成熟过程呈正相关；3 个基因在成熟过程中呈现波动趋势，包括Solyc01g006930、Solyc01g087240和Solyc08g062210，在果实未熟期表达相对较低，果实成熟过程开始时表达显著上调，之后会出现下调的趋势，因此，这3个基因可能只在成熟的不同时期起不同的作用；研究表明，沉默Solyc01g087240和So lyc08g062210、So lyc11g065700基因会导致果实呈现黄色，对果实的成熟起到抑制作用[13]；此外，Solyc02g069860在观测的4 个时期表达量较高切呈现稳定趋势，表明该基因可能影响果实发育和成熟的整个过程。

番茄NF-YB基因表达与成熟相关的7 个基因中，只有1 个基因的表达模式与成熟过程呈现明显的正相关，即Solyc09g007290基因；有2 个基因，包括Solyc11g068480和Solyc07g065500的表达模式与成熟过程呈负相关，研究表明，沉默Solyc07g065500会促进果实变红，证实了其是果实成熟抑制子的作用模式[13]；另有2个基因，包括So lyc03g114400和So lyc04g049910，在观测的4 个时期表达量较高且呈现稳定趋势，表明该基因可能具有果实发育和成熟的全局作用模式；而Solyc12g006120和Solyc06g069310基因，在果实成熟过程中表达情况呈现波动情况，研究表明沉默Solyc06g069310会抑制果实成熟，表明该基因至少在成熟的某个时期起促进作用。

番茄NF-YC基因表达与成熟相关的7 个基因中，有4 个基因的表达模式与成熟过程呈正相关，包括Solyc11g072150、So lyc03g110860、Solyc01g096710和So lyc01g079870；有2 个基因的表达模式与成熟过程呈负相关，包括So lyc02g091030和Solyc06g072040；而Solyc06g016750基因的表达则在成熟过程中呈现波动，可能在成熟不同时期具有不同的作用模式。

2.4 番茄NF-Y基因与成熟重要转录因子RIN的联系

通过上述分析发现，番茄NF-Y基因在果实的成熟过程中起到重要的作用[13]。众所周知，转录因子RIN是果实成熟的关键调控因子，因为RIN能够调控许多成熟相关的基因影响果实的成熟进程，包括成熟相关的转录因子基因、乙烯合成与代谢相关的基因、果实细胞壁代谢相关的基因、果实成熟色素积累相关的基因，以及果实成熟香气物质形成的相关基因等[3,5-7]。因此，本研究进一步对番茄NF-Y与RIN转录因子在调控果实的成熟过程中的联系进行了分析。

如图4所示，选用野生型AC和突变体rin果实破色时期的表达量数据[17]，着重关注番茄NF-Y基因的表达模式，剔除基因表达RPKM值为零的基因，并对余下30 个NF-Y基因进行表达量的可视化，并构建了表达模式聚类图。结果表明，其中有6个NF-Y基因在野生型AC和突变体rin果实中RPKM值较高（RPKM＞10），且表达倍数差异较高（1.5 倍）。这些差异基因包括4 个NF-YA基因，分别为Solyc02g069860、Solyc01g006930、Solyc08g062210和Solyc01g087240，这4 个基因在突变突变体rin果实中的表达高于野生型AC果实，表明其与RIN基因的表达情况呈负相关，此外So lyc08g062210和Solyc01g087240在成熟过程中表达趋势是波动的，并且分别沉默这2个基因，会抑制果实的成熟过程[13]，因此可以推测，这2个NF-YA基因至少在花后42 d的时期，与转录因子RIN并不存在直接的调控关系。

图4 番茄NF-Y基因在野生型AC和突变体rin果实中的表达量热图
Fig. 4 Heat map of tomato NF-Y expression in wild-type AC and rin mutant fruits

在野生型AC和突变体rin果实中RPKM值较高（RPKM＞10），且表达倍数差异较高（1.5 倍）的另两个基因分别为1 个NF-YB即Solyc11g068480、1 个NF-YC即Solyc02g091030基因，其中Solyc11g068480与RIN基因的表达情况呈正相关，而Solyc02g091030与RIN基因的表达情况呈负相关。

