低温等离子体对生鲜牛肉杀菌效果及色泽的影响

乔维维1，黄明明1，王佳媚2，严文静1，章建浩1,*，杨龙平1

（1.国家肉品质量与安全控制工程技术研究中心，农业部畜产品加工与质量控制重点开放实验室，江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095；2.海南大学食品学院，海南 海口 570228）

摘 要：为探讨低温等离子体在不显著影响牛肉色泽的条件下对牛肉杀菌的最优工艺，在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken响应面法研究了电压、处理时间与O2比例对杀菌率及红度a*值的影响，模拟得到了二次多项式回归方程的预测模型。结果表明低温等离子体能有效降低牛肉细菌残留量，最佳杀菌工艺为：电压72 kV，处理时间86 s，O2、CO2和N2比例分别为35%、35%和30%。在此条件下，牛肉仍保持较好的颜色，杀菌率为93.75%，与模型预测值94.04%吻合良好，说明优化出的回归方程对于生产实际有一定的理论指导意义。

关键词：低温等离子体；牛肉；杀菌；a*值；响应面法

生鲜牛肉由于口感良好、营养丰富而日益受到消费者的青睐。目前，我国各大中超市生鲜牛肉仍以裸露或覆盖保鲜膜置于冷柜销售为主。微生物污染及肉色异常往往是造成腐败浪费和销售滞缓的主要原因，限制了生鲜肉工业的发展。为保障品质并延长产品的货架期，目前广泛研究的适用于生鲜类产品的冷杀菌技术包括电离辐射、超高压、脉冲电场、振荡磁场及高功率超声波等[1]，但普遍存在效果有限及操作条件严格等问题。介质阻挡放电（dielectric barrier discharge，DBD）低温等离子体是一种新兴的杀菌技术，设备操作简单[2]；不会使鲜肉产生明显升温[3]，在特定处理条件下感官变化不显著[4]，具有广泛应用于工业生产的前景。

DBD低温等离子体是在放电空间内插入绝缘介质的一种非平衡态气体。将密封包装食品置于电极之间，当施加足够高的交流电压时，包装内气体被激发而形成均匀弥散的微放电。通过激发包装内部的气体形成等离子体对包装牛肉进行杀菌，有效避免了先杀菌后包装造成的二次污染[5]。惰性气体、O2和空气等都可以激发产生不同成分的等离子体[6-7]。等离子体的化学性质非常活泼，可作用于细胞表面，破坏细胞外结构的完整性[8]；也能氧化损伤生物大分子，包括DNA、蛋白质和脂类等物质[9-10]，从而引起细菌失活。但是，这些活性成分的寿命很短，半衰期较长的臭氧及其他成分在24 h内都会逐渐转变为基态[11]。研究报道等离子体能完全杀灭聚合物、玻璃和金属等多种材料表面的酵母菌、细菌和芽孢，甚至病毒[12-13]，对果蔬等营养基质表面的细菌具有良好的杀菌效果[14-16]。

低温等离子体对包装牛肉的杀菌效果研究相对较少。Kim等[17]研究发现，与纯He相比，O2与He混合激发形成的等离子体对培根表面接种的致病菌的杀菌效果普遍提高了约1 lg（CFU/g）；但有研究认为，N2能比惰性气体形成种类更多的活性成分[18]，且混合气体的杀菌效果比单一气体好[19]。Röd等[20]在牛肉干表面接种单核增生性李斯特菌后用等离子体处理，发现随着等离子体激发功率和时间延长，菌落总数能够降低1.6 lg（CFU/g），牛肉干的a*值有一定下降。本研究以2 cm厚牛肉块为研究对象，采用较为廉价的常用气体：N2固定为30%，防止包装塌陷及降低电负性气体含量，配以不同配比O2及CO2，研究电压、处理时间和O2比例对杀菌率及牛肉a*值的影响；在不显著影响牛肉色泽基础上，优化杀菌工艺，为DBD低温等离子体在生鲜牛肉冷杀菌领域的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛背最长肌 南京苏果超市卫岗店。

