SPME-GC-MS结合ROAV分析单菌及复配发酵牛乳中关键性风味物质

王 丹，丹 彤，孙天松，张和平，孟和毕力格*

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018）

摘 要：采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术检测分析Streptococcus thermophilus与Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus单菌及复配发酵牛乳中的挥发性风味物质，结合相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）探讨发酵牛乳中关键性风味物质。结果表明：本实验共鉴定出100 种挥发性风味物质，包括酸类、酮类、醛类、醇类、酯类、烷烃类和芳香族类化合物等。主成分分析表明，表征S. thermophilus单菌发酵乳的关键性风味物质是双乙酰、正壬醛和甲苯；表征L. bulgaricus单菌发酵乳的关键性风味物质是正庚醛、丁酸-2-甲基丙酯和1-庚醇；表征S. thermophilus与L. bulgaricus复配发酵乳的关键性风味物质是乙醛、3-甲基正丁醛、乙偶姻、2-壬酮、2-庚酮、醋酸乙烯酯、碳酸庚基苯基酯、甲酸乙烯酯和2-壬醇。相较于单菌发酵，复配发酵的风味物质组成、各组分相对含量及关键性风味物质均发生改变。

关键词：发酵牛乳；关键性风味物质；固相微萃取-气相色谱-质谱联用；主成分分析

1982年，Marshall等[1]就对发酵乳中的风味物质进行了研究，并将这些风味物质归类为碳氢化合物、醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、内酯类、含硫化合物、吡啉与呋喃衍生物等。发酵剂是发酵乳产酸和产香的基础及原因，发酵剂菌株的质量与活力对发酵乳产风味物质的数量与含量起关键性的作用。固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）技术具有灵敏度高、检出限低、分析范围广、萃取条件温和等特点，可直接与气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用。近年来SPME技术在食品风味分析如酿造醋[2]、红酒[3]、果蔬[4]等中的应用越来越广泛。为了解Streptococcus thermophilus与Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus单菌及复配发酵牛乳样品中挥发性风味物质组成及含量。本实验利用SPME-GC-MS检测分析单菌及复配发酵牛乳中挥发性风味物质，采用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）探讨分析发酵乳中的关键性风味物质，利用主成分分析法探究表征单菌及复配发酵牛乳样品关键挥发性风味物质。为今后进一步探究发酵牛乳中关键挥发性风味物质及风味物质形成机理提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

11.5 %全脂乳粉 美国Fonterra公司；M17液体培养基（CM0817）、MRS液体培养基（CM1175） 英国Oxoid公司。

本实验所用的发酵菌株如表1所示，由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。

表1 菌株及对应GenBank号Table 1 GenBank accession numbers of strains analyzed in this study

菌株GenBank号S. thermophilus G80-3HM059002 S. thermophilus QH46-3-2FJ749401 L. bulgaricus MGB38-4HM 058125 L. bulgaricus MGB44-3HM058146

1.2 仪器与设备

7890A-5977B GC-MS联用仪、色谱柱为HP-5毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；手动固相微萃取进样手柄、50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/ polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 全脂乳的制备

取适量蒸馏水加热至50 ℃，加入11.5%全脂乳粉（乳糖质量分数39.1%，脂肪质量分数26.8%，蛋白质质量分数25.0%，水分质量分数3.3%）溶解搅拌，当水温升至60 ℃时加入质量分数6.5%蔗糖，充分混合并在60 ℃时水合30 min，使得全脂乳的成分组成为：碳水化合物质量分数11%，脂肪质量分数3.1%，蛋白质质量分数2.9%。随后在均质温度为65 ℃，均质压力为低压15 MPa和高压35 MPa的条件下均质2 次。参照谢爱英等[5]对不同巴氏杀菌条件下酸奶品质影响的研究结果，将均质好的全脂乳在95 ℃巴氏杀菌5 min。随后将全脂乳急冷，置于4 ℃备用。

1.3.2 单菌发酵牛乳的制备

将冷冻干燥保藏的6 株菌株于脱脂乳培养基（10%脱脂乳、0.1%酵母粉）中活化，S. thermophilus和L. bulgaricus分别用M17液体培养基和MRS液体培养基活化3 代，使菌株活力达到最大。将菌株分别连续扩大培养于50 mL和500 mL M17和MRS液体培养基中，收集菌体并制备菌悬液。将菌悬液以5×107CFU/mL接种于1.3.1节制备的全脂乳中，并分装于样品瓶中。将样品乳置于42 ℃培养箱中静置培养，待pH值达到4.5时转移至4 ℃冰箱，待温度降至4 ℃后，进行SPME-GC-MS检测分析。

1.3.3 复配发酵乳的制备

将1.3.1节中的2 株S. thermophilus与2 株L. bulgaricus随机配对成2 组，将S. thermophilus与L. bulgaricus以活菌数1∶1的比例，以5×107CFU/mL接种于均质后的全脂乳中。将样品乳置于42 ℃培养箱中静置培养，待pH值达到4.5时转移至4 ℃冰箱，待温度降至4 ℃后，进行SPMEGC-MS检测分析。

