表1 六堡茶样品信息
Tab le 1 In formation about Liubao tea sam p les
穆 兵1,2，朱 荫1，马士成3,4，张 悦1，曹中环3,4，于翠平3,4，林 智1,*，吕海鹏1,*
（1.农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.梧州市六堡茶研究院，广西 梧州 543000；4.梧州市农业科学研究所，广西 梧州 543000）
摘 要：采用全二维气相色谱-飞行时间质谱联用技术，分析一批代表性六堡茶样品中香气成分的组成及其相对含量。结果表明，此批六堡茶样品中共鉴定出307 种共有香气成分，根据化学结构的差异可分为烯醇类（7 种）、烯类（23 种）、胺类（5 种）、烷烃类（20 种）、醛类（14 种）、烯醛类（14 种）、醚类（22 种）、醇类（7 种）、酯类（10 种）、内酯类（7 种）、烯酯类（5 种）、烯酮类（30 种）、酮类（49 种）、酚类（5 种）、有机酸类（11 种）、含硫化合物（5 种）、氮杂环化合物（20 种）、氧杂环化合物（7 种）、芳香烃化合物（40 种）、炔类（3 种）以及酸酐类（3 种），共21 类化合物；研究发现，六堡茶的香气成分以有机酸类、芳香烃化合物、醚类以及醛类为主，相对含量可分别达到16.55%、13.50%、10.92%以及10.04%。有54 种香气成分的相对含量不小于0.5%，其中，棕榈酸（14.95%）、苯甲醛（3.03%）、芳樟醇（2.19%）以及（E,E）-2,4-庚二烯醛（2.04%）等是六堡茶中相对含量较丰富的香气成分。特征性香气成分分析表明，有机酸类（棕榈酸等）、芳香烃类（乙苯等）、醚类（1,2,3-三甲氧基苯、2-萘甲醚等）、醛类（苯甲醛、3-甲基丁醛等）以及烯酮类（α-紫罗兰酮等）等香气成分可能对六堡茶的香气品质产生重要影响。
关键词：六堡茶；全二维气相色谱-飞行时间质谱；香气成分；香气特征
六堡茶属于黑茶，原产于广西省梧州市苍梧县六堡乡，是以采摘当地群体品种一芽二、三叶或一芽三、四叶茶鲜叶为原料，历经杀青、揉捻、沤堆、复揉、干燥五道工序而制成[1]，于2011年获准地理标志产品保护[2]。六堡茶历史悠久，是我国传统历史名茶之一，在香气品质上以其独特的陈香、金花香、槟榔香等[3]而为广大消费者所青睐。
香气是决定茶叶风味品质的关键因素之一，其实质是不同芳香物质以不同浓度组合，对人类嗅觉神经综合作用而形成茶叶不同香型的结果[4]。随着分析检测技术的不断发展，气相色谱（gas chromatography，GC）技术、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术以及全二维气相色谱-飞行时间质谱（comprehensive two-dimensional gas chromatography-timeof-fl ight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）技术等在茶叶香气研究中先后得以应用，极大促进了茶叶香气品质化学的研究进展。迄今为止，至少已经从各种茶类中分离鉴定出700多种香气物质[5]，主要包括醇类、醛类、酮类、酯类、酸类、酚类、杂环化合物等十余大类化合物[6]。然而，关于六堡茶香气成分的研究目前仅有少量的报道，大部分主要是采用GC或GC-MS对六堡茶的香气成分进行了研究。陈文品等[7]对传统农家六堡茶和精制六堡茶的挥发性香气组分等理化性质进行了分析对比研究，发现组分的差异构成了两者不同的香型；刘泽森等[8]在槟榔香六堡茶的特征性香气成分研究中鉴定出66 种成分，认为雪松醇是最重要的香气物质；此外，吴颖瑞等[9]也对六堡茶树花的香气成分进行分析。
随着茶叶香气品质化学研究的不断深入，GC和GC-MS在茶叶香气成分研究上的局限性也逐渐地暴露出来，如灵敏度较低、峰容量有限、检测成分较少等。GC×GC-TOFMS在茶叶香气成分研究上的应用弥补了这一缺点，它是在传统GC技术上发展而来的一种具有高灵敏度、高峰容量、高分辨率等优点的新型检测技术，近些年来已经在食品[10-11]、植物香气化学[12-15]等领域取得了良好的分析效果。例如，在茶叶香气研究方面，Zhu Yin等[16]采用该技术研究了西湖龙井茶的香气成分，鉴定出522 种共性香气成分，并通过特征性香气成分分析表明，烯醇、醛、醇、酯以及芳香烃化合物是西湖龙井茶优异香气品质的主要化学物质；此外，程权等[17]采用该技术，分析得到闽南乌龙茶中的51 种共有挥发性成分，并通过主成分分析法和建立判别模型，证实了以挥发性成分识别闽南乌龙茶的可行性。
