猪皮胶原多肽螯合钙增加大鼠骨密度

许先猛1,2,董文宾1,*

(1.陕西科技大学化学与化工学院,陕西 西安 710021;2.运城职业技术学院有机食品工程系,山西 运城 044000)

摘 要:以实验室制备的猪皮胶原多肽(collagen polypeptide,CP)和葡萄糖酸钙为原料,采用液体反应法合成胶原多肽螯合钙(calcium-binding CP,CP-Ca),并评价CP-Ca增加SD大鼠骨密度(bone mineral density,BMD)作用。将120 只断乳雌性4 周龄SD大鼠随机分为10 组:1)对照组(灌胃去离子水);2)低、中、高剂量CP-Ca组(139.28、278.55、557.10 mg/(100 g·d));3)低、中、高剂量CaCO3组(25、50、100 mg/(100 g·d));4)低、中、高剂量CP+CaCO3组(139.28 mg/(100 g·d)CP+25 mg/(100 g·d)CaCO3、278.55 mg/(100 g·d)CP+50 mg/(100 g·d)CaCO3、557.10 mg/(100 g·d)CP+100 mg/(100 g·d)CaCO3)。所有实验大鼠饲喂基础饲料,自由饮用去离子水。实验过程中,每周测定大鼠的体质量和身长,灌胃第4周做3 d钙代谢实验。测定大鼠血清钙(S-Ca)、血清磷(S-P)浓度、碱性磷酸酶(alkaline phosphatese,ALP)活力、大鼠BMD和骨钙含量,并对大鼠股骨进行扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)分析。结果显示,中、高剂量CP-Ca组和高剂量CP+CaCO3组可以显著促进大鼠体质量增加和发育(p<0.05),CP-Ca效果更为明显。CP-Ca组和CP+CaCO3组的ALP活力显著低于对照组(p<0.05),而中、高剂量CP-Ca组和中、高剂量CP+CaCO3组BMD显著高于对照组(p<0.05),且高剂量CP-Ca组高于对应剂量CP+CaCO3组,各剂量CP-Ca组和CP+CaCO3组钙表观吸收率分别高于对应CaCO3组,CP-Ca具有促进大鼠骨生长、发育、骨钙沉积的作用。SEM结果显示,CP-Ca和CP+CaCO3能够预防和改善大鼠因长期钙摄入不足引起的骨质疏松症。CP-Ca溶解性高、解离性好,富含钙元素及多肽,具有预防骨质疏松症、增加骨质密度的作用。

关键词:猪皮明胶;多肽螯合钙;SD大鼠;骨密度

人和动物体内所有组织和体液中都存在着大量的矿物质,矿物质是人和动物体必不可少的组成部分并且参与所有的生理活动[1]。其中,钙是体内含量最多的矿物质元素之一,参与多种体内生命活动[2-3],钙元素的缺乏会引发一系列疾病,例如骨质疏松等[4-5]。目前,世界上约有2亿 人患有骨质疏松症,中国约有近9 000万患者,患病人口多,发病率高[6]。骨质疏松容易使骨脆性增加,易发生骨折,对人体健康危害性较大。调查发现,中国人群钙摄入量偏低[7]。我国市场流通钙制剂约2 700 种,但普遍存在生物利用度低的现象[8]。研究表明,骨质中胶原含量高达80%,骨胶原与钙元素合理的补充和配比对骨质疏松等骨质疾病有着很好的预防作用[9-12]。近年来,胶原、多肽以及多肽生物钙制剂受到越来越多的学者关注,并证实了多肽与钙螯合后可以有效提高其生物利用度[13-14]。Bao Xiaolan等[15]研究了多肽分子质量与钙螯合的关系,李彦春等[16]证明了多肽钙制剂补钙效果明显优于普通补钙制剂,菅景颖[17]、张根生[18]等证明了多肽钙制剂能够预防大鼠骨质疏松症。

明胶生产的原料来源丰富,包括猪皮(46%)、牛皮(29.4%)以及猪和牛骨(23.1%)等[19]。我国猪皮年产猪皮产量超过5 400 kt[20],其中一部分用于食品级明胶的生产。本课题组以食品级猪皮明胶为原料,经复合酶酶解后采用超滤方法制备分子质量小于5 ku的胶原多肽(collagen polypeptide,CP),多肽与葡萄糖酸钙螯合制得胶原多肽螯合钙(calcium-binding CP,CP-Ca);以断乳SD大鼠为模型,研究分别摄入CP-Ca或CP与CaCO3混合物时大鼠体内钙吸收率以及大鼠骨密度(bone mineral density,BMD)的变化,探索CP-Ca在大鼠体内的吸收机制,研究CP-Ca增加大鼠BMD的机理。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