1.3.4 挥发性风味物质测 定

GC条件：HP-5毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用程序升温方式，起始温度35 ℃，保持5 min，以5 ℃/min的速率上升至140 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率上升至250 ℃，保持3 min；汽化室温度为250 ℃；载气为He，流速1.0 mL/min；不分流进样。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描范围m/z 33～450；发射电流100 μA。

萃取条件：萃取头老化温度为250 ℃；老化时间为15 min；平衡温度50 ℃；平衡时间60 min；250 ℃解吸附3 min。

1.3.5 定性与定量分析

利用随机携带Masshunter工作站NIST 11标准库自动检索各组分质谱数据，利用面积归一化法计算各组分峰面积百分比（相对含量）。

1.3.6 关键挥发性物质评价

参照刘登勇等[6]的方法，采用ROAV法确定发酵牛乳中关键挥发性风味物质。首先定义对样品风味贡献最大的组分为ROAVmax=100，对其他香气成分则有：

式中：Ci和Ti分别为各挥发性物质的相对含量/%和相对应的感觉阈值/（μg/L）；Cmax和Tmax分别为对样品总体风味贡献最大组分的相对含量/%和相对应的感觉阈值/（μg/L）。

所有组分ROAV不大于100，而且ROAV越大的组分对样品总体风味的贡献也就越大。一般认为ROAV不小于1的组分为所测样品的关键风味化合物，0.1≤ROAV＜1的组分对所测样品的总体风味具有重要修饰作用[6-7]。

1.4 数据处理

利用SPSS 19.0软件作为数据分析工具进行主成分分析处理，具体步骤参照张文彤[8]的方法。利用Origin 7.5软件做柱状图和主成分载荷图。

2 结果与分析

2.1 单菌及复配发酵牛乳中挥发性风味物质检测分析

采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，对单菌及复配发酵牛乳中的挥发性风味物质进行富集，利用GC-MS技术对发酵牛乳的风味物质进行检测分析，得到样品挥发性成分的GC-MS总离子流图，如图1所示。经NIST 11标准库检索各组分挥发性成分，利用面积归一化法计算各组分相对峰面积百分比，如表2所示。除去萃取头带来的少量硅氧烷类杂质峰，本实验中2 种S. thermophilus单菌发酵样品，2 种L. bulgaricus单菌发酵样品及2 种S. thermophilus与L. bulga ricus复配发酵样品共检测出100种挥发性物质，包括酸类、酮类、醛类、醇类、酯类、烷烃类、芳香族类化合物等。其中51 种物质仅在个别样品中被检测到，占总峰面积的7.91%，49 种物质是各实验样品的共有组分，占总峰面积的90.37%，这些物质可能是发酵牛乳的关键性风味物质，如图2所示。

图1 单菌及复配发酵牛乳样品中挥发性成分总离子流图
Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatograms of volatiles extracted from fermented cow milk produced by pure and mixed cultures by SPME-GC-MS

表2 单菌及复配发酵牛乳样品中挥发性风味物质SPME-GC-MS分析结果
Table 2 Major volatile compounds extracted from fermented cow milk produced by pure and mixed cultures by SPME-GC-MS