氯化钠、平板计数琼脂 青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

低温等离子体设备 江苏苏美达仪器设备有限公司；MAP-H360复合气调保鲜包装机、包装盒、包装膜苏州森瑞保鲜设备有限公司；CR-400型全自动测色色差仪 日本柯尼卡美能达控股公司；电热恒温培养箱上海一恒科学仪器有限公司；XC07-Ⅱ无菌拍打式均质器南京宁凯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉加工及处理

将与牛肉接触的刀具、包装盒用75%酒精消毒，超净台内紫外灭菌30 min。将原料肉剔除筋、膜及其他杂质后，换刀具，再次削除表面肌肉，分割成长方块（5 cm×5 cm×2 cm），互相摩擦充分接触后置于聚丙烯包装盒（17 cm×12 cm×3.2 cm）内。从中随机抽取4 盒，充空气包装作为对照组。其余分别按不同因素水平气调包装并进行低温等离子体处理，每个处理重复4 次，4 ℃贮存24 h。

1.3.2 杀菌率的测定

打开包装样品以环状取样器钻取肉块中心牛肉20 g于自封袋，用无菌剪刀切碎、混匀，加入180 mL无菌生理盐水，均质器以12 次/s拍打40 s，梯度稀释后选择适宜稀释度涂平板，置于37 ℃培养箱培养24 h，计数。按下式计算低温等离子体杀菌率。

式中：N0、Np分别为对照组和处理组菌落总数/（CFU/g）。

1.3.3 色泽的测定

以标准白板校正的色差仪测定牛肉表面的红度a*值，每个样品测定3 个点，取其平均值。

1.3.4 低温等离子体处理条件对生鲜牛肉杀菌效果及色泽的影响

1.3.4.1 电压对低温等离子体杀菌率及a*值影响

低温等离子体处理阶段，固定处理时间为60 s，气体组成为35% O2、35% CO2、30% N2，然后按照电压0、50、60、70、80、90 kV不同的梯度进行处理。

1.3.4.2 处理时间对低温等离子体杀菌率及a*值影响

低温等离子体处理阶段，固定电压为70 kV，气体组成为35% O2、35% CO2、30% N2，然后按照处理时间0、30、60、90、120、150 s不同的梯度进行处理。

1.3.4.3 O2比例对低温等离子体杀菌率及a*值影响

低温等离子体处理阶段，固定处理时间为60 s，电压为70 kV，然后按照N2固定为30%，O2与CO2分别为0%+70%、15%+55%、25%+45%、35%+35%、45%+25%、55%+15%的气体比例进行处理。

1.3.5 响应面试验方法设计

在1.3.4节单因素试验的研究结果基础上，选择电压、处理时间、O2比例的因素水平，以a*值为参考、杀菌率为评价指标进行响应面优化分析。

1.4 数据统计分析

单因素试验结果用Excel 2010软件分析作图，用Design-Expert 8.0软件处理响应面试验结果，并用最小二乘法进行二次多项式回归统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌条件对生鲜牛肉杀菌效果及色泽的影响

2.1.1 电压对低温等离子体杀菌率及a*值的影响

图1 电压对杀菌率及a*值的影响
Fig. 1 Effect of voltage on sterilization eff i ciency and a* value

由图1可见，气调未处理组（电压为0 kV）由于含有CO2，对牛肉有一定的抑菌作用。低温等离子体处理后，杀菌率呈先上升后平缓的趋势，随着电压的升高，放电功率增加，从而增加高能粒子的密度[22]，杀菌率提高。当处理电压为70 kV时，杀菌率达到最高值，之后杀菌率维持稳定。可能因为高电压时气体碰撞加剧，电离状态不稳定，各类粒子进一步聚合或反应消耗，有效杀菌成分不再增加所导致。气调未处理组的a*值高于各处理组，说明低温等离子体对牛肉肉色有不利影响，但电压为50～80 kV时，a*值均大于充空气包装中牛肉a*值19.67，肉色较红；电压高于80 kV时，a*值迅速下降，可能是过高的电压破坏了肌红蛋白及色素，使肉色变暗。此外，过高的电压会对阴极造成损伤，因此，综合考虑选择电压为60～80 kV。