由此可见，GC×GC-TOFMS在茶叶香气研究上具有十分强大的优势；然而，目前关于六堡茶香气成分的系统研究十分欠缺，在很大程度上限制了人们对六堡茶香气品质的科学评价。因此，本研究拟根据GB/T 234776—2009《茶叶感官审评方法》[18]，委托农业部茶叶质量监督检验测试中心进行感官审评，选用有代表性的六堡茶作为研究对象，采用GC×GC-TOFMS对其香气成分进行研究，旨在进一步揭示六堡茶中香气成分的组成及其含量水平，为阐明六堡茶香气品质的化学物质基础以及促进六堡茶产业的健康可持续发展提供一定的科学依据。
1.1 材料与试剂
六堡茶样品（散茶）6 个，样品信息及香气感官审评结果如表1所示，由梧州市农业科学研究所、梧州市六堡茶研究院提供。
表1 六堡茶样品信息
Tab le 1 In formation about Liubao tea sam p les
无水乙醚（分析纯） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水硫酸钠（分析纯） 上海试四赫维化工有限公司。
1.2 仪器与设备
HH-1数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司；TC-15恒温电热套 海宁市华星仪器厂； AB104-S电子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集团；Pegasus 4D GC×GC-TOFMS仪 美国LECO公司。
1.3 方法
1.3.1 样品的制备
本研究采用同时蒸馏萃取法[19]提取六堡茶样品的香气成分。具体步骤：称取待测六堡茶样品10.00 g，置于500 m L圆底烧瓶中并加入300 m L沸蒸馏水，用电热套加热至微沸。将30 m L重蒸无水乙醚加入萃取瓶中，在50 ℃水浴条件下蒸馏萃取1 h，并将获得的物质用无水硫酸钠去除水分，氮气浓缩后放入进样瓶内-20 ℃密封保存、待测。
1.3.2 GC×GC-TOFMS分析条件
一维柱色谱柱：DB-5M S（30 m×250 μm，0.25 μm）；二维柱色谱柱：DB-17HT（1.9 m×100 μm，0.10 μm）；进样口及传输线温度280 ℃和270 ℃；载气为氦气；不分流进样；调制解调时间间隔4.0 s；样品进样量1.0 μL。一维柱升温程序：60 ℃保持3.0 m in，以4.0 ℃/m in速率升至280 ℃，保持2.5 m in；二维柱升温程序：65 ℃保持3.0 m in，以4.0 ℃/m in速率升至285 ℃，保持2.5 m in；总分析时间60.5 min。
质谱条件：电子电离源；电离能量-70 eV；质量扫描范围33～600 u；离子源温度220 ℃。
香气成分的定量方法：采用相对含量，即各个化合物的相对含量由分离出的各个化合物的峰面积与总峰面积间的比值计算得出。
1.4 数据处理
数据处理软件：ChromaTOF软件系统；数据处理流程：根据参考文献[16]进行数据处理。
2.1 六堡茶样品香气成分的GC×GC-TOFMS分析
参考文献[20-24]报道的分析条件及依据GC×GCTOFM S的基本原则，对六堡茶中香气成分的GC×GCTOFMS分析方法进行了优化，图1为六堡茶样品的3D色谱图。
图1 六堡茶香气成分的3D色谱图
Fig. 1 3D chromatograms of aroma components in Liubao tea samp le
图2 六堡茶香气成分中化合物种类的分布（A）和相对含量（B）
Fig. 2 Contents of the various classes of aroma components in Liubao tea samples
通过Pegasus 4D工作站质谱库的自动检索，在六堡茶的香气成分中共分离出上千个样品峰。通过相似度、保留时间及手动对比分析，分别从6 个代表性六堡茶样品中鉴定出了520余种香气成分。经综合筛选后确定出了六堡茶中的307 个共有香气组分。根据它们化学结构的差异，可将其分为21 类，如图2A所示，分别是烯醇类、烯类、胺类、烷烃类、醛类、烯醛类、醚类、醇类、酯类、内酯类、烯酯类、烯酮类、酮类、酚类、酸类、含硫化合物、氮杂环化合物、氧杂环化合物、芳香烃化合物、炔类及酸酐类。由图2A可见，六堡茶香气成分的化合物种类中，酮类化合物的数量最多，为49 种，芳香烃化合物、烯酮类化合物分别以40 种和30 种次之，炔类化合物和酸酐类化合物最少，只有3 种。