断乳雌性4 周龄SD大鼠,体质量70 g左右,由中国人民解放军第四军医大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(军)2012-0007。

食品级猪皮明胶购于山东淄博宝恩生物科技有限公司。

葡萄糖酸钙 浙江康普达生物科技有限公司;CP、CP-Ca 陕西科技大学功能食品开发实验室;CaCO3美国SMI公司;血清钙(S-Ca)检测试剂盒、血清磷(S-P)检测试剂盒、碱性磷酸酶(alkaline phosphatese,ALP)活力检测试剂盒 南京建成生物工程生物研究所;HCl、NaOH、95%乙醇均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AAS Zeenit 700原子吸收分光光度计 德国Analytik Jena公司;S-4800场发射扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM) 日本Hitachi公司;754型紫外-可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;VERTEX 70傅里叶变换红外光谱分析仪 德国Bruker公司;D/max2200PC-X射线衍射仪 日本Rigaku公司;QDR 4500双能X射线吸收仪 美国Hologic公司;微量移液器 芬兰Dragonmed公司;真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;BS-224型电子天平 德国Sartorius公司;HH-Z2恒温水浴锅 郑州长城科工贸有限公司;RE-52AA型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 猪皮CP粉末制备

参考文献[20]的方法,采用复合酶水解制备CP。处理后的酶解液采用超滤系统制备分子质量小于5 ku的多肽溶液,浓缩后冻干,制备多肽粉末。

1.3.2 CP-Ca制备

参考文献[21]的方法,采用液体反应法合成CP-Ca,经测定钙含量为7.18%。

1.3.3 动物实验

选取4 周龄大SD雌性大鼠120 只,饲养温度(20±1)℃,相对湿度(60±5)%,灯光维持12 h/12 h光暗交替周期。饲养过程中小鼠自由进食基础饲料和自由饮用去离子水。基础饲料配制依据《保健食品检验与评价技术规范》配方[22]:10.0%(质量分数,下同)酪蛋白、15.0%黄豆粉、54.0%小麦面粉、4.0%花生油、10.0%紫花苜蓿纤维素、5.0%盐混合物、1.0%维生素混合物、0.2%氯化胆碱、0.2% DL-蛋氨酸、11.0%淀粉等。调整基础饲料钙含量为150 mg/100 g,高压熟化,备用。适应性喂养1 周,120只SD雌性大鼠随机分为10 组,即对照组:灌胃去离子水;CP-Ca低、中、高剂量组:分别灌胃139.28、278.55、557.10 mg/(100 g·d)CP-Ca;CaCO3低、中、高剂量组:分别灌胃25、50、100 mg/(100 g·d)CaCO3;CP+CaCO3低、中、高剂量组:各组灌胃CP-Ca、CaCO3剂量分别为139.28、25 mg/(100 g·d),278.55、50 mg/(100 g·d),557.10、100 mg/(100 g·d)。摄入剂量计算基于成人每日钙的建议摄入量(800~1 200 mg/60 kg)的5、10、20 倍。

1.3.4 大鼠体质量、身长测定

大鼠禁食12 h后测量体质量,每周测一次并记录。同时测量大鼠身长(大鼠两耳中间位置至大鼠尾根的自然长度)。

1.3.5 大鼠钙代谢表观吸收率测定

大鼠连续灌胃4 周后进行3 d钙代谢实验,分别记录3 d进食和收集72 h粪便,每天测定粪便中钙含量[23],按下式计算钙的表观吸收率。

式中:m摄入钙/mg=饲料中钙含量/%×饲料质量/mg;m粪钙/mg=粪便中钙含量/%×粪便排出量/mg。

1.3.6 血清中钙、磷含量及ALP活力测定

饲养结束后,大鼠禁食24 h,眼球取血后4 ℃、2 000 r/min离心20 min提取血清。S-Ca、S-P含量和ALP活力通过标准比色方法进行测定,按试剂盒说明进行操作。

1.3.7 大鼠BMD和骨钙含量测定

大鼠灌胃3 个月后处死,剥离出左、右侧股骨,于105 ℃烘箱中干燥至恒质量,采用双能X射线吸收仪测量右侧股骨中点及远心端BMD;采用原子吸收分光光度法测定股骨钙含量[23]

1.3.8 大鼠股骨观察

将处理后大鼠左股骨固定于SEM样盘,喷金镀膜,施加电压,聚焦清晰后获取放大100 倍图像,观察股骨表面的变化。

1.4 数据统计分析

数据采用SPSS 11.0软件处理,实验结果以 ±s表示,经单因素方差分析(One way-ANOVA)进行组间差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 CP-Ca对大鼠体质量和身长的影响