2.1.2 处理时间对低温等离子体杀菌率及a*值影响

图2 处理时间对杀菌率及a*值的影响
Fig. 2 Effect of processing time on sterilization eff i ciency and a* value

由图2得出，低温等离子体处理可以有效降低牛肉细菌，当处理时间为0～60 s时，随着处理时间的延长，杀菌率逐渐升高；当处理时间长于60 s时，杀菌率上升缓慢。Song等[21]研究等离子体对火腿表面的杀菌，发现处理时间对杀菌效率有显著影响，时间越长杀菌率越高。Hu Miao等[22]的研究表明杀菌率随时间延长先上升后平缓，与本研究结果一致。这可能是由于随处理时间的延长，产生的活性氧自由基等杀菌物质浓度逐渐增加，90 s后已超过能与表面细菌充分反应的浓度；此外，由于低温等离子体是一种表面杀菌技术，对牛肉内部的细菌杀菌作用有限，故对肉块整体的杀菌率不再持续快速上升。a*值随处理时间的延长逐渐降低，处理时间短于90 s时牛肉颜色均优于充空气包装，处理120 s时肉色明显变暗。随着处理时间的延长，低温等离子体中的活性氧自由基等成分逐渐增加，导致高铁肌红蛋白的含量增加，使a*值逐步降低[23]。在不显著影响肉色的前提下，选择处理时间为30～90 s。

2.1.3 O2比例对低温等离子体杀菌率及a*值的影响

图3 O2比例对杀菌率及a*值的影响
Fig. 3 Effect of oxygen percentage on sterilization eff i ciency and a* value

原始气体的组成决定了低温等离子体形成的成分[24]。研究表明，20%以上的O2能够促进形成较好的肉色，O2比例超过55%时护色效果不再显著增加[25]；CO2可溶解于汁液，降低牛肉pH值从而抑菌。故本研究采用O2与CO2分别为0%+70%、15%+55%、25%+45%、35%+35%、45%+25%、55%+15%研究气体组成的影响。由图3可以看出，O2比例在0%～35%时，低温等离子体的杀菌率迅速增加；O2比例大于35%时，低温等离子体的杀菌率呈现下降趋势，降幅较小。这可能是在低O2比例时，低温等离子体产生活性氧等杀菌性自由基的总量随O2比例的增加而升高，CO2的抑菌性降低程度低于自由基杀菌作用的增长；当O2比例大于35%时，CO2的抑菌作用进一步减弱，而产生的自由基超过与牛肉表面细菌充分反应的总量，二者叠加使杀菌率降低。此外，不同组成的气体会造成放电量的差异，H2O、CO2与O2等电负性气体能够吸附电离的自由电子，当再次外施电压时，这些电子在电场作用下又被释放出来，引发下一次放电。放电量的大小是电子吸附和电子释放2 个过程相互竞争的结果[26]，影响最终各自由基成分的浓度。a*值随O2比例变化的趋势与杀菌率总体一致。可能是在低O2比例时，牛肉中肌红蛋白与氧结合，氧合肌红蛋白含量随O2比例的增加而升高，肌肉颜色呈现令人愉悦的樱桃红色；当O2比例大于35%时，高浓度的自由基与氧合肌红蛋白的反应加剧，促进高铁肌红蛋白含量增加使肉色变暗。故选择合适的O2比例为25%～45%。

2.2 响应面试验结果及分析

2.2.1 回归模型建立及显著性分析

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，综合分析单因素试验结果，选取对杀菌率影响显著的电压、处理时间和O2比例，设计了3因素3水平的响应面分析试验，试验结果见表1。