如图2B所示，有机酸类化合物是六堡茶香气成分中相对含量最丰富的化合物种类（以16.55%的相对含量在总的香气成分中占到了最大的比例），芳香烃化合物（13.50%）次之；此外，醚类化合物（10.92%）、醛类化合物（10.04%）、烯酮类化合物（9.13%）以及酮类化合物（8.25%）的相对含量也较为丰富。炔类化合物和酸酐类化合物的相对含量水平最低（分别只有0.04%和0.15%）。
2.2 六堡茶的香气成分分析
6 个代表性六堡茶样品中共有的香气成分及其相对含量水平如表2所示。
表2 六堡茶GC×GC-TOFMS分析鉴定出的香气化合物
Tab le 2 List of aroma com pounds in Liubao tea sam p les identified by GC ×GC-TOFMS analysis
续表2
续表2
续表2
续表2
续表2
有机酸化合物类是六堡茶香气成分中相对含量最高的一类化合物。从表2可以看出，虽然有机酸类相对含量很高，但最主要是棕榈酸，达14.95%，相对含量要明显高于其他有机酸，也被认为是黑茶中最丰富的香气成分之一[25]。芳香烃类由40 种化合物构成，无论是物质种类还是相对含量均在六堡茶香气成分中较高，其中菲、乙苯、萘、1,3-二甲基苯、α-甲基萘等相对含量较高。醚类在六堡茶香气成分中相对含量仅次于有机酸类和芳香烃类，其中2-乙氧基丁烷、具有花香的2-萘甲醚、具有陈味的1,2,3-三甲氧基苯等相对含量都比较高。醛类化合物的相对含量和醚类比较接近，具有较好香气的苯甲醛、苯乙醛等芳香醛的相对含量也比较高。烯酮类化合物种类较多，其中2-甲基-2-庚烯-4-酮、异佛尔酮、4-（2,2,6-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]-1-庚基）-3-丁烯-2-酮、反-β-紫罗兰酮以及α-紫罗兰酮相对含量较高。而酮类化合物是六堡茶香气成分中种类最多的一类化合物，但是除2,3-二氢-4,7-二甲基-1H-茚-1-酮、苯乙酮、顺-六氢-8a-甲基-1,8（2H,5H）-萘二酮、1-苊酮和植酮外，其他酮类化合物的相对含量不高，均低于0.5%。
在20 种烷烃类化合物中，十一烷、1,1,3-三甲基-2-（3-甲基戊基）环己烷、十二烷、正己烷、十三烷和二十七烷的相对含量较高。烯醛类化合物有14 种，只有（E,E）-2,4-庚二烯醛、（E,E）-2,4-己二烯醛的相对含量相对较高。氮杂环化合物也有20 种，其中吡啶、吲哚、咖啡因的相对含量较高。芳樟醇作为7 个烯醇类化合物中相对含量最丰富的化合物，同时也是茶叶中相对含量较高的香气物质之一[4]。酯类化合物有10 种，十六烷酸丁基酯和乙酸异丙烯酯是其中相对含量较高的化合物。而醇类化合物中相对含量较高的化合物只有α-萜品醇。二苯并呋喃、2-戊基呋喃在氧杂环化合物中的相对含量较高。在以上相对含量较高化合物中，（E,E）-2,4-庚二烯醛、2-戊基呋喃等成分也在茯砖茶香气中被颜鸿飞等[26]发现并证明具有较高的含量。
在5 种含硫化合物中，苯并噻唑相对含量较高，且被认为可能是代表普洱茶所共有的特殊陈香物质[27]。酚类化合物数量较少，相对含量最高的是苯酚（0.32%）。烯类化合物共有23 种，然而相对含量在六堡茶香气成分中普遍较低，最高的5-异丙基-1,3-环戊二烯的相对含量也仅有0.24%。烯酯类化合物中只有2-乙基-（5-甲基-5-乙烯基四氢呋喃-2-乙基）-2-异丙基酯的相对含量高于0.5%。内酯类化合物整体在六堡茶香气成分中相对含量较低，只有椰子醛、10-甲基十一碳-4-交酯的相对含量在0.1%以上。胺类化合物中N-苯基甲酰胺、月桂酰胺的相对含量较高。醋酸酐是酸酐类化合物中相对含量最高的化合物，但相对含量也仅有0.09%。3 种炔类化合物的相对含量均比较低，只有0.01%。
虽然表2中所列307 种香气成分在6 个代表性的六堡茶茶样中均得到了检测，但是部分化合物的标准偏差较大，尤其是相对含量较高的成分更为明显。不同茶样中含量差异的分布原因可能与多种因素有关，如原料的标准、制作的工艺、贮存的时间[28-30]、贮藏的条件[31]等，仍然还有待进一步研究。
