海参卵纳豆菌发酵条件及产物生物活性

王 婷1,2,温子健1,季晓彤1,2,王 玲1,2,年益莹1,2,薛 鹏1,2,孙美玲1,2,郑英雪1,姚喜山1,李冬梅1,2,张公亮1,侯红漫1,孙黎明1,2,*

(1.大连工业大学食品学院,辽宁 大连 116034;2.国家海洋食品工程技术研究中心,辽宁 大连 116034)

摘 要:为开发新的功能性海参卵产品,以刺参加工副产物——海参卵为原料,作为纳豆菌发酵基质,以溶纤酶活力作为评价标准,考察不同发酵条件对发酵产物中溶纤酶活力的影响。结果显示,最适发酵碳源为葡萄糖,其最适质量分数为2%;其他最适条件分别为初始pH 7、接种量5%、发酵温度37 ℃、装载量20%、料液比1∶30(g/mL)、摇床转速180 r/min。海参卵发酵产物经7 000 r/min离心20 min后,对上清液的部分生物活性进行了检测,结果显示上清液的溶纤酶活力较强,当总蛋白质量浓度为20 mg/mL时,上清液的溶纤酶活力为6 723 FU/mL,对血管紧张素转换酶抑制率约为90%。当总蛋白质量浓度为5~20 mg/mL时,上清液可明显延长活化部分凝血活酶时间和凝血酶时间,还可降低纤维蛋白原含量,而不影响凝血酶原时间。另外,明胶酶谱结果显示,发酵上清 液中含有多种蛋白酶。因此,海参卵纳豆菌发酵产物具有较强的溶栓、降压及抗凝血活性,对心血管疾病具有潜在的辅助治疗作用,值得进一步深入开发。

关键词:海参卵;纳豆菌;液体发酵;生物活性

海参卵是海参加工过程中的副产物,随着海参养殖和加工量的不断提高,海参卵深加工问题也日益凸显[1]。海参卵富含蛋白质、矿物质、脂肪等营养物质,可直接食用,具有改善视力、抗衰老、增强体质、预防癌症、降血压、降血糖 等生理功效[2-3]。近年来,国内学者对海参卵通过发酵、酶解等方式获得了具有特殊生理功能的活性物质,如类胡萝卜素[4]和抗氧化活性肽[5]

纳豆菌(Bacillus natto)是制备发酵食品常用的一种益生菌,可产生多种酶系[6-7]。1987年,Sumi等[8]从纳豆中提取出活性较强的溶栓物质——纳豆激酶(nattokinase,NK),促进了国内外学者对纳豆菌及其发酵产物的研究。利用纳豆菌进行发酵研究的报道很多,但对水产品的发酵研究较少。

本研究以海参卵作为发酵底物,用纳豆菌对其进行液体发酵,通过单因素试验优化发酵条件,并考察了发酵产物的溶纤活性、抗凝血活性和血管紧张素转移酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性,为开发海参卵功能性食品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻新鲜刺参卵,产自山东省烟台市。

纳豆菌(Bacillus natto),实验室保存菌株;ACE从猪肺自提。

牛纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)(74 mg/支)、凝血酶(150 BP/支)、蚓激酶标准品(12 600 U/支)中国药品生物制品检定所;98%马尿酰-组氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-his-leu,HHL)(色谱纯)、98%马尿酸(hippuric acid,HA)(色谱纯) 美国Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-5200型紫外可-见分光光度计 上海元析仪器有限公司;SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;KDN-103F凯氏定氮仪 上海纤检仪器有限公司;P1201高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪 大连依利特分析仪器有限公司;E2695 HPLC仪 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 海参卵基本成分分析

水分测定采用直接干燥法[9];总糖含量测定采用苯酚-硫酸法[10];蛋白质含量测定采用凯氏定氮法[11];粗脂肪测定采用索氏抽提法[12];灰分测定采用灼烧法[13]