表1 响应面设计及结果
Table 1 Experiment design and results for response surface analysis

试验号 A电压/kV B处理时间/s C O2比例/% a*值 杀菌率/%1 0（70） -1（30） -1（25） 20.65 52.79 2 0 0（60） 0（35） 21.01 88.56 3 0 -1 1（45） 20.43 60.75 4 0 1（90） 1 18.51 82.45 5 0 0 0 20.89 87.83 6 -1（60） 0 1 20.57 63.02 7 -1 0 -1 19.69 59.02 8 -1 1 0 19.15 84.49 9 1（80） -1 0 19.34 73.23 10 1 0 1 18.48 73.67 11 0 1 -1 18.99 80.36 12 1 1 0 18.66 88.68 13 0 0 0 20.88 86.18 14 -1 -1 0 21.52 50.68 15 1 0 -1 19.57 76.72 16 0 0 0 20.77 87.95 17 0 0 0 20.93 88.33

以低温等离子体杀菌率为响应值，利用Design-Expert 8.0软件对表1中的杀菌率数据进行二次多项式回归拟合，得到杀菌率对自变量的多元回归方程为：Y＝-639.57+12.36A+2.49B+10.36C-0.015AB-0.018AC-4.89×10-3BC-0.072A2-6.96×10-3B2-0.12C2。

表2 杀菌率及a*值回归模型方差分析
Table 2 Analysis of variance of regression equations for two response variables

注：**.影响极显著（p＜0.01）；*.影响显著（p＜0.05）。

方差来源 杀菌率 a*值F值 P值 F值 P值模型 156.64 ＜0.000 1** 101.78 ＜0.000 1**A 187.31 ＜0.000 1** 170.95 ＜0.000 1**B 599.18 ＜0.000 1** 315.54 ＜0.000 1**C 7.47 0.029 2* 5.94 0.044 9*AB 41.61 0.000 4** 41.00 0.000 4**AC 6.14 0.042 4* 55.72 0.000 1**BC 4.25 0.078 1 0.97 0.357 4 A2108.97 ＜0.000 1** 101.53 ＜0.000 1**B281.47 ＜0.000 1** 81.48 ＜0.000 1**C2320.82 ＜0.000 1** 108.70 ＜0.000 1**失拟项 4.06 0.104 5 4.03 0.105 9 R20.995 1 0.992 4 R2Adj0.988 7 0.982 7 R2pred0.938 6 0.905 9

由表2可知，杀菌率及a*值回归模型极显著（p＜0.01），失拟项不显著（P＝0.105 9＞0.05，P＝0.104 5＞0.05），方程的决定系数（R2）和校正决定系数（R2Adj）较高，说明模型的拟合度高，试验误差小，能够用于分析电压、处理时间以及O2比例对低温等离子体的杀菌率及牛肉a*值的交互作用并对其进行预测。

各因素的显著性检验表明：一次项中A、B对于2 个响应值的影响极显著（p＜0.01），C对响应值的影响显著（p＜0.05），而所有的二次项对响应值的影响均极显著（p＜0.01）；交互项中，电压与处理时间及电压与O2比例的交互作用（AB、AC）对响应值影响显著（p＜0.05，p＜0.01），BC交互项影响不显著。这些结果表明低温等离子体杀菌过程中，三因素对杀菌率及a*值的影响是非线性的。由于在实际处理过程中，各个因素往往同时起作用，因此在维持良好肉色的前提下研究它们的交互作用对提高牛肉的杀菌率具有重要意义。本研究以提高杀菌率为主要目的，以下仅讨论三因素对杀菌率的交互作用。

2.2.2 电压和O2比例对杀菌率的交互作用

图 4 电压和O2比例对杀菌率交互作用的响应面图
Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effect of voltage and oxygen percentage on sterilization eff i ciency

通过回归模型绘制响应面，从响应面的形状可以反映出两试验因素之间的交互作用是否显著。图4是固定处理时间为60 s时，电压和O2比例对低温等离子体杀菌率的响应面，可以看出，电压和O2比例对杀菌率具有明显的交互作用。响应面的形状反映了因素对变量的交互作用，曲率越大，表明交互作用越显著，反之越弱。电压比O2比例的曲面斜率更大，说明电压对杀菌率的影响更显著。