2.3 六堡茶的特征性香气成分分析
续表2
注：数据以 ±s表示；表中部分数据为0.00表示该物质的相对含量极低（保留两位小数后为0.00）。
表3 六堡茶样品中高相对含量香气成分（≥0.5%）的气味特征
Table 3 Odor characteristics of relatively high contents (≥0.5%) in Liubao tea sam p les
表3列出了六堡茶香气成分中相对含量较高的（≥0.5%）54 种化合物。其中，芳香烃化合物、醛类化合物、酯类化合物以及烯醛、烯酮类化合物等具有良好的呈香特性，可能对六堡茶的香气品质有重要影响。醛类化合物和食品特异香气风格有着密切的联系[4]，它们在六堡茶的香气成分中相对含量较高，其中己醛等脂肪醛具有较为强烈的果香等香气，3-甲基丁醛有似苹果香气或桃子香味，苯甲醛等芳香醛呈现杏仁香、花香等香气。芳香烃类化合物多数呈现芳香族特有的香气，如乙苯、1,3-二甲基苯等呈现类似苯的芳香气味。而作为醚类的1,2,3-三甲氧基苯具有一定陈味，也被认为可能是构成六堡茶香气品质的重要因子[32]。另外，醇类、烯醇类化合物多数也呈现花香、果香等，同时也是构成陈香普洱茶的重要香气成分之一[33]，如3-甲基丁醇具有苹果白兰地香气，α-萜品醇具有丁香、铃兰香气，而具有花香的芳樟醇则被认为是茶叶中一种十分关键的香气成分[34]。此外，棕榈酸具有轻微脂肪和蜡香，也是黑茶中一种比较重要的高含量物质[25]。
在其他高相对含量的化合物种类中，如部分烷烃类化合物、部分醚类化合物、有机酸类化合物等具有刺激性气味或者无明显气味的化合物，推测它们对六堡茶香气的贡献率比较低，可能是通过茶叶加工、贮藏过程中的化学变化或者与其他物质之间相互反应从而间接促进香气品质的变化[35]。另外，值得注意的是，六堡茶香气成分中除了相对含量水平较高的物质外，一些相对含量较低但是香气阈值更低的物质，也能在质量浓度较低的情况下呈现出香气特征，如（E,E）-2,4-癸二烯醛的香气阈值仅为0.16 μg/L[36]，而呈现出强烈的油脂香。具有甜橙、蜂蜜样香气的辛醛，香气阈值也仅有0.7 μg/L[37]，这些低香气阈值的化合物可能对六堡茶的香气品质也具有一定贡献。
六堡茶的特征性香气成分，前期有学者进行了一些研究，陈文品等[7]从农家六堡毛茶样和精制六堡茶样中共鉴定出了100 种香气成分，包括具有典型木香的苯甲醛、苯乙醛，具有薄荷、樟脑香的2,6-二甲基萘，具有紫罗兰香的反-β-紫罗兰酮等，这些物质也在本研究中也得到了分离鉴定；刘泽森等[8]在通过槟榔香六堡茶的特征性香气成分研究中，共鉴定出66 种成分，认为醇类物质是槟榔香六堡茶的最重要香气物质，其香气种类及含量均为第一，其中雪松醇是最重要的香气物质；而本研究中醇类物质种类及相对含量均不显著，只有α-萜品醇（1.57%）相对含量稍高，且并未鉴定出雪松醇，与前人研究结果存在较大的差异。李建勋等[38]利用顶空固相微萃取结合GC-MS联用技术对六堡茶的香气成分进行分析，初步确定了67 种化合物，在其确定的相对含量排名前十的化合物中，咖啡因、1,2,3-三甲氧基苯、5-甲基-1,2,3-三甲氧基苯、β-紫罗兰酮、1,2,3,4-四甲氧基苯、3,4-二甲氧基甲苯6 种化合物在本研究中得到了鉴定。不过以往的研究采用的多为GC-MS，由于香气成分繁多复杂，普通一维气相色谱获得的图谱存在较大的干扰，朱荫等[39]研究表明利用GC-MS对西湖龙井香气成分进行分离时存在“包峰”现象：在GC-MS中分离效果较好的芳樟醇峰段，利用GC×GC-TOFMS则可分离出包括芳樟醇在内的6 个色谱峰。由于六堡茶的香气独特，似淡雅果香味，又与槟榔的成熟干燥种子或切片香气类似，且随着贮藏年份的增加，这种香气特征越明显[40-41]。因此GC×GC-TOFMS优秀的分离性能可以改善和弥补GC-MS峰容量的不足，对六堡茶的香气成分进行更好的分离鉴定。
续表3
注：—.未查到该化合物的香气特征。
本研究采用GC×GC-TOFMS技术分析了六堡茶的香气成分，在6 个代表性样品中鉴定出包括烯醇类、烯类、胺类、烷烃类、醛类、烯醛类、醚类、醇类、酯类、内酯类、烯酯类、烯酮类、酮类、酚类、酸类、含硫化合物、氮杂环化合物、氧杂环化合物、芳香烃化合物、炔类及酸酐类在内的21类物质和307 种共有香气化合物。研究表明，有机酸类化合物在六堡茶香气成分中的相对含量最高，而酮类化合物在六堡茶香气成分中的数量最多。此外，芳香烃化合物、醚类化合物、醛类化合物、酮类化合物等也具有较高的相对含量和化合物数量，它们对六堡茶香气品质可能具有重要的影响。