序号中文名称英文名称分子式阈值a/（μg/L）MGB44- 3和QH46-3-2 1 1-己醇1-hexanolC6H14O250[9]9.173.210.241.615.160.450.70 2 2-庚酮2-heptanoneC7H14O140[10]9.9114.4719.345.138.3320.7219.77 3甲氧基苯肟oxime-, methoxy-phenyl-C8H9NO210.996.8811.125.193.230.515.41 4苯甲醛benzaldehydeC7H6O850[10]12.432.170.530.751.200.731.00 5 1-庚醇1-heptanolC7H16O41[11]12.945.910.571.606.120.730.48 6辛酸octanoic acidC8H16O2500[12]19.752.003.870.821.301.872.10 7 2-十一酮2-undecanoneC11H22O255[11]22.991.381.210.460.790.831.12 8氨基甲酰肼hydrazinecarboxamideCH5N3O1.24——3.303.35——9（＋/－）-2-胺基-1-丙醇1-propanol, 2-amino-, (+/-)-C3H9NO1 000[11]1.41——3.16——10乙醛acetaldehydeC2H4O8.7[10]1.4323.445.12——15.206.11 112,3-丁二酮（双乙酰）2,3-butanedioneC4H6O22.3[11]1.90——3.9120.29——12乙酸acetic acidC2H4O222 000[13]2.496.614.526.021.938.47—132,3-戊二酮2,3-pentanedioneC5H8O2378[11]2.97——1.806.59——14乙偶姻acetoinC4H8O255[13]3.68——11.0311.6019.0712.32 151-氯-正戊烷pentane, 1-chloro-C5H11Cl5.492.090.31——0.38 16丁酸butanoic acidC4H8O2240[11]6.56—1.22——0.98 17丁酸-2-甲基丙酯butanoic acid, 2-methylpropyl esterC8H16O21.6[14]6.781.15——18对二甲苯p-xyleneC8H108.780.32—1.340.250.24—192-壬醇2-nonanolC9H20O28[13]17.550.420.59——0.290.51 20甲酰胺formamideCH3NO1 520[15]1.54——32.37 21甲苯tolueneC7H8200[14]4.980.78—10.14——22庚醛heptanalC7H14O5 000[11]10.331.10—0.22—0.36—23己酸hexanoic acidC6H12O23 000[10]13.884.345.190.93—3.533.11 24苯乙酮acetophenoneC8H8O65[13]16.030.38——0.57——25正壬醛nonanalC9H18O15[11]16.92——0.30——262-壬酮2-nonanoneC9H18O5[13]17.097.298.062.815.286.1610.24 27δ-壬内酯δ-nonalactoneC9H16O2400[10]28.31——0.250.30—0.41 28环氧乙烷ethylene oxideC2H4O1.302.61——29甲酸乙烯酯formic acid, ethenyl esterC3H4O29[13]1.86—20.79——3.59 30醋酸乙烯酯acetic acid ethenyl esterC4H6O27.5[11]2.09——7.28—31醋酸铵ammonium acetateC2H7NO22.46——5.06 323-羟基丁醛butanal, 3-hydroxy-C4H8O227[13]2.760.47——0.29—333-甲基正丁醛butanal, 3-methyl-C5H10O30[11]2.91——2.59—343-甲基-2-丁酮2-butanone, 3-methyl-C5H10O1 440[12]3.042.25——0.26——352-戊酮2-pentanoneC5H10O2 150[13]3.11—5.23—1.532.331.85 36碳酸庚基苯基酯carbonic acid, heptyl phenyl esterC14H20O350[10]4.570.40——0.30—371-氯-3-甲基丁烷butane, 1-chloro-3-methyl-C5H11Cl5.34——2.01—38（E）-2-戊烯醇(E)-2-pentenalC5H8O1.2[9]5.72——0.21—0.48—39正庚醛hexanalC6H12O3[10]6.371.52——403-甲基丁酸butanoic acid, 3-methyl-C5H10O2200[11]8.91——1.24—411-辛醇1-octanolC8H18O110[13]16.60—0.40——0.68 421-壬醇1-nonanolC9H20O50[14]19.390.63——0.73——432,4-二甲基苯甲醛benzaldehyde, 2,4-dimethyl-C9H10O850[9]20.62——1.29—2.20 44苯并噻唑benzothiazoleC7H5NS80[10]20.85——0.34—1.46 45正十三烷tridecaneC13H2822.690.32—1.10——462,4,5-三甲基苯甲醛benzaldehyde, 2,4,5-trimethyl-C10H12O750[11]23.09——0.24—0.34 47正癸酸N-decanoic acidC10H20O23 000[10]24.820.35——486-戊基-2H-四氢吡喃-2-酮2H-pyran-2-one, tetrahydro-6-pentyl-C10H18O2300[11]28.590.65——49二氢-4,4-二甲基-2（H）-呋喃酮2(H)-furanone, dihydro-4,4-dimethyl-C6H10O20.6[11]28.88—0.56——0.48—50乙醇ethanolC2H6O1.38——11.57——51甲氧基-乙醛acetaldehyde, methoxy-C3H6O21.46——6.86——52二甲胺dimethylamineC2H7N1.54—7.21——532-己氧基-乙醇ethanol, 2-(hexyloxy)-C8H18O22.33—1.76——参考文献保留时间/min相对含量/% MGB38-4 MGB44-3G80-3QH46-3-2MGB38-4和G80-3