1.3.2 发酵液制备

取一定质量海参卵,加蒸馏水,添加适量碳源配成发酵底物,用纳豆枯草芽孢杆菌连续发酵36 h。发酵液在4 ℃7 000 r/min离心20 min,收集上清液,-20 ℃保存,备用。

1.3.3 发酵条件优化

研究碳源类型及添加量、发酵理化因素(初始pH值、发酵温度、转速、装液量)、初始接菌量及底物添加量,共8 个因素对发酵液中溶纤酶活力的影响。

1.3.4 溶纤酶活力的测定

参考文献:[14]的方法,取0.7 mL 0.05 mol/L硼酸缓冲液于试管中,加入0.2 mL 0.72% FIB,于37 ℃水浴预保温5 min。再加入0.05 mL 1 BP/mL凝血酶,37 ℃水浴使纤维蛋白凝固,准确计时10 min,加入待测样品0.05 mL,混匀5 s,于37 ℃水浴反应,分别在20 min和40 min时,混匀5 s,60 min后,加入20%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液1 mL,充分混匀,在37 ℃水浴保温20 min后,3 000 r/min离心10 min,取上清液,12 000 r/min再次离心10 min。取上清液于275 nm波长处测定吸光度。空白组先加20% TCA混匀5 s以灭酶,然后加待测样品,其他操作相同。将蚓激酶配制成0、1、2、4、6、8 FU/μL的酶液,分别按照上述方法测定溶纤酶活力,绘制标准曲线(y=0.007 5x-0.009 3,R2=0.994 7)。样品吸光度减去空白组吸光度,代入标准曲线方程,可计算酶活力。

1.3.5 抗凝血活性的测定

抗凝血活性的测定参考文献[15-16]的方法。30 份来自大连中心医院门诊的体检健康人抗凝血,以3.8%枸橼酸钠作为抗凝剂,混合均匀,3 000 r/min离心15 min,收集血浆。将待测血浆加入试管,每管0.9 mL,加入发酵产物0.1 mL,使发酵产物的终质量浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、15.0 mg/mL。按试剂盒说明书操作,测定活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、凝血酶时间(thrombin time,TT)及FIB含量。采用肝素钠(heparin sodium,HS)作为阳性对照,生理盐水作为空白对照。

1.3.6 ACE抑制活性的测定

根据参考文献[17-18]测定ACE抑制活性。ACE溶液的配制:将自提的ACE溶于冷的1 mol/L pH 8.3硼酸盐缓冲液(含0.3 mol/L NaCl)配制成溶液,经测定浓度为0.047 U/mL。

HHL溶液的配制:以0.1 mol/L pH 8.3的硼酸盐缓冲液(含0.3 mol/L NaCl)配制成浓度为5 mmol/L HHL溶液,备用。

HA标准溶液的配制:准确称取HA标准样品,加超纯水溶解配制成浓度为50 μg/mL HA标准溶液,备用。

取25 μL样品发酵液,于1.5 mL离心管中,加入25 μL ACE溶液,旋涡振荡2 min,37 ℃保温5 min。加入50 μL底物HHL,37 ℃反应1 h。然后加入20 μL 0.2 mol/L HCl溶液终止反应。同时用25 μL水代替样品作为空白对照组。反应液过0.45 μm膜后,用HPLC检测HA生成量。

采用Ghall 12S05-2546 C18柱(250 mm×4.6 mm),洗脱液为乙腈-水(25∶75,V/V,含0.05%三氟乙酸),等梯度洗脱,流速0.5 mL/min,进样量10 μL,检测波长228 nm。ACE抑制率/%=(S对照-S样品)/S对照×100,其中S样品为加入抑制剂组中HA的峰面积,S对照为空白对照组中HA的峰面积。

1.3.7 明胶酶谱法检测发酵产物中的蛋白酶[19]

样品(含蛋白质5~75 μg)在4 ℃条件下进行非还原条件电泳。结束后,凝胶经2.5% TrionX-100洗涤复性后,于37 ℃在50 mmol Tris-HCl(pH 7)孵育24 h,考马斯亮蓝染色3.5 h,再用甲醇-冰醋酸-水(3∶1∶6,V/V)脱色1~2 h,凝胶成像。