与以往研究相比，本研究采用GC×GC-TOFMS技术对六堡茶的香气成分进行分析，分离鉴定出的数量比以往研究更为丰富。根据不同种类化合物的不同特征性香型和六堡茶的GC×GC-TOFMS的分析结果，推测具有愉悦香气、特征性香气的芳香烃化合物、醛类化合物、醚类化合物以及烯醛、烯酮、烯醇类化合物等可能对六堡茶的香气品质具有重要影响。相对含量较低且香气阈值较低的化合物也可能是其香气的重要组成部分（如以（E,E）-2,4-庚二烯醛[42]、柠檬烯[43]为代表的部分烯醛类、萜烯类等化合物）。另外，其他的具有刺激性气味或者无明显气味的高相对含量种类化合物，虽然香气的贡献率比较低，但是也可能是通过间接反应促进香气品质的变化。目前六堡茶香气的特征成分研究还不够完全，一些化学成分还有待进一步确认，这也是未来六堡茶香气研究的一个重要方向。
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Analysis of Aroma Components in Liubao Tea by Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography-Time-of-Flight Mass Spectrometry
MU Bing1,2, ZHU Yin1, MA Shicheng3,4, ZHANG Yue1, CAO Zhonghuan3,4, YU Cuiping3,4, LIN Zhi1,*, LÜ Haipeng1,*
(1. Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization, M inistry of Agriculture, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3. Liupao Tea Research Institute of Wuzhou, Wuzhou 543000, China;4. Agricultural Science Research Institute of Wuzhou, Wuzhou 543000, China)
Abstract:Liubao tea is one of China’s most well-known teas w ith a long history of consumption, which has a unique aroma quality. The composition and relative contents of aroma components in a representative batch of Liubao tea were analyzed by comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry (GC × GC-TOFMS). A total of 307 aroma components were identified from the tea samples, including 7 enols, 23 alkenes, 5 am ines, 20 alkanes, 14 aldehydes, 14 olefin aldehydes, 22 ethers, 7 alcohols, 10 esters, 7 lactones, 5 allyl esters, 30 ketenes, 49 ketones, 5 phenols,11 organic acids, 5 sulphur compounds, 20 nitrogen heterocyclic compounds, 7 oxygen heterocyclic compounds, 40 aromatic hydrocarbon compounds, 3 alkynes and 3 acid anhydrides, and 21 other compounds. The results showed that the aroma of Liubao tea was mainly