续表2

注：a.指各物质在水中的阈值；—.未检测出该物质，表3同。

序号中文名称英文名称分子式阈值a/（μg/L）MGB44- 3和QH46-3-2 54甲酸异丁酯formic acid, butyl esterC5H10O22.50——0.32——55乙酸-2-[2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基]乙醇参考文献保留时间/min相对含量/% MGB38-4 MGB44-3G80-3QH46-3-2MGB38-4和G80-3 ethanol, 2-[2-(2-methoxyethoxy) ethoxy]-, acetateC9H18O52.54——1.85——561-戊烯-3-醇1-penten-3-olC5H10O2.75——0.29——57戊烷pentaneC5H122.83—0.97——58乙酸酐acetic anhydrideC4H6O33.05——0.35—59庚烷heptaneC7H143.45——3.14 603-甲基丁醇1-butanol, 3-methyl-C5H14O3.79——0.24——611-亚甲基环丙基乙醇ethanol, 1-(methylencyclopropyl)-C6H10O3.90——0.31——62二硫乙烷disulfi de, dimethylC2H6S24.58—0.47——631-戊醇1-pentanolC5H12O4.75——2.57——64碳酸乙基己酯carbonic acid, ethyl hexyl esterC9H18O35.51——0.14——653-丙基-4-羟基-2-己酮2-hexanone, 4-hydroxy-3-propyl-C9H18O25.53——0.20——662-甲基-3-戊醇3-pentanol, 2-methyl-C6H14O5.96——2.53——674-乙基苯甲酰胺4-ethylbenzamideC9H11NO5.96——6.41——681-丙氧基-2-丙醇2-propanol, 1-propoxy-C6H14O25.99——69丁酸乙酯butanoic acid, ethyl esterC6H12O26.04——4.34——702-羟基-3-戊酮2-hydroxy-3-pentanoneC5H10O26.27——1.41——71戊酸pentanoic acidC5H10O26.330.91——72乙酸丁酯acetic acid, butyl esterC6H12O26.58——0.39——73乙苯ethylbenzeneC8H108.18——0.62——743,4-二甲基-1-戊醇1-pentanol, 3,4-dimethyl-C7H16O8.19——0.26—751,3,5,7-环辛四烯1,3,5,7-cyclooctatetraeneC8H89.33——0.25——764-甲基-2-己酮2-hexanone, 4-methyl-C7H14O9.74——0.21——773-甲基-2-己醇2-hexanol, 3-methyl-C7H16O10.58—0.24——78（＋）-4-蒈烯(+)-4-careneC10H1610.93——0.29——79（E）-2-辛烯-1-醇(E)-2-octen-1-ol C8H16O12.80——0.21——802-甲基二氢化咪唑-3（2H）-噻吩酮3(2H)-thiophenone, dihydro-2-methyl-C5H8OS12.93——1.15——81己酸乙酯hexanoic acid, ethyl esterC8H16O213.53——0.55——823-庚烯酸3-heptenoic acidC7H12O214.110.38——834-乙基-1-辛炔-3-醇1-octyn-3-ol, 4-ethyl-C10H18O14.52——0.18——841-羟基-2-壬烯2-nonen-1-olC9H18O14.52——0.23——85（Z）-3,4-二甲基-3-己烯-2-酮3-hexen-2-one, 3,4-dimethyl-, (Z)-C8H14O14.83——0.22——862-乙基正乙醇1-hexanol, 2-ethyl-C8H18O15.22—0.27——87（E）-2-辛烯醛(E)-2-octenalC8H14O15.38——88（Z）-5-十三烯(Z)-5-trideceneC13H2615.44——0.28——89（E,E）-3,5-辛二烯醛-2-酮(E,E)-3,5-octadien-2-one C8H12O15.88——0.93——90（E）-3-壬烯-1-醇(E)-3-nonen-1-ol C9H18O15.91——2.99——912-壬炔2-nonyneC9H1616.602.58——92正十一烷undecaneC11H2416.82——0.38——933,4-二甲基环乙醇3,4-dimethylcyclohexanolC8H16O17.01——0.26——942,5-二甲基环己醇2,5-dimethylcyclohexanolC8H16O17.760.30——95环己烷羧酸cyclohexanecarboxylic acidC7H12O218.24——0.80—961,2-15,16二环氧基十六烷1,2-15,16-diepoxyhexadecaneC16H30O219.04——0.32——97正十二烷dodecaneC12H2619.87——0.95——981-甲基丙基-硫-环己烷cyclohexane, [(1-methylpropyl)thio]-C10H20S20.10——0.42——993-甲基-4-亚甲基-2-己酮2-hexanone, 3-methyl-4-methylene-C8H14O23.13—0.21——1006-甲基十八烷octadecane, 6-methyl-C19H4025.34——0.15——

在S. thermophilus单菌发酵牛乳中共检测出63 种挥发性风味物质，在L. bulgaricus单菌发酵牛乳样品中共检测出43 种风味物质，在复配发酵牛乳样品共检测出38 种风味物质。从图2可以看出，S. thermophilus单菌发酵产生的酮类、醛类、醇类、酯类和烃类化合物的数量明显高于L. bulgaricus单菌发酵产生的数量。在本实验中，2 株S. thermophilus发酵均产生了双乙酰、乙偶姻、2,3-戊二酮、氨基甲酰肼、δ-壬内酯等挥发性物质，而这些物质没有在L. bulgaricus单菌发酵牛乳中检出，风味物质组成及各组分相对含量的不同体现了乳酸菌种间的差异性；2 株L. bulgaricus发酵都产生了乙醛，而在S. thermophilus单菌发酵乳中没有检出该物质，这与Andreas等[16]报道的结果较一致，而Chaves等[17]认为S. thermophilus具有更强的产乙醛的能力，这可能与菌株间的差异性有关。

图2 单菌及复配发酵牛乳中各类挥发性物质数量
Fig. 2 Numbers of volatile compounds extracted from fermented cow milk produced by pure and mixed cultures

2.2 ROAV鉴定关键性风味物质

发酵牛乳的风味是由各挥发性物质的阈值与其在风味体系中的浓度共同决定的，为进一步确定发酵牛乳的关键性风味物质，结合表2所示的共有组分的相对含量和感觉阈值，确定各组分的ROAV如表3所示。