2 结果与分析

2.1 海参卵基本营养成分

海参卵冻干粉中含有大量的蛋白质,质量分数约60.53%,粗脂肪和总糖分别占10.48%和4.49%,灰分和水分分别为10.95%和6.38%。基本营养成分与张健等[20]报道的结果相似。由此可见,海参卵是一种蛋白质含量高、同时兼有一定脂肪和糖含量的水产原料,适于用来开发生物活性蛋白和多肽。

2.2 不同发酵条件对发酵液溶纤酶活力的影响

2.2.1 碳源类型及添加量对发酵液溶纤酶活力的影响

图1 碳源类型(A)及质量分数(B)对发酵液溶纤酶活力的影响
Fig. 1 Effects of the type (A) and amount (B) of carbon source on fi brinolytic activity of the fermentation product

碳源类型及添加量直接影响微生物生长速率和代谢过程。明飞平等[21]研究发现液态发酵纳豆菌的最佳碳源为葡萄糖,其最适质量分数为2%。此外,Wang等[22]的研究也表明,葡萄糖最有利于纳豆菌的生长。由图1A可知,以葡萄糖为碳源时,所得发酵产物的溶纤酶活力较高,与其他几种碳源相比差异显著(P<0.05),这可能与葡萄糖为单糖更易吸收 利用有关。另外,麦芽糖促进纳豆菌生产纤溶酶的作用也较强。图1B显示,在葡萄糖质量分数为2%时,纳豆菌产酶活力最大,与明飞平等[21]研究报道相近。

图2 理化因素对发酵液溶纤酶活力的影响
Fig. 2 Effects of fermentation conditions on fi brinolytic activity of the fermention product

2.2.2 理化因素对发酵液溶纤酶活力的影响pH值主要通过影响菌体细胞膜电荷、膜渗透性以及物质离子化程度,从而影响菌体产酶及吸收养分等生理功能。由图2A可知,在pH 7时,纳豆菌发酵液中溶纤酶活力最高。说明纳豆菌在接近中性环境下发酵,产酶活力高。李峰等[23]利用纳豆菌发酵黄粉虫蛋白制备蛋白肽,发现在pH 7.2时最有利于纳豆菌发酵生产低分子蛋白肽;Deepak等[24]对纳豆菌生产纳豆激酶的培养条件进行了优化,发现pH 7.5时,发酵产物中纳豆激酶活力最高。适宜的温度使纳豆菌能够较好的利用底物进行发酵产酶。Lee等[14]利用纳豆菌发酵木豆制备降压活性物质,对发酵条件进行了优化,发现37 ℃条件下培养时有利于溶纤酶的产生,溶纤酶活力最高,这与本研究结果相符(图2B)。纳豆菌为好氧菌,转速、装载量影响发酵液的剪切力及其中溶氧量,进而影响菌体的生长及其产酶等代谢活动。图2C显示转速180 r/min适合纳豆菌产酶。图2D显示,随着装载量的降低,溶纤酶活力呈显著上升趋势。由此可见装载量越低,培养液中溶氧量越高,但考虑到发酵的经济性,将装载量定为20%。

2.2.3 初始接菌量及底物添加量对发酵液溶纤酶活力的影响

图3 初始接菌量(A)及料液比(B)对发酵液溶纤酶活力的影响
Fig. 3 Effects of initial inoculum size (A) and solid-to-liquid ratio on fi brinolytic activity of the fermentation product

初始接种量对菌体生长和代谢影响较大。由图3A可知,接种量5%时,发酵产物中溶纤酶活力最高。料液比影响底物溶解性、酶解反应速率及溶氧量,从而影响发酵过程。由图3B可知,料液比为1∶30时,纳豆菌发酵液中溶纤酶活力高。

