表1 三疣梭子蟹感官评分标准
Table 1 Criteria for sensory evaluation of P. trituberculatus
周 果1,2，杨文鸽2，崔 燕1，王芝妍2，俞静芬1，林旭东1，凌建刚1,*
（1.宁波市农业科学研究院，宁波市农产品保鲜工程重点实验室，浙江 宁波 315040；2.宁波大学海洋学院，浙江省动物蛋白食品精深加工重点实验室，浙江 宁波 315211）
摘 要：以不同的压力处理三疣梭子蟹，通过考察其感官、pH值、色泽、肌原纤维蛋白含量、巯基含量、表面疏水性和Ca2+-ATPase活力的变化，研究超高压处理对梭子蟹品质的影响。结果表明，150、200 MPa以及250 MPa处理后的梭子蟹，其感官评分、pH值和白度无显著变化（P＞0.05），而300 MPa和350 MPa组均出现显著性变化（p＜0.05），且蟹肉出现熟化，产生了微弱的熟蟹肉特有风味；与对照组相比，250 MPa组的肌原纤维蛋白含量和150、200 MPa组的Ca2+-ATPase活力变化不显著（P＞0.05），其余处理组均发生显著性变化（p＜0.05）；150 MPa和200 MPa组蟹肉肌原纤维蛋白的巯基含量没有显著性变化（P＞0.05）；而表面疏水性与对照组相比均显著升高（p＜0.05）。综合梭子蟹感官评分及其肌原纤维蛋白生化特性指标，150、200 MPa和250 MPa的压力不会引起梭子蟹品质显著改变，这为后续研究超高压对梭子蟹贮藏品质的影响提供了理论依据。
关键词：超高压；三疣梭子蟹；感官评价；肌原纤维蛋白；生化特性
三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）俗称白蟹，属甲壳纲、十足目、梭子蟹科，其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，深受各地消费者喜爱。梭子蟹生活于海洋，离开高盐分高氧环境后存活率大大降低。与河蟹最大的不同是，海蟹虽然存活率较低，但是短时间内死亡且未发出异味的梭子蟹仍可供人食用，其丰富的营养和鲜嫩的口感不亚于鲜活的。目前对即死蟹的处理方法主要有冷藏、冰藏、冻藏和气调保藏等，但这些方法存在保鲜期短、引起干耗、对蟹体的完整性造成损坏和成本较高等缺点[1]。因此通过有效的方法处理即死蟹，延长保质期，改善其食用品质，提升其经济价值显得尤为重要。
超高压（ultra high pressure，UHP）是一种新兴食品加工技术，采用100～1 000 MPa的压力处理食品物料，达到杀菌、灭酶、提高脱壳效率或消减致敏性等目的，以改善食品品质及其贮藏特性[2]。与传统的热处理相比，UHP能较好地保持被加工食品天然的色、香、味及营养成分，减少热敏成分的损失，因此能够更好地保持食品原有的性状与风味，给食品加工业注入了新的活力。目前，UHP技术已被应用于牡蛎、毛蚶、虾类等[3-6]水产品加工中，如López-Caballero等[7]发现400 MPa、10 min的处理可以有效减少牡蛎中的总菌落数；Paarup等[8]研究发现400 MPa可以有效延长鱿鱼的货架期；杨徽[9]将UHP技术用于凡纳滨对虾的脱壳，通过测定虾仁完整性、汁液流失率、产虾仁率、虾仁颜色以及嫩度参数，得出200 MPa压力和3 min保压时间是较佳的工艺参数。而UHP处理对蟹类品质的影响国内外鲜有报道。
UHP是一种通过较强的压力对产品进行物理加工的技术，处理后可能会影响梭子蟹肢体的完整性及其感官形态，改变肌肉蛋白结构而导致肌原纤维蛋白的生化特性发生变化，进而影响梭子蟹食用品质。本实验以即死梭子蟹为原料，研究不同压力处理之后梭子蟹感官、肌肉pH值、色泽、肌原纤维蛋白含量、总巯基含量、Ca2+-ATPase活力和表面疏水性的变化，探讨UHP对梭子蟹肌肉品质的影响，为UHP技术在梭子蟹保鲜中的应用提供理论依据。
1.1 材料与试剂
三疣梭子蟹为2015年10月购于宁波路林水产市场的鲜活蟹，每只质量（200±20）g，冰藏于泡沫箱中，30 min内运至宁波市农产品保鲜工程重点实验室，通过解剖针插入口腔机械致死。
Tris-马来酸、Tris 上海Aladdin公司；ATP 美国Sigma公司；氯化钾、尿素、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、氯化钙、三氯乙酸、浓硫酸、钼酸铵、抗坏血酸、溴酚蓝等试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
CQC2L-600 UHP设备 北京速原中天股份有限公司；CR-400色差仪 日本柯尼卡美能达公司；Delta320 pH计 梅特勒-托利多（上海）仪器公司；SpectraMax i3酶标仪 美国Molecular Devices公司；BiofugeStratos型台式高速冷冻离心机 德国Thermo Scientif i c Sorvall公司；XF-D型内切式匀浆机 宁波新芝生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
将三疣梭子蟹分装在聚乙烯袋中（每袋2 只，并添加100 mL蒸馏水），密封后分别于150、200、250、300 MPa及350 MPa下常温保压5 min。不同压力条件下各处理3 袋，泄压后开袋，先进行感官评定，然后取梭子蟹腹部肌肉进行指标测定。未处理直接取肉作为对照组。