在S. thermophilus单菌发酵牛乳中，共有8 种挥发性风味物质的ROAV不小于1，分别为双乙酰、正壬醛、2-庚酮、2-壬酮、乙偶姻、甲苯、（E）-2-戊烯醇和1-庚醇，这些物质是S. thermophilus单菌发酵样品的关键挥发性物质。共有6 种风味物质（0.1≤ROAV＜1）对S. thermophilus单菌发酵样品总体香气具有重要修饰作用。双乙酰赋予发酵乳奶油香味[18]；2-壬酮赋予发酵乳果香、清香及奶油的气息[19]；乙偶姻赋予发酵乳奶香气、微甜和乳脂气息[20]；壬醛具有脂肪香[21]。在L. bulgaricus单菌发酵牛乳中共有7 种挥发性风味物质的ROAV不小于1，分别为正庚醛、乙醛、2-庚酮、2-壬酮、1-庚醇、甲酸乙烯酯和丁酸-2-甲基丙酯，这些物质是L. bulgaricus单菌发酵样品的关键挥发性物质；共有12 种风味物质（0.1≤ROAV＜1）对L. bulgaricus单菌发酵样品总体香气具有重要修饰作用。乙醛赋予酸奶清爽的芳香味[18]；庚醛具有蜡香及脂肪香[22]。丹彤等[23]报道通常酸奶中的乙醛主要由L. bulgaricus发酵产生，双乙酰主要由S. thermophilus发酵产生，与本实验检测到的结果较一致。在复配发酵牛乳中共有10 种挥发性风味物质的ROAV不小于1，分别为乙醛、3-甲基正丁醛、2-庚酮、乙偶姻、2-壬酮、甲酸乙烯酯、醋酸乙烯酯、1-庚醇、2-壬醇和（E）-2-戊烯醇，这些物质是复配发酵样品的关键性挥发性物质，共有11 种风味物质（0.1≤ROAV＜1）对复配发酵样品总体香气具有重要修饰作用。

表3 单菌及复配发酵牛乳中关键性风味物质及对应ROAV
Table 3 ROAV of key aroma compounds in fermented cow milk produced by pure and mixed cultures

注：序号和表2中的序号一致。

序号中文名称英文名称分子式ROAV MGB38-4 MGB44-3 G80-3 QH46-3-2MGB38-4和G80-3 MGB44-3和QH46-3-2 11-己醇1-hexanolC6H14O0.480.040.380.230.100.18 22-庚酮2-heptanoneC7H14O3.844.982.150.678.479.37 4苯甲醛benzaldehydeC7H6O0.090.020.050.020.050.08 51-庚醇1-heptanolC7H16O5.350.502.291.691.722.39 6辛酸octanoic acidC8H16O20.150.280.100.030.210.28 72-十一酮2-undecanoneC11H22O0.200.170.110.040.190.29 10乙醛acetaldehydeC2H4O100100——100100 112,3-丁二酮（双乙酰）2,3-butanedioneC4H6O2——100100——132,3-戊二酮2,3-pentanedioneC5H8O2——0.280.20——14乙偶姻acetoinC4H8O2——11.802.3919.85—16丁酸butanoic acidC4H8O2—0.18——0.27 17丁酸-2-甲基丙酯butanoic acid, 2-methylpropyl esterC8H16O226.63——192-壬醇2-nonanolC9H20O0.550.76——1.011.21 20甲酰胺formamideCH3NO——0.98 21甲苯tolueneC7H80.14—2.98——24苯乙酮acetophenoneC8H8O0.21——0.10——25正壬醛nonanalC9H18O——1.16——262-壬酮2-nonanoneC9H18O54.1358.1433.0711.9770.5482.88 29甲酸乙烯酯formic acid, ethenyl esterC3H4O2—7.17——26.44 30醋酸乙烯酯acetic acid ethenyl esterC4H6O2——55.54—323-羟基丁醛butanal, 3-hydroxy-C4H8O20.64——0.61—333-甲基正丁醛butanal, 3-methyl-C5H10O——4.94—352-戊酮2-pentanoneC5H10O—0.09—0.010.060.06 36碳酸庚基苯基酯carbonic acid, heptyl phenyl esterC14H20O30.29——0.35—38（E）-2-戊烯醇(E)-2-pentenal C5H8O——10.15—23.10—39正庚醛hexanalC6H12O18.79——403-甲基丁酸butanoic acid, 3-methyl-C5H10O2——0.36—411-辛醇1-octanolC8H18O—0.13——0.41 421-壬醇1-nonanolC9H20O0.47——0.17——432,4-二甲基苯甲醛benzaldehyde, 2,4-dimethyl-C9H10O——0.02—0.17 49二氢-4,4-二甲基-2（H）-呋喃酮2(H)-furanone, dihydro-4,4-dimethyl-C6H10O2—0.34——0.46—