2.2.4 发酵产物的溶纤活性

图4 发酵上清液蛋白质量浓度对溶纤酶活力的影响
Fig. 4 Fibrinolytic activity of the fermentation supernatant at different protein levels

如图4可知,在单因素优化后的适宜条件下进行发酵,测得发酵液上清液溶纤活性随发酵液中蛋白质量浓度的增大而显著增加。当发酵上清液蛋白质量浓度为20 mg/mL时,溶纤酶活力为6 723 FU/mL。而Deepak等[24]优化纳豆菌培养条件后,得到的最高溶纤酶活力仅为3 194.25 FU/mL。Liu Junguo等[25]也优化了纳豆菌培养条件,获得产物的最高酶活力也仅为1 300 FU/mL。本研究与上述报道中溶纤酶活力的差异可能是与发酵底物及菌种不同有关。

2.3 发酵产物的抗凝血活性

TT、PT、APTT和FIB是检测凝血功能的常见指标[26]。TT是反映凝血酶活性及F IB含量的指标,健康人TT为14.0~21.0 s;PT主要反映外源性凝血途径的功能,健康人PT在9.5~15.5 s;APTT主要反映内源性凝血途径有关因子的活性,健康人APTT为23.0~43.0 s;FIB在凝血酶的作用下转变成纤维蛋白,使血浆凝固,还可介导血小板聚集反应[27]

图5 发酵上清液对凝血时间的影响
Fig. 5 Effects of the fermentation supernatant at different protein concentra tion levels on blood coagulation time

由图5可知,与生理盐水组比较,样品质量浓度在0.5~5.0 mg/mL时,TT均显著延长,但均在正常范围内;样品蛋白质量浓度大于10 mg/mL后,TT则进一步延长并超过正常上限值。样品质量浓度在0.5~20 mg/mL时,PT均处在正常范围内;样品质量浓度为5 mg/mL以上时,APTT显著延长,样品质量浓度达到20 mg/mL时,对APTT的延 长作用接近于肝素钠;海参卵发酵产物可降低FIB质量浓度,但仍在正常范围(2~4 g/L)内。

综上,海参卵发酵液粗提物可延长APTT 和TT,显著降低血浆FIB质量浓度,但不影响 PT,且呈现一定的剂量依赖效应。APTT和TT的延长与FIB的降低密切相关,另外,发酵产物还可能通过抑制某些凝血因子及凝血酶活性而发挥抗凝作用。

2.4 发酵产物的ACE抑制活性

图6 发酵上清液ACE抑制活性的HPLC图
Fig. 6 ACE inhibitory activity of the fermentation supernatant analyzed by HPLC

图7 发酵上清液的ACE抑制活性
Fig. 7 ACE-inhibitory activity of the fermentation supernatant

图6 A、B显示,与空白对照组比较,海参卵的纳豆菌发酵上清液与ACE共同孵育后,HA生成量显著降低,说明发酵上清液能够抑制ACE的活性。图7显示,随着发酵上清液蛋白质量浓度的增加,ACE抑制率逐渐升高,当蛋白质量浓度达到20 mg/mL时,ACE抑制率为90%。利用纳豆菌发酵制备ACE抑制功能食品已有较多报道,纳豆菌发酵产物的ACE抑制活性大多来自于发酵产物中多肽类物质[29-30]。因此,海参卵发酵产物的ACE抑制活性很可能也来自于海参卵多肽。海参卵发酵产物中ACE抑制活性肽的进一步分离纯化及氨基酸序列分析将有助于阐明海参卵发酵产物ACE抑制活性的作用机制。

2.5 发酵产物中的蛋白酶检测结果

图8 明胶酶谱法检测发酵上清液中的蛋白酶
Fig. 8 Prote ases present in the fermentation supernatant on observed by zymography