1.3.2 三疣梭子蟹感官评分
分别对三疣梭子蟹形态、体表色泽和气味进行评定，然后开壳观察肌肉组织形态和色泽。感官评定小组由6 名经专业培训后的实验人员组成，具体评分标准见表1，体表色泽、肌肉组织和气味的权重分别为0.25、0.45、0.30[10-11]。
表1 三疣梭子蟹感官评分标准
Table 1 Criteria for sensory evaluation of P. trituberculatus
1.3.3 蟹肉pH值测定
称取1 g蟹肉，加9 mL蒸馏水，充分匀浆后，室温下静置30 min，取滤液测定其pH值。
1.3.4 蟹肉色泽的测定
采用Lab模型测定三疣梭子蟹肌肉的L*、a*和b*值，L*值代表明暗度，a*值代表红绿度，b*值代表黄蓝度，ΔE参照式（1）计算，比较实验样品的色泽变化程度（ΔE值越小，表示颜色变化越小）。每块蟹肉取不同部位重复测定6 次，每组样品进行3 次平行实验。
1.3.5 肌原纤维蛋白溶液的制备
参考林娴萍等[12]方法。取2 g蟹肉，加20 mL预冷低盐缓冲溶液（含50 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris-马来酸，pH 7），充分匀浆后，10 000 r/min离心10 min，沉淀加入10 倍体积的Tris-马来酸高盐缓冲液（含0.6 mol/L KCl、20 mmol/L Tris-马来酸，pH 7），再次匀浆后提取1 h，10 000 r/min离心10 min，上清液即为肌原纤维蛋白溶液。上述过程均在4 ℃下进行，双缩脲法测定蛋白质含量。
1.3.6 肌原纤维蛋白表面疏水性的测定
参考文献[13]的方法，取上述1 mL肌原纤维蛋白溶液，加200 μL溴酚蓝（质量浓度1 mg/mL），室温下搅拌10 min，10 000 r/min离心15 min，取上清液稀释10 倍，测定595 nm波长处吸光度。以20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）作空白。表面疏水性以其所结合的溴酚蓝质量表示，计算公式如式（2）所示。
式中：A1为空白样吸光度；A2为样品液吸光度。
1.3.7 肌原纤维蛋白总巯基含量的测定
参考文献[13]的方法，取上述0.5 mL肌原纤维蛋白溶液，加4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl （pH 6.8，含8 mol/L尿素、2 g/100 mL SDS和10 mol/L乙二胺四乙酸），充分混匀后加0.5 mL 0.1 g/100 mL 5,5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）溶液（溶于0.2 mol/L Tris-HCl中，pH 8.0），40 ℃水浴中反应25 min，测412 nm波长处吸光度。空白组以0.6 mol/L KCl溶液替代，总巯基含量的计算如式（3）所示。
式中：A为412 nm波长处吸光度；N为稀释倍数。
1.3.8 肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力的测定
按文献[14]方法进行。以每分钟每毫克肌原纤维蛋白分解ATP所释放的磷酸根中磷的质量计算，钼酸铵法测定无机磷含量，以此表征Ca2+-ATPase活力。
1.4 数据分析
实验平行3～5 次，以 ±s表示。用SPSS 19.0软件分析数据，Origin 8.5软件作图。采用方差分析比较数据显著性，以p＜0.05表示差异显著。
2.1 UHP处理后蟹肉的感官评分
由图1可以看出，即死三疣梭子蟹即对照组的感官评分为10 分，通过UHP处理之后，感官评分总体呈下降趋势。在压力为150～250 MPa时，感官评分与对照组相比无显著性变化（P＞0.05）；当压力大于250 MPa时，感官评分发生显著性变化（p＜0.05），尤其是300 MPa和350 MPa处理后的蟹肉产生了微弱的熟化后特有风味，对其气味评分产生一定影响。过高的压力会导致三疣梭子蟹外壳颜色发生改变，肌肉逐渐变白、熟化，影响感官，这与UHP处理后鳙鱼肉感官评分有所上升不一致[15]。因此，利用UHP处理三疣梭子蟹，选择的压力不能过高。
图1 UHP处理对三疣梭子蟹感官评分的影响
Fig. 1 Effect of UHP on sensory evaluation of P. trituberculatus
2.2 UHP处理后蟹肉pH值的变化
图2 UHP处理对三疣梭子蟹肉pH值的影响
Fig. 2 Effect of UHP on pH of P. trituberculatus meat