composed of organic acids, aromatic hydrocarbon compounds, ethers, and aldehydes, and their relative contents were 16.55%, 13.50%, 10.92% and 10.04%, respectively. There were 54 aroma compounds accountingfor less than 0.5% of the total amount of volatiles, the predom inant ones being hexadecanoic acid (14.95%), benzaldehyde(3.03%), 3,7-dimethyl-1,6-octadien-3-ol, (2.19%) and (E,E)-2,4-heptadienal (2.04%). The analysis of characteristic aroma components showed that organic acids (such as hexadecanoic acid), aromatic hydrocarbon compounds (such as ethylbenzene), ethers (such as 1,2,3-trimethoxybenzene and 2-methoxy-naphthalene), aldehydes (such as benzaldehyde and 3-methyl-butanal) and ketones (such as α-ionone) may have a direct impact on the aroma quality of Liubao tea.
Key words:Liubao tea; GC × GC-TOFMS; aroma components; aroma characteristics
收稿日期：2017-01-30
基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（Y2017JC45；1610212016003）；梧州市科学研究与技术开发课题（201501024）；广西农业科学院院市合作课题（桂农科2016HZ24）；国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-23）
作者简介：穆兵（1992—），男，硕士研究生，主要从事茶叶加工品质化学研究。E-mail：wsmb@tricaas.com
*通信作者：林智（1965—），男，研究员，博士，主要从事茶叶加工品质化学研究。E-mail：linzhi@caas.cn吕海鹏（1980—），男，研究员，博士，主要从事茶叶加工品质化学研究。E-mail：lvhaipeng@tricaas.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722026
中图分类号：S571.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）22-0169-09
引文格式：
穆兵, 朱荫, 马士成, 等. 六堡茶香气成分的全二维气相色谱-飞行时间质谱分析[J]. 食品科学, 2017, 38(22): 169-177.
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722026. http://www.spkx.net.cn
MU Bing, ZHU Yin, MA Shicheng, et al. Analysis of aroma components in Liubao tea by comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-fl ight mass spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(22): 169-177. (in Chinese w ith English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722026. http://www.spkx.net.cn