表1 CP-Ca对大鼠体质量和身长的影响
Table 1 Body weight and body length of SD rats from each group

注:*.与对照组比较差异显著(p<0.05);**.与对照组比较差异极显著(p<0.01)。下同。

所有组别大鼠初始体质量和初始身长比较接近,在相同的环境下给予相同的基础饲料,自由摄入去离子水。由表1可知,各组大鼠的体质量和身长均有不同程度的增长。所有实验组别大鼠体质量都高于对照组,并且CP-Ca中、高剂量组和CP+CaCO3高剂量组大鼠体质量显著高于空白组(p<0.05)。钙摄入量是否合理,尤其是摄入合理的钙磷比可以有效促进大鼠体质量的增加和骨骼发育[24]。而各组之间大鼠身长无显著性差异。

2.2 CP-Ca对大鼠S-Ca、S-P浓度和ALP活力影响

表2 CP-Ca对大鼠S-Ca、S-P浓度和ALP活力的影响
Table 2 Effect of CP-Ca on serum calcium, phosphorus contents and ALP activity of SD rats from each group

由表2可见,各组S-Ca和S-P浓度无显著差异。ALP是成骨细胞分化成熟的一种标志性酶,能够准确反映成骨细胞分化和成熟[25]。饶华等[26]研究发现,大鼠服用0.5、1.5 g/kg杜仲叶总提取物具有治疗骨质疏松的作用,且大鼠ALP活力分别降低26.7%、49.6%。本实验各组ALP活力都显著低于对照组(p<0.05),高剂量CP-Ca、CP+CaCO3和CaCO3分别使大鼠ALP活力降低48.7%、40.9%、46.5%,因此CP-Ca、CP+CaCO3和CaCO3均可以起到促进大鼠骨生长和发育的作用。

2.3 CP-Ca对大鼠BMD、骨钙含量和钙表观吸收率的影响

表3 CP-Ca对大鼠BMD、骨钙含量和钙表观吸收率的影响
Table 3 Effect of CP-Ca on BMD, bone calcium content and apparent calcium absorption rate of rats

由表3可知,各实验组BMD和骨钙含量都高于对照组,对照组的钙摄入量不足导致大鼠BMD和骨钙含量偏低。CP-Ca中、高剂量组和CP+CaCO3中、高剂量组BMD显著高于对照组(p<0.05),且高于对应CaCO3组,CP-Ca高剂量组高于对应剂量CP+CaCO3组,因多肽以及多肽生物钙具备提高钙元素在大鼠体内生物利用度的作用[13-14]。CaCO3高剂量组BMD显著高于对照组(p<0.05),CaCO3一般情况下与饮食共同摄入吸收率较好,如饮食中蛋白质的摄入量升高10 g相应的钙吸收率升高0.007 6[28-29]。CP-Ca高剂量组和CP+CaCO3高剂量组骨钙含量显著高于对照组(p<0.05),在钙摄入量充足且吸收率较高的情况下,可以形成有效的骨钙沉积。结果显示,对照组钙表观吸收率显著高于实验组,这主要是由于当大鼠机体处于严重缺钙的情况下,大鼠钙生物利用度会大大增高[30]。各剂量CP-Ca组和CP+CaCO3组钙表观吸收率分别高于对应CaCO3组,这主要是由于多肽钙摄入体内后以Ca2+形式存在,容易被大鼠吸收,同时含有一定量CP能够有效促进钙吸收[11,31]

2.4 大鼠股骨SEM观察结果

由图1可见,CP-Ca高剂量组、CaCO3高剂量组和CP+CaCO3高剂量组大鼠股骨表面有较为明显的蜂窝状,这是由于成骨细胞表现活跃的结果[16],且CP-Ca高剂量组大鼠股骨表面蜂窝状较CaCO3高剂量组和CP+CaCO3高剂量组更为规则和明显。在对照组中,大鼠股骨表面无蜂窝状,但不规则的分布一些大小不一的小孔,这是因为对照组大鼠长期处与钙摄入不足的条件下,一定程度上出现了骨质疏松症而体现出来的现象。结果证实,CP-Ca和CP+CaCO3具有预防骨质疏松症,增加BMD的作用。