如图2所示，新鲜三疣梭子蟹pH值为6.69，经过UHP处理之后均有所上升，且压力越大，pH值上升幅度越大。当压力为150～250 MPa时，pH值呈缓慢上升趋势，当压力为300 MPa和350 MPa时，pH值显著升高（p＜0.05）。这与其他学者的研究结果一致，如雒莎莎等[15]研究表明UHP处理的鳙鱼肉pH值会发生改变，压力越大，pH值越高；孟辉辉等[16]利用UHP处理毛蚶脱壳，发现UHP处理组毛蚶肉的pH值显著高于对照组；Cruz-Romero等[17]对牡蛎、Ramirez-Suarez等[18]对长鳍金枪鱼的研究中也得到类似的结果。pH值会随处理压力的增大而略有上升，原因可能是由于UHP处理有助于肉中的蛋白质、氨基酸及其他的含氮物质分解成氨、胺类等碱性物质。
2.3 UHP处理后蟹肉色泽的变化
表2 UHP处理对三疣梭子蟹肉色泽的影响
Table 2 Effect of UHP on color of P. trituberculatus meat
注：同一列肩标小写字母不同表示差异显著（p＜0.05）。
表2显示了不同压力处理后蟹肉色泽的变化情况。当压力为150～250 MPa时，白度L*值与对照组相比没有显著性变化（P＞0.05），当压力为300 MPa和350 MPa时，L*值呈显著性增长（p＜0.05）；在150 MPa和250 MPa处理后，蟹肉的红度a*值与对照组没有显著性差异（P＞0.0 5），其他压力下均发生显著性改变（p＜0.05）；经UHP处理，蟹肉的黄度b*值均发生了显著性变化（p＜0.05）；ΔE代表色泽变化程度，当压力为150 MPa和250 MPa时，ΔE较小，相较于对照组变化不明显；而当压力为200、300 MPa和350 MPa时，色泽较其余两组变化显著（p＜0.05）。
UHP处理对蟹肉白度有明显影响，主要是由于过高的压力使梭子蟹出现熟化，从而使其白度有所提高，同时由于UHP处理引起肌原纤维蛋白和肌浆蛋白变性从而使蟹肉表面颜色发生改变[19]；b*值由大到小表示由黄变蓝，b*值减小可能是由于UHP处理过程中蟹体中的血蓝蛋白发生氧化变成蓝色，但同时它也易与氧解离，使其颜色变成白色或无色，导致其b*值增大[20]；压力为200 MPa时，蟹肉的ΔE*与对照组相比发生了明显变化，主要是由于其b*值减小，但在感官上色泽并未引起明显改变。张蕾等[21]指出UHP处理对凡纳滨对虾虾仁的L*值影响较为明显，且随着压力的增大而增大，而对a*和b*值的影响不是很明显；马海建等[22]以草鱼鱼肉为原料，当压力大于等于200 MPa时，鱼肉白度增大，色泽有所改变，产生熟化外观，与本研究结果类似。因此，在压力为150～250 MPa时，UHP处理并不会对蟹肉的色泽产生较大影响。
2.4 UHP处理后蟹肉肌原纤维蛋白含量的变化
由图3可以看出，UHP处理后蟹肉的肌原纤维蛋白含量均有下降。在经过250 MPa压力处理后，其蛋白含量与对照组、150 MPa和200 MPa组相比没有发生明显变化，但与其他组之间有显著差异性（p＜0.05）。陆海霞等[23]认为高压会影响分子间的相互作用键（氢键、疏水相互作用、静电力）和蛋白质的构象，导致蛋白质变性、聚集或凝集，影响其盐溶性。李仁杰等[24]认为UHP通过压缩蛋白质分子体积，改变蛋白质分子的非共价键，引起蛋白质解聚、分子结构伸展等变化。Shoichiro等[25]也报道了当压力过高时，黑枪鱼与竹夹鱼的肌球蛋白溶解性降低。
图3 UHP处理对三疣梭子蟹肌原纤维蛋白含量的影响
Fig. 3 Effect of UHP on myof i brillar protein content of P. trituberculatus
2.5 UHP处理后蟹肉肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力的变化
图 4 UHP处理对三疣梭子蟹肌原纤维蛋白Ca2＋-ATPase活力的影响Fig. 4 Effect of UHP on Ca2+-ATPase activity of P. trituberculatus myo fi brillar protein
Ca2+-ATPase活性是反映肌球蛋白分子结构完整性的重要指标，而肌球蛋白的稳定性对整个肌原纤维蛋白的稳定性有重要影响。由图4可知，随着压力的增大，除150 MPa组和200 MPa组与对照组没有明显差异（P＞0.05），其余组蟹肉肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase的活力均显著下降（p＜0.05）。过高的压力会导致Ca2+-ATPase失活，当压力为300 MPa和350 MPa时，蟹肉肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力降低为0.004～0.005 μmol/（mg·min）。蛋白Ca2+-ATPase活力下降的原因是由于肌原纤维蛋白质中巯基被氧化，形成二硫键导致的分子聚合。Ko等[26]研究发现，当达到100 MPa以上高压时，罗非鱼肌球蛋白分子的Ca2+-ATPase活力急剧下降。也有研究认为，Ca2+-ATPase活性的丧失是由于肌肉组织内离子强度的增加、pH值下降等导致三级结构发生了改变[27]。结合后续指标，蟹肉肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力下降主要由于其巯基氧化、巯基含量快速下降所致。
2.6 UHP处理后蟹肉肌原纤维蛋白总巯基含量的变化