刘南南等[24]利用SPME技术结合GC-MS检测分析酸牛奶中挥发性成分，发现对酸奶风味影响较大的物质可能有乙酸、丁酸、乙偶姻、2-壬酮、2-十一酮和壬醛等，与本实验检测到的关键性风味物质结果较一致。牛云蔚等[25]利用SPME-GC-MS技术对市售5 种不同品牌酸奶挥发性成分进行检测分析，发现2,3-丁二酮（双乙酰）、乙酸己酯、乙醛、3-羟基-2-丁酮（乙偶姻）、丁酸和辛酸等是构成酸奶风味的主要物质，与本实验检测到的关键性风味物质结果较一致。王伟君等[26]利用唾液链球菌嗜热亚种（Streptococcus salivariussubsp. thermophilus）单菌发酵测得样品的主要呈味物质是2,3-丁二酮和2,3-戊二酮，与本实验在S. thermophilus单菌发酵样品中检测到的结果较一致，2,3-丁二酮是S. thermophilus单菌发酵样品的关键性风味物质，2,3-戊二酮对样品的总体香气有重要修饰作用。Beshkova等[27]研究检测S. thermophilus与L. bulgaricus单菌及复配发酵乳的挥发性风味物质，发现在到达发酵终点1.5 h后，S. thermophilus单菌发酵产生乙偶姻，而在L. bulgaricus单菌发酵乳中并未检测出该物质，与本实验结果较一致，2 种发酵剂发酵产生的挥发性风味物质组成及各组分相对含量的不同，体现了乳酸菌在种间的差异性。而同一种属不同菌株发酵产生的挥发性物质的相对含量及ROAV存在一定差异，体现了菌株间的差异性。

S. thermophilus与L. bulgaricus以1∶1的比例复配发酵后，样品的挥发性风味物质组成及各组分相对含量与单菌发酵相比发生很大变化，如2-庚酮和乙偶姻的相对含量均高于单菌发酵乳；醋酸乙烯酯和醋酸铵等物质在复配发酵乳中相对含量较高而在单菌发酵乳中未检测出该物质。这可能与S. thermophilus和L. bulgaricus间的互相作用有关，Sieuwerts等[28]研究报道S. thermophilus产生的丙酮酸、甲酸、叶酸、鸟氨酸、CO2和长链脂肪酸等物质能够促进L. bulgaricus的生长；Courtin等[29]报道由L. bulgaricus的细胞壁结合蛋白酶（PrtB）的蛋白水解作用产生的肽类、氨基酸以及腐氨又刺激了S. thermophilus的生长。这种共生作用可能是使某些挥发性风味物质相对含量升高的原因。李莎等[30]报道将具有优良性状的S. thermophilus与L. bulgaricus菌株复配发酵，发现复配发酵在产胞外多糖、黏度、口感和风味方面均强于单菌发酵。1-己醇、甲氧基苯肟、1-庚醇和甲苯等物质在单菌发酵乳中相对含量较高，但在复配发酵乳中这些物质的相对含量下降或未检出该物质，这可能由于单菌发酵产生的某些挥发性物质在复配发酵过程中作为中间产物被利用或分解。

2.3 关键性风味物质的主成分分析

表4 主成分特征值及方差贡献率
Table 4 Eigenvalues of principal components and their variance contributions

主成分特征值方差贡献率/%累计方差贡献率/% 111.65 37.58 37.58 27.68 24.77 62.35 37.51 24.23 86.58 42.91 9.40 95.97 51.25 4.03 100.00

对表3中31 种挥发性风味物质（ROAV≥0.1）进行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，如表4所示，风味物质主成分载荷图如图3所示。由图3A可知，发酵牛乳样品载荷图的左、右半区域对S. thermophilus与 L. bulgaricus单菌及复配发酵牛乳有较好的区分。样品在载荷图上距离越近其香气组成及相对含量的相似度越高，S. thermophilus单菌发酵牛乳能够聚在一起，体现了S. thermophilus菌株发酵产生风味 物质的共性，并且与L. bulgaricus单菌 发酵牛乳有较好的区分，体现了乳酸菌种间的差异性。由图3B可知，单菌发酵产生的挥发性风味物质，如正壬醛、苯乙酮、甲苯和1-己醇，与主成分1呈现较强的负相关。而S. thermophilus与L. bulgaricus复配发酵产生的挥发性风味物质，如乙醛、2-十一酮、2-壬酮、2-戊酮、二氢-4,4-二甲基-2（H）-呋喃酮、丁酸、辛酸、2-壬醇、2-壬醇和甲酰胺，与主成分1呈现较强的正相关，反映了复配后关键挥发性风味物质的组成及相对含量发生了较大的变化，这可能与菌株间的相互作用有关。结合图3可知，表征S. thermophilus单菌发酵乳的关键性风味物质（ROAV≥1）是双乙酰、正壬醛和甲苯，起重要修饰性作用的物质（0.1≤ROAV＜1）是2,3-戊二酮；表征L. bulgaricus单菌发酵乳的关键性风味物质是正庚醛、丁酸-2-甲基丙酯和1-庚醇，起重要修饰性作用的物质有1-壬醇、苯乙酮和1-己醇；表征复配发酵乳的关键性风味物质是乙醛、3-甲基正丁醛、乙偶姻、2-壬酮、2-庚酮、醋酸乙烯酯、碳酸庚基苯基酯、甲酸乙烯酯和2-壬醇，起重要修饰性作用的物质为辛酸、2-十一酮和3-甲基丁酸等。丹彤等[23]报道，乙醛是在发酵乳中起关键作用的重要挥发性风味物质之一，与本实验检测到乙醛是表征复配发酵乳的关键性风味物质之一的结果较一致。

图3 发酵牛乳样品（A）和关键挥发性风味物质（B）主成分载荷图
Fig. 3 Principal component analysis loading plots of fermented cow milk (A) and key volatile compounds (B)