由表3可知，在特定电压下，O2比例越偏离临界值，杀菌率越低。当电压为60 kV时，该临界值约为36.26%；当电压增加到80 kV时，临界值减少到34.84%。将表中的O2比例临界值对电压进行线性回归分析，可以看出O2比例对杀菌率影响的临界值随着电压的增大呈线性降低趋势（y＝-0.070 9x+40.518，R2＝1），但变化并不显著。杀菌率随电压的增加呈先上升后平缓趋势，当电压为70 kV时，O2比例的临界值为35.55%，杀菌率为87.80%，继续增大电压，杀菌率略有下降，这与单因素试验结果基本一致。

表3 不同电压下O2比例对杀菌率影响的临界值
Table 3 Critical oxygen percentages for sterilization eff i ciency at different voltage levels

电压/kV 回归方程 O2比例临界值/% 杀菌率/%0 Y＝-0.124 2C2+10.067 0C-515.363 0 40.52 60 Y＝-0.124 2C2+9.009 5C-89.512 9 36.26 73.84 70 Y＝-0.124 2C2+8.833 2C-69.217 9 35.55 87.80 80 Y＝-0.124 2C2+8.657 0C-63.402 9 34.84 87.41

表4 不同O2比例下电压对杀菌率影响的临界值
Table 4 Critical voltages for sterilization eff i ciency at different oxygen percentages

O2比例/% 回归方程 电压临界值/kV 杀菌率/%0 Y＝-0.072 4A2+11.441 5A-515.363 0 79.02 25 Y＝-0.072 4A2+11.000 9A-341.331 7 75.97 76.55 35 Y＝-0.072 4A2+10.824 6A-315.199 7 74.76 89.40 45 Y＝-0.072 4A2+10.648 4A-313.913 7 73.54 77.62

由表4可知，电压对杀菌率影响的临界值随着O2比例的增加线性降低，杀菌率随O2比例的增加呈先上升后下降趋势。当O2比例为35%时，杀菌率为89.40%，当O2比例为45%时，杀菌率为77.62%，下降显著，因此过高的O2比例会抑制低温等离子体的杀菌作用。

2.2.3 电压和处理时间对杀菌率的交互作用

图5 电压和处理时间对杀菌率交互作用的响应面图
Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effect of voltage and processing time on sterilization eff i ciency

图5 是固定O2比例为35%，电压和处理时间对杀菌率的响应面，可以看出，电压和处理时间对杀菌率具有明显的交互作用。处理时间比电压的曲面斜率更大，说明处理时间对杀菌率的影响更显著。对开放体系的低温等离子体研究表明，随着供应能量增加和时间的延长，自由基含量线性上升，食品表面的食源性致病菌杀菌率持续升高[27]。而本研究中低温等离子体产生于密闭包装内，自由基含量随着电压和处理时间的延长逐渐饱和，不同条件下高能粒子间的复杂反应导致自由基成分发生转变，较高电压时的杀菌率反而有所下降[20]。

表5 不同电压下处理时间对杀菌率影响的临界值
Table 5 Critical processing times for sterilization eff i ciency at different voltage levels

电压/kV 回归方程 时间临界值/s杀菌率/%0 Y＝-6.955 56×10-3B2+2.316 2B-429.132 4 166.50 60 Y＝-6.955 56×10-3B2+1.398 2B+14.785 1 100.51 85.05 70 Y＝-6.955 56×10-3B2+1.245 2B+38.091 4 89.51 93.82 80 Y＝-6.955 56×10-3B2+1.092 2B+46.917 6 78.51 89.79

当电压增加时，处理时间对杀菌率影响的临界值呈现降低的趋势，而杀菌率先上升后降低。由表5可知，当电压大于70 kV时，杀菌率开始降低。因此电压不应过高。处理时间对电压临界值进行线性回归分析的结果（y＝-1.099 8x+166.5，R2＝1）表明，处理时间影响杀菌率的临界值随着电压的升高呈降低趋势，且变化显著。在实际应用中，为达到快速高效的目的，应选择时间较短的处理条件。对于电压的临界值，当处理时间延长时呈现降低的趋势，而杀菌率持续上升。

表6 不同处理时间下电压对杀菌率影响的临界值
Table 6 Critical voltages for sterilization eff i ciency at different processing times