图1 大鼠股骨SEM图
Fig. 1 SEM of femur in rats

3 结 论

本实验采用复合酶水解猪皮明胶制备CP,以多肽和葡萄糖酸钙为原料采用液体反应法合成CP-Ca,经测定,钙含量为7.18%。钙是人体内非常重要的营养素,对人体的生命活动起着至关重要的作用。CP-Ca因其溶解性和解离性好、小肽具备促进钙离子转运等作用,钙在人体内吸收率较普通钙制剂高。通过大鼠实验对制备的CP-Ca增加BMD和补钙功能进行评价,所有实验大鼠喂以基础饲料,自由饮用去离子水,对照组灌胃去离子水,实验组分别灌胃低、中、高3 个剂量CP-Ca、CaCO3、CP+CaCO3。实验测定了大鼠的体质量、身长、S-Ca钙及S-P浓度、ALP活力、BMD、骨钙含量、钙表观吸收率,并对大鼠股骨进行SEM观察分析。结果表明,CP-Ca、CP+CaCO3具备促进大鼠体质量和骨骼生长的作用,能够促进骨生长和发育。CP-Ca被大鼠摄入体内后,Ca2+能够有效解离,同时CP具备促进钙吸收的作用,CP-Ca摄入量为139.28、278.55、557.10 mg/(100 g·d)时钙表观吸收率较摄入相同剂量CaCO3的钙摄入量增加3.53%、8.16%、7.57%。CP-Ca具有预防骨质疏松症、增加BMD的作用,本课题组将对CP-Ca在动物体内转运机制和病理毒理学进行深入研究。

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Calcium-Binding Collagen Polypeptide from Pigskin Gelatin Improves Bone Mineral Density in Rats

XU Xianmeng1,2, DONG Wenbin1,*
(1. College of Chemistry and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China;2. Department of Organic Food Engineering, Yuncheng Polytechnic College, Yuncheng 044000, China)

Abstract:In this paper, calcium-binding collagen polypeptide (CP-Ca) was synthesized by liquid-state reaction between collagen polypeptide prepared in our laboratory from pigskin gelatin and calcium gluconate, and the effect of CP-Ca on improving bone mineral density (BMD) in rats was investigated. Totally 120 female SD rats were equally divided into 10 groups: control group (deionized water by gavage), low-, middle- and high-dosage CP-Ca groups (139.28, 278.55 and 557.10 mg/(100 g·d)), low-, middle- and high-dosage CaCO3groups (25, 50 and 100 mg/(100 g·d)), and low-,middle- and high-dosage CP + CaCO3group (139.28 mg /(100 g·d) CP + 25 mg/(100 g·d) CaCO3, 278.55 mg/(100 g·d)CP + 50 mg/(100 g·d) CaCO3, 557.10 mg/(100 g·d) CP + 100 mg/(100 g·d) CaCO3). All rats were fed on a basic diet and deionized water. The body weight and length of the rats were recorded weekly. A three-day calcium metabolism experiment was carried out in the fourth week to estimate the apparent absorptivity of calcium. Serum calcium (SCa), serum phosphorusand (S-P), and alkaline phosphatese (ALP), BMD and bone calcium content were measured. The rat femurs were analyzed by scanning electron microscope (SEM). The results showed that CP-Ca at middle and high dosages and CP + CaCO3at high dosage could signif i cantly promote body weight gain (P < 0.05), and the effect of CPCa was more apparent. CP-Ca and CP + CaCO3had obviously lower ALP activity than the control group (P < 0.05).CP-Ca and CP + CaCO3both at middle and high dosages significantly raised BMD compared to the control group(P < 0.05), and CP-Ca was more effective at the high dosage. At all dosages tested, CP-Ca and CP + CaCO3resulted inhigher Ca bioavailability than CaCO3. CP-Ca could activate osteoblasts on the surface of bones, increase the density of bones and reduce bone calcium loss. Meanwhile, SEM revealed that CP-Ca and CP + CaCO3could prevent and improve osteoporosis caused by long-term calcium def i ciency. CP-Ca was highly soluble, exhibited good dissociation ability, and was rich in calcium and polypeptides so than it can be used in functional foods and health products to prevent osteoporosis and improve BMD.

Key words:pigskin gelatin; calcium-binding collagen polypeptide (CP-Ca); SD rats; bone mineral density (BMD)

收稿日期:2016-09-06

基金项目:“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD12B07-05)

作者简介:许先猛(1984—),男,讲师,博士,研究方向为功能食品开发。E-mail:xuxianmeng@sina.com

*通信作者:董文宾(1951—),男,教授,硕士,研究方向为食品安全性与新材料制备。E-mail:dongwb@sust.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723030

中图分类号:TS251.92

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)23-0191-05

引文格式:

许先猛, 董文宾. 猪皮胶原多肽螯合钙增加大鼠骨密度[J]. 食品科学, 2017, 38(23): 191-195.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723030. http://www.spkx.net.cn

XU Xianmeng, DONG Wenbin. Calcium-binding collagen polypeptide from pigskin gelatin improves bone mineral density in rats[J]. Food Science, 2017, 38(23): 191-195. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723030.http://www.spkx.net.cn