为进一步明确转录因子RIN与NF-Y在成熟过程中的联系，本研究分析了RIN转录因子对NF-Y基因DNA的结合数据[17]，数据基于染色质免疫共沉淀-测序（Ch IPSeq）技术，挖掘的基因信息表明转录因子与靶DNA序列的物理结合情况。如表2所示，转录因子RIN对4 个NF-Y基因具有直接结合能力，包括3 个NF-YA，即Solyc10g079150、Solyc10g081840和Solyc12g009050，以及1 个NF-YC，即Solyc03g111460。其中，属于NF-YA家族的Solyc12g009050基因，其表达模式与成熟过程呈正相关（图3），并且与RIN基因表达模式呈正相关（图4），因此转录因子RIN可能调控该基因的表达。而RIN对其具体的调控模式，则可以通过反式调控能力分析获知，即将Solyc12g009050基因的启动子克隆到LUC（萤火虫荧光素酶）基因与35S启动子连REN（海肾荧光素酶）的双元荧光报告体系中，通过超表达RIN蛋白，获知其对靶基因的激活或抑制的调控模式，该体系已被广泛应用于转录因子的调控模式分析[29-30]。

表2 转录因子RIN对番茄NF-Y的结合位点富集分析
Table 2 Binding peaks of RIN to tomato NF-Y genes

注：+.与染色体测序方向一致；-.与染色体测序方向不一致。

3 结 论

番茄中含有59 个NF-Y基因，包括10 个NF-YA、29 个NF-YB和20 个NF-YC。番茄NF-Y基因编码的氨基酸长度差异明显，但具有明显的保守结构域。通过与拟南芥NF-Y因子的进化分析，番茄NF-Y与之同源的因子具有相似的功能，因此保守性较强。根据番茄NF-Y基因在果实成熟过程中的表达模式分析，表明不同的NF-Y因子在成熟过程中的作用可能存在差异，这与文献报道的沉默番茄中不同的NF-Y基因会获得不同的表型是一致的[13]，证实番茄NF-Y因子对果实成熟其重要的调控作用。通过分析番茄NF-Y基因与RIN基因的表达模式，以及转录因子RIN对NF-Y基因DNA的结合能力，结果表明转录因子RIN可能能够直接调控NF-YA家族Solyc12g009050基因的表达，但具体的反式调控模式则有待进一步的实验分析，而对其他NF-Y基因的影响也有待更进一步的明确。

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Bioinformatics Analysis of Tomato Nuclear Factor Y (NF-Y) Transcription Factors and Their Relationship w ith Ripening Inhibitor (RIN) in Co-Regulating Fruit Ripening

LI Shan, XU Huijinlan, ZHU Benzhong, LUO Yunbo*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Abstract:In this study, am ino acid motifs and evolutionary relationship of 59 tomato nuclear transcription factor Y (NF-Y)members were analyzed using bioinformatics approaches. Furthermore, changes in the expression pattern of tomato NF-Y genes in the w ild-type AC and ripening inhibitor (rin) mutant were investigated during fruit ripening. On the basis of the NF-Y gene binding capacity of the transcription factor RIN, their co-regulation on tomato fruit ripening was elucidated.

Key words:tomato fruit; NF-Y; RIN; bioinformatics analysis

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722001

中图分类号：TS255.3

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2017）22-0001-07

引文格式：

李珊, 许蕙金兰, 朱本忠, 等. 番茄NF-Y转录因子生物信息学分析及其与RIN共同调控果实成熟研究[J]. 食品科学,2017, 38(22): 1-7. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722001. http://www.spkx.net.cn

LI Shan, XU Huijinlan, ZHU Benzhong, et al. Bioinformatics analysis of tomato nuclear factor Y (NF-Y) transcription factors and their relationship w ith ripening inhibitor (RIN) in co-regulating fruit ripening[J]. Food Science, 2017, 38(22): 1-7.(in Chinese w ith English abstract)

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201722001. http://www.spkx.net.cn

收稿日期：2017-04-11

基金项目：国家自然科学基金面上项目（31571894；31271959）

作者简介：李珊（1988—），女，博士研究生，研究方向为果蔬采后生理分子生物学。E-mail：419584434@qq.com

*通信作者：罗云波（1958—），男，教授，博士，研究方向为果蔬采后生理和分子生物学。E-mail：lyb@cau.edu.cn