时间/s 回归方程 电压临界值/kV 杀菌率/%0 Y＝-0.072 4A2+11.742 6A-429.132 4 81.10 47.00 30 Y＝-0.072 4A2+11.283 6A-365.906 0 77.93 73.74 60 Y＝-0.072 4A2+10.824 6A-315.199 7 74.76 89.40 90 Y＝-0.072 4A2+10.365 6A-277.013 4 71.59 94.00

具体关于电压对于处理时间的临界值及杀菌率的影响结果见表6。当处理时间在60～90 s之间时，电压的临界值变化较小，杀菌率变化也不显著。综合表5、6的结果，推断在响应曲面试验水平下，电压为70.00～74.76 kV，处理时间为78.51～90.00 s内，杀菌率达到最高值。

2.3 验证实验结果

限定a*值大于19.67的范围条件下取杀菌率的最大值，预测最佳处理条件为：处理时间86.08 s、电压71.91 kV，O2、CO2、N2比例分别为34.88%、35.12%、30.00%。在此工艺下，杀菌率预测值为94.04%。为便于操作，调整最佳处理条件为：处理时间86 s、电压72 kV，O2、CO2、N2比例分别为35%、35%、30%。在此条件下，做3 次平行验证实验，实际a*值为19.74，杀菌率为93.75%，与预测值相比误差为0.31%，这表明该模型的预测效果良好，响应面模型优化试验结果可靠。

3 结 论

通过单因素试验研究了电压、处理时间和O2比例对牛肉表面杀菌率及a*值的影响，并采用响应面法对低温等离子体工艺进行优化，通过回归分析建立了杀菌率的二次多项式预测模型。优化后的杀菌率比单因素最高杀菌率93.71%提高了0.04%。试验结果表明优化后的DBD低温等离子体对牛肉表面杀菌具有较好的效果，对其实际应用有一定的理论指导意义。

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Effect of Cold Plasma on Sterilization and Color of Fresh Beef

QIAO Weiwei1, HUANG Mingming1, WANG Jiamei2, YAN Wenjing1, ZHANG Jianhao1,*, YANG Longping1
(1. National Center of Meat Quality and Safety Control, Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing for Quality and Safety Control, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2. College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China)

Abstract:In order to obtain the optimal sterilization conditions for fresh beef with a cold plasma system, where beef color is not signif i cantly impacted, the sterilization eff i ciency and redness (a*) value were optimized as a function of voltage,treatment time and O2percentage using a combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology with a Box-Behnken design. A quadratic polynomial regression equation to predict the two response variables was fi tted. The results showed that cold plasma could effectively reduce the total viable count of beef, and a voltage of 72 kV, a processing time of 86 s and an atmosphere consisting of 35% O2, 35% CO2and 30% N2were found to be the optimal conditions to obtain a higher sterilization efficiency of 93.75%, agreeing with the predicted value (94.04%). The optimization model proposed in this study can provide a useful guideline for practical application of cold plasma as a sterilization technology.

Key words:cold plasma; beef; sterilization; a* value; response surface methodology

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723038

中图分类号：TS201.6

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2017）23-0237-06

引文格式：

乔维维, 黄明明, 王佳媚, 等. 低温等离子体对生鲜牛肉杀菌效果及色泽的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(23): 237-242.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723038. http://www.spkx.net.cn

QIAO Weiwei, HUANG Mingming, WANG Jiamei, et al. Effect of cold plasma on sterilization and color of fresh beef[J]. Food Science,2017, 38(23): 237-242. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723038. http://www.spkx.net.cn

收稿日期：2016-08-25

基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（2015BAD16B05）；江苏省农业科技自主创新资金项目（CX（15）1049）；江苏高校优势学科建设工程资助项目

作者简介：乔维维（1991—），女，硕士研究生，研究方向为畜产品加工与质量控制。E-mail：2014108073@njau.edu.cn

*通信作者：章建浩（1961—），男，教授，博士，研究方向为畜产品加工与质量控制。E-mail：nau_zjh@njau.edu.cn