3 结 论

采用SPME-GC-MS技术检测S. thermophilus与L. bulgaricus单菌及复配发酵牛乳样品中挥发性风味物质，共鉴定出100 种挥发性成分，包括酸类、酮类、醛类、醇类、酯类、烷烃类和芳香族类化合物等。结合ROAV探讨单菌及复配发酵牛乳的关键性风味物质。利用主成分分析法确定表征S. thermophilus单菌发酵乳的关键性风味物质（ROAV≥1）是双乙酰、正壬醛和甲苯；表征L. bulgaricus单菌发酵乳的关键性风味物质是正庚醛、丁酸-2-甲基丙酯和1-庚醇；表征S. thermophilus与L. bulgaricus复配发酵乳的关键性风味物质是乙醛、3-甲基正丁醛、乙偶姻、2-壬酮、2-庚酮、醋酸乙烯酯、碳酸庚基苯基酯、甲酸乙烯酯和2-壬醇。相较于单菌发酵，复配发酵的风味物质组成、各组分相对含量及关键性风味物质均发生改变。

参考文献：

[1] MARSHALL V. Flavour compounds in fermented milks[J]. Perfumer and Flavorist, 1982(7): 27-34.

[2] ZHU H, ZHU J, WANG L, et al. Development of a SPME-GC-MS method for the determination of volatile compounds in Shanxi aged vinegar and its analytical characterization by aroma wheel[J]. Journal of Food Science and Technology, 2016, 53(1): 171-183. DOI:10.1007/ s13197-015-2035-5.

[3] AZZIACHKOUTY S, ESTEPHAN N, OUAINI N, et al. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2015. DOI:10.1080/10408398. 2014.957379.

[4] ABDULRAUF L B, TAN G H. Chemometric approach to the optimization of HS-SPME/GC-MS for the determination of multiclass pesticide residues in fruits and vegetables[J]. Food Chemistry, 2015, 177: 267-273. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.01.031.

[5] 谢爱英, 党亚丽, 李芳芳, 等. 不同巴氏杀菌条件对酸奶品质的影响[J].食品科学, 2011, 32(9): 14-17.

[6] 刘登勇, 周光宏, 徐幸莲. 确定食品关键风味化合物的一种新方法:ROAV法[J]. 食品科学, 2008, 29(7): 370-374.

[7] 刘登勇, 周光宏, 徐幸莲. 金华火腿主体风味成分及其确定方法[J]. 南京农业大学学报, 2009, 32(2): 173-176. DOI:10.7685/ j.issn.1000-2030.2009.02.035.

[8] 张文彤. SPSS统计分析高级教程[M]. 北京: 高等教育出版社, 2004: 213-234.

[9] GUTH H. Quantitation and sensory studies of character impact odorants of different white wine varieties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45(8): 3027-3032. DOI:10.1021/jf970280a.

[10] 孙保国. 食用调香术[M]. 北京: 化学工业出版社, 2003: 20-28.

[11] van GEMERT L. Compilations of flavour threshold values in water and other media[M]. Boelens Aroma Chemical Information Service, 2003.

[12] FERREIRA V, LÓPEZ R, CACHO J F. Quantitative determination of the odorants of young red wines from different grape varieties[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2000, 80(11): 1659-1667. DOI:10.1002/1097-0010(20000901)80:11<1659::AIDJSFA693>3.0.CO;2-6.

[13] JOHN C. Flavor-base (Demo)[M]. 10th ed. Georgia: Leffingwell & Associates, 2001.

[14] GIRI A, OSAKO K, OKAMOTO A, et al. Olfactometric characterization of aroma active compounds in fermented fi sh paste in comparison with fi sh sauce, fermented soy paste and sauce products[J]. Food Research International, 2010, 43(4): 1027-1040. DOI:10.1016/ j.foodres.2010.01.012.

[15] AND P S, SCHIEBERLE P. Characterization of the key aroma compounds in soy sauce using approaches of molecular sensory science[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(15): 6262-6269. DOI:10.1021/jf0709092.

[16] ANDREAS O, GERMOND J E, BAUMGARTNER M, et al. Aroma comparisons of traditional and mild yogurts: headspace gas chromatography quantification of volatiles and origin of alphadiketones[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(6): 2379-2385. DOI:10.1021/jf980650a.

[17] CHAVES A C S D, FERNANDEZ M, LERAYER A L S, et al. Metabolic engineering of acetaldehyde production by Streptococcus thermophilus[J]. Applied and Environmental Microb iology, 2002, 68(11): 5656-5662. DOI:10.1128/AEM.68.11.5656-5662.2002.

[18] 刘宁宁, 郭红敏, 葛春美, 等. 酸奶中乙醛和双乙酰含量对其风味的影响[J]. 中国食品添加剂, 2012(S1): 269-273.

[19] CHENG H. Volatile fi avor compounds in yogurt: a review[J]. Critical Reviews in Food science and Nutrition, 2010, 50(10): 938-950. DOI:10.1080/10408390903044081.