巯基以及二硫键的变化是维持蛋白质三级结构的主要作用力，对稳定蛋白质的构象起着非常重要的作用[28]。巯基被认为是蛋白质中最具有功能性的基团，并与Ca2+-ATPase活性相关[29]。由图5可知，随着压力的增大，蟹肉肌原纤维蛋白的总巯基含量呈现下降趋势，当压力为150 MPa和200 MPa时，总巯基含量与对照组相比没有显著性变化（P＞0.05），当压力不小于250 MPa时，其总巯基含量有显著性变化（p＜0.05）。UHP会影响分子间的相互作用和蛋白质构象，随着压力的增大，会使埋藏在分子内部的巯基暴露出来被氧化导致其总巯基含量减少。Hsu等[30]发现到压力超过200 MPa，罗非鱼肌动球蛋白总巯基含量随压力的增加而减少。研究认为肌动球蛋白头部区域结构的改变导致总巯基含量的下降，在UHP处理之后，肌动球蛋白的分子结构特别是头部区域发生构象变化，使埋藏在分子内部的巯基暴露出来，使得巯基易氧化成二硫键，从而导致总巯基含量减少和二硫键含量上升[31]。本研究中，总巯基含量的减少与Ca2+-ATPase活力下降一致，可以认为巯基发生氧化导致了总巯基含量发生不同程度的下降。
图5 UHP处理对三疣梭子蟹肌原纤维蛋白总巯基含量的影响
Fig. 5 Effect of UHP on total sulfhydryl content of P. trituberculatus myof i brillar protein
2.7 UHP处理后蟹肉肌原纤维蛋白表面疏水性的变化
图6 UHP对三疣梭子蟹肌原纤维蛋白表面疏水性的影响
Fig. 6 Effect of UHP on surface hydrophobicity of P. trituberculatus myof i brillar protein
疏水作用力是疏水基团为了避开水相而聚集在一起的相互作用力，蛋白肽链上相隔较远的氨基酸残基间的疏水作用力对稳定蛋白质的三、四级结构具有重要作用[32]。由图6可以看出，随着压力的增大，三疣梭子蟹肌原纤维蛋白表面疏水性均呈现上升趋势，相较于对照组，UHP处理组蟹肉肌原纤维蛋白的表面疏水性均呈现显著性升高（p＜0.05）。表面疏水性的增加主要由于蛋白质的降解和变性，使埋藏在内部的分子暴露出来[31]。新鲜蟹肉蛋白质的疏水基团多位于蛋白质分子内部，具有较低的表面疏水性，UHP处理后蟹肉蛋白质分子开始伸展，位于肽链内部的疏水性基团外露，导致表面疏水性上升。结合Ca2+-ATPase活性、总巯基含量的实验结果可以推测，UHP处理组蟹肉肌原纤维蛋白表面疏水性的增加可能是蛋白质的构象变化和降解及巯基氧化等多重因素引起的。
UHP处理对梭子蟹肉质品质产生了影响，蟹肉的pH值随着压力的升高而升高，300 MPa和350 MPa压力处理之后会导致三疣梭子蟹出现熟化，因此在感官品评中有熟化特有风味产生，而且会导致其白度L*值显著升高。UHP处理还会影响蟹肉肌原纤维蛋白的盐溶性，同时导致Ca2+-ATPase活力降低，当压力为300 MPa和350 MPa时，Ca2+-ATPase活力分别降低为0.004 μmol/（mg·min）和0.005 μmol/（mg·min）；随着压力的增大，蟹肉蛋白巯基含量呈现下降趋势，当压力为150 MPa和200 MPa时，总巯基含量与对照组相比没有显著性变化（P＞0.05），当压力大于等于250 MPa时，其总巯基含量有显著性变化（p＜0.05）；经过UHP处理之后的蟹肉肌原纤维蛋白表面疏水性均呈现显著性升高（p＜0.05）。综合本实验结果发现，当压力大于250 MPa时，会导致三疣梭子蟹感官、色泽、肌原纤维蛋白生化特性等理化指标出现不同程度的下降，过高的压力会导致其熟化，且不易被消费者所接受，后续将主要以150～250 MPa区间压力对三疣梭子蟹的品质影响及其保质期作进一步的研究。
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Effect of Ultra-High Pressure on Sensory and Biochemical Properties of Myof i brillar Protein from Portunus trituberculatus
ZHOU Guo1,2, YANG Wenge2, CUI Yan1, WANG Zhiyan2, YU Jingfen1, LIN Xudong1, LING Jiangang1,*
(1. Key Laboratory of Preservation of Agricultural Products of Ningbo, Ningbo Academy of Agriculture Sciences,Ningbo 315040, China; 2. Key Laboratory of Animal Protein Food Deep Processing Technology of Zhejiang Province,School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)