由图8可知,海参卵发酵产物中含有多种蛋白酶,其种类与黄豆纳豆菌发酵产物中的蛋白酶相似。在高分子质量区域,海参卵与黄豆发酵产物中蛋白酶的活性均较强,但在中、低分子质量区域,海参卵发酵产物中的蛋白酶活性较低。这些蛋白酶的存在提示海参卵很有可能被酶解成小分子多肽而使发酵产物具有较强的ACE抑制活性。

3 结 论

本研究采用单因素法优化了海参卵纳豆菌发酵的最适条件,发酵碳源为葡萄糖,最适葡萄糖质量分数2%、初始pH 7、接种量5%、发酵温度37 ℃、装载量20%、料液比1∶30(g/mL)、摇床转速180 r/min。发酵产物具有一定的溶纤活性和较强的ACE抑制活性并可明显延长APTT和TT,降低FIB质量浓度,但不影响PT。同时,发酵产物含有多种蛋白酶。因此,海参卵纳豆菌发酵产物具有较强的溶栓、降压及抗凝血活性,对心血管疾病具有潜在的辅助治疗作用。

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Investigation of Fermentation Conditions for Fibrinolysin Production from Sea Cucumber Ovum by Bacillus natto and Bioactive Activity of the Fermentation Product

WANG Ting1,2, WEN Zijian1, JI Xiaotong1,2, WANG Ling1,2, NIAN Yiying1,2, XUE Peng1,2, SUN Meiling1,2, ZHENG Yingxue1, YAO Xishan1, LI Dongmei1,2, ZHANG Gongliang1, HOU Hongman1, SUN Liming1,2,*
(1. School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 2. National Engineering Research Cente r of Seafood, Dalian 116034, China)

Abstract:This study aimed to develop a new functional product by fermenting sea cucumber ovum, a by-product of sea cucumber processing, with Bacillus natto. Fibrinolysin (FIB) activity was measured as an index to optimize the fermentation condition. Results showed that the optimum carbon source was glucose at a concentration of 2%. The optimized results of other fermentation parameters were as follows: initial pH, 7; inoculum amount, 5%; fermentation te mperature, 37 ℃; medium loading volume, 20%; solid-to-liquid ratio, 1:30 (g/mL); and rotational speed, 180 r/min. The fermentation supernatant, collected after centrifugation at 7 000 r/min for 20 min, demonstrated FIB activity as high as 6 723 FU/mL and ACE inhibition activity with a high inhibition percentage of 90% at a fi nal protein concentration of 20 mg/mL. The time required for partial activation of thromboplastin and the thrombin time were signifi cantly extended by the supernatant when the protein level was 520 mg/mL, and it also decreased FIB content while having no infi uence on prothrombin time. Furthermore, some prot eases in the supernatant were observed by zymograph y. Therefore, the fermentation product of sea cucumber ovum showed relatively strong thrombolytic, antihypertensive and anticoagulation activities, demonstrating a potential auxiliary therapeutic agent for cardiovascular disease. Hence, it deserved further development.

Key words:sea cucumber ovum; Bacillus natto; submerged fermentation; bioactivity

引文格式:

引文格式:

王婷, 温子健, 季晓彤, 等. 海参卵纳豆菌发酵条件及产物生物活性[J]. 食品科学, 2017, 38(8): 43-48. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201708008. http://www.spkx.net.cn

WANG Ting, WEN Zijian, JI Xiaotong, et al. Investigation of fermentation conditions for fi brinolysin production from sea cucumber ovum by Bacillus natto and bioactive activity of the fermentation product[J]. Foo d Science, 2017, 38(8): 43-48. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201708008. http://www.spkx.net.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201708008

中图分类号:TS254.9

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)08-0043-06

收稿日期:2016-07-12

基金项目:辽宁省自然科学基金项目(2015020794);辽宁省优秀人才项目(LJQ2012048)

作者简介:王婷(1990—),女,硕士研究生,主要从事水产食品加工与活性物质研究。E-mail:254087063@qq.com

*通信作者:孙黎明(1974—),女,教授,博士,主要从事水产品产品加工、质量控制及活性物质研究。

E-mail:sunlm1974@163.com