[20] PESSINA R, PIOMBINO P, GENOVESE A, et al. Sensory profi ling, volatiles and odor-active compounds of Canestrato Pugliese PDO cheese made from raw and pasteurized ewes milk[J]. Italian Journal of Food Science, 2008, 2(20): 225-237.

[21] MAJCHER M, JELEŃ H H. Comparison of suitability of SPME, SAFE and SDE methods for isolation of flavor compounds from extruded potato snacks[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2009, 22(6): 606-612. DOI:10.1016/j.jfca.2008.11.006.

[22] LI N, ZHENG F, CHEN H, et al. Identifi cation of volatile components in Chinese Sinkiang fermented camel milk using SAFE, SDE, and HS-SPME-GC/MS[J]. Food Chemistry, 2011, 129(3): 1242-1252. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.03.115.

[23] 丹彤, 包秋华, 孟和毕力格, 等. 发酵乳风味物质乙醛、双乙酰的合成途径及其调控机制[J]. 食品科技, 2012, 37(7): 75-79. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2012.07.031.

[24] 刘南南, 郑福平, 张玉玉, 等. SAFE-GC-MS分析酸牛奶挥发性成分[J].食品科学, 2014, 35(22): 150-153. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201422028.

[25] 牛云蔚, 肖作兵, 张喆, 等. 不同品牌酸奶香气成分研究[J]. 粮食与油脂, 2013(9): 49-52. DOI:10.3969/j.issn.1008-9578.2013.09.013.

[26] 王伟君, 李延华, 张兰威, 等. SDE-GC-MS法测定发酵乳中风味物质[J]. 食品科学, 2008, 29(6): 332-334. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2008.06.071.

[27] BESHKOVA D, SIMOVA E, FRENGOVA G, et al. Production of flavour compounds by yogurt starter cultures[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 1998, 20(3/4): 180-186. DOI:10.1038/sj.jim.2900504.

[28] SIEUWERTS S, de BOK F A M, HUGENHOLTZ J, et al. Unraveling microbial interactions in food fermentations: from classical to genomics approaches[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(16): 4997-5007. DOI:10.1128/AEM.00113-08.

[29] COURTIN P, MONNET V, RUL F. Cell-wall proteinases PrtS and PrtB have a different role in Streptococcus thermophilus/Lactobacillus bulgaricus mixed cultures in milk[J]. Microbiology, 2002, 148(11): 3413-3421. DOI:10.1099/00221287-148-11-3413.

[30] 李莎, 马成杰, 徐志平, 等. 不同发酵特性的嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌共发酵的特性[J]. 食品科学, 2015, 36(15): 123-127. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201515023.

Analysis of Key Volatile Compounds in Fermented Cow Milk Produced by Pure and Mixed Cultures by SPME-GC-MS Combined with ROAV

WANG Dan, DAN Tong, SUN Tiansong, ZHANG Heping, MENGHE Bilige*
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Ministry of Education, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

Abstract：Solid phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS) and relative odor activity value were used to study the key volatile compounds of fermented cow milk produced by pure and mixed cultures of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. The results showed that 100 volatile compounds, including acids, ketones, aldehydes, alcohols, estersds, hydrocarbons and aromatic compounds were detected. Principal component analysis (PCA) indicated that 2,3-butanedione, nonanal and toluene were the characteristic aroma compounds of fermented cow milk produced by a pure culture of S. thermophiles while hexanal, butanoic acid-2-methylpropyl ester and 1-heptanol were the characteristic aroma compounds of fermented cow milk produced by a pure culture of L. bulgaricus. Acetaldehyde, 3-methyl-butanal, acetoin, 2-nonanone, 2-heptanone, acetic acid ethenyl ester, carbonic acid-heptyl phenyl ester, formic acid-ethenyl ester, and 2-nonanol were the characteristic aroma compounds of fermented cow milk produced by mixed cultures. Compare to fermented cow milk produced by pure cultures, the compositions of volatile compounds and their relative contents and the key volatile compounds were all changed in fermented cow milk produced by mixed cultures.

Key words：fermented cow milk; key volatile compounds; solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS); principal component analysis

引文格式：

引文格式：

王丹, 丹彤, 孙天松, 等. SPME-GC-MS结合ROAV分析单菌及复配发酵牛乳中关键性风味物质[J]. 食品科学, 2017, 38(8): 145-152. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201708023. http://www.spkx.net.cn

WANG Dan, DAN Tong, SUN Tiansong, et al. Analysis of key volatile compounds in fermented cow milk produced by pure and mixed cultures by SPME-GC-MS combined with ROAV[J]. Food Science, 2017, 38(8): 145-152. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201708023. http://www.spkx.net.cn

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201708023

中图分类号：TS207.3

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2017）08-0145-08

收稿日期：2016-08-03

基金项目：国家自然科学基金面上项目（31471711）；国家自然科学基金地区科学基金项目（31460446）；

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2011AA100902）

作者简介：王丹（1993—），女，硕士研究生，研究方向为乳品微生物与生物技术。E-mail：magic136@126.com

*通信作者：孟和毕力格（1965—），男，教授，博士，研究方向为乳品微生物与生物技术。E-mail：mhblg@163.com