Abstract:In order to study the effect of ultra-high pressure treatment on the quality of freshly dead Portunus trituberculatus,changes in sensory scores, pH, color difference, myof i brillar protein content, sulphydryl content, surface hydrophobicity and Ca2+-ATPase activity were determined after high pressure treatments. Results showed that sensory scores, pH and whiteness of P. trituberculatus did not signif i cantly change at 150, 200 and 250 MPa compared with the control group (P ＞ 0.05), but signif i cant changes occurred at 300 and 350 MPa (P ＜ 0.05). Moreover, at the higher pressures crab muscle was slightly cooked, producing a unique fl avor of cooked crab. At all pressures except 250 MPa for myof i brillar protein content and except 150 and 200 MPa for Ca2+-ATPase activity, both parameters signif i cantly changed (P ＜ 0.05). No signif i cant change was observed in sulfhydryl content of crab myof i brillar protein at 150 and 200 MPa (P ＞ 0.05), whereas surface hydrophobicity was significantly increased (P ＜ 0.05) compared with the control group. Taking into account both sensory scores and biochemistry properties of myof i brillar protein, the quality of P. trituberculatus didn’t signif i cantly changed at 150, 200 or 250 MPa, which can provide a theoretical basis for further studying the effect under ultra-high pressure on the storage quality of P. trituberculatus.
Key words:ultra-high pressure; Portunus trituberculatus; sensory evaluation; myof i brillar protein; biochemical properties
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723043
中图分类号：TS254.4
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）23-0269-06
引文格式：
周果, 杨文鸽, 崔燕, 等. 超高压处理对三疣梭子蟹感官及其肌原纤维蛋白生化特性的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(23):269-274.
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723043. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-09-12
基金项目：宁波市重大农业科技攻关项目（2014C10009）；宁波市公益类重大科技专项（2015C110002）
作者简介：周果（1992—），男，硕士研究生，研究方向为水产品加工及贮藏工程。E-mail：1411085849@nbu.edu.cn
*通信作者：凌建刚（1973—），男，研究员，硕士，研究方向为农产品贮运与非热加工。E-mail：nbnjg@163.com
ZHOU Guo, YANG Wenge, CUI Yan, et al. Effect of ultra-high pressure on sensory and biochemical properties of myofibrillar protein from Portunus trituberculatus[J]. Food Science, 2017, 38(23): 269-274. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723043. http://www.spkx.net.cn