人工接种温州蜜柑后链格孢霉毒素的产生及分布规律

蒋黎艳1,2,龚 蕾1,盖智星1,刘雁雨1,马 良2,*,赵其阳1,3,王成秋1,3,焦必宁1,2,3,4,*

(1.中国农业科学院柑桔研究所,农业部柑桔产品质量安全风险评估实验室(重庆),重庆 400712;2.西南大学食品科学学院,重庆 400715;3.农业部柑桔及苗木质量监督检验测试中心,重庆 400712;4.国家柑桔工程技术研究中心,重庆 400712)

摘 要:采用超高效液相色谱-串联质谱法结合QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)前处理方法,研究温州蜜柑人工接种链格孢菌(Alternaria alternate)后,病斑部位全果、非病斑部位果皮和果肉中腾毒素(tentoxin,Ten)、链格孢酚(alternariol,AOH)、交链格孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether,AME)、交链孢烯(altenuene,ALT)和细交链格孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)5 种链格孢霉毒素的产生和分布规律。结果表明,病斑部位全果、非病斑部位果皮和果肉中的链格孢霉毒素含量随着病斑直径的扩大,不同链格孢霉毒素的变化趋势不同。TeA、Ten、AME和AOH在所有部位中均有检出,其中TeA检出含量最高,在病斑部位的含量范围为3.05×103~55.88×103μg/kg,在非病斑部位的含量范围为65.35~40.68×103μg/kg;Ten、AME和AOH在病斑部位的含量范围分别为69.16~373.94、22.63~1 395.82 μg/kg和8.18~689.19 μg/kg;非病斑部位的含量范围分别为0~67.56、0~195.96 μg/kg和0~301.91 μg/kg;ALT在非病斑部位果肉中未检出,但在非病斑部位的果皮和病斑部位的全果中均有检出,含量最高达16.61 μg/kg。研究表明,由于柑橘感染链格孢菌后产生的毒素会从发病部位扩散到健康部位累积,因此,在鲜食加工和风险评估中应引起关注和重视。

关键词:温州蜜柑;链格孢霉毒素;超高效液相色谱-串联质谱;分布规律

链格孢菌属真菌(Alternaria spp.)是一种普遍存在的、能导致水果蔬菜及冷藏食品腐败变质的小型致病菌和腐生菌[1],可产生70多种有毒代谢产物,统称为链格孢霉毒素[2-3]。其中主要有链格孢酚(alternariol,AOH)、交链格孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether,AME)、交链孢烯(altenuene,ALT)、腾毒素(tentoxin,Ten)以及细交链格孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)[4-6]。研究表明,链格孢霉毒素具有致癌致畸毒性、细胞毒性、基因毒性以及急性毒性[7-10]。尽管它们的急性毒性对动物都是较弱的,但有少量数据表明低浓度的链格孢霉毒素和其他污染物通过协同作用可产生慢性毒性效应[1,9,11]。据文献报道,链格孢霉毒素对人体健康有多种不利影响,Dong Zigang等[12]发现AME和AOH两种链格孢霉毒素很有可能是中国河南林县的食道癌致癌因子,并在林县的谷物中分离得到链格孢霉毒素;也有报道TeA钠盐、镁盐还可能与一种发生在非洲的人类出血性疾病——奥尼赖病有关[13]

柑橘是世界上第一大水果,具有较高的经济价值和保健价值[14]。链格孢菌可使柑橘类水果如柠檬、宽皮柑橘和橙子等患黑腐病和褐斑病[15-16],其产生的链格孢霉毒素经常在柑橘类水果中有检出,相关综述也报道了链格孢霉毒素的存在[17]。Logrieco等[18]研究发现感染了链格孢菌的柑橘产生黑心和灰心两种不同的症状,黑心果中TeA、AME、AOH含量分别为21. 0~87.2、0.5~1.4、1.0~5.2 mg/kg;灰心果仅产生TeA,但含量高达173.9 mg/kg。Magnani等[16]检测感染褐斑病的柑橘外果皮和囊瓣中的链格孢霉毒素(AOH和AME),结果表明在外果皮上2 种链格孢霉毒素均检测到,而在囊瓣上并未检测出,表明外果皮在一定时间内起防御作用,阻止部分毒素侵入果肉。Zhao Kai等[19]对中国柑橘及柑橘制品中自然产生的链格孢霉毒素进行检测,结果表明部分柑橘果汁样品中含有TeA和AME。

目前,已有少量文章对中国农作物中链格孢霉毒素的污染进行过报道[19-21],但国内外尚未制定链格孢霉毒素限量标准,针对柑橘及其制品中链格孢霉毒素的污染分布规律也未见报道。因此,研究接种链格孢菌后柑橘中链格孢霉毒素在病斑部位以及非病斑部位的污染分布规律对其限量标准和风险评估研究等方面都具有非常重要的意义。本实验采用超高效液相色谱-串联质谱法结合QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)前处理研究接种链格孢菌后温州蜜柑中的5 种链格孢霉毒素的产生和分布规律,以期为柑橘类水果及制品链格孢霉毒素的污染控制和开展风险评估提供数据支撑和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土豆、温州蜜柑 重庆市购。

链格孢菌(Alternaria alternate)由中国农业科学院柑桔研究所贮藏课题组保藏。

Ten(纯度>98%)、AME(纯度>98%)、AOH(纯度>98%)、TeA(纯度>98%)标准品 新加坡Pribolab公司;ALT(纯度>98%) 加拿大TRC公司;乙腈(色谱纯) 德国CNW Technologies有限公司;无水MgSO4(分析纯,使用前于140 ℃烘烤4 h) 江苏强盛化工有限公司;NaCl(分析纯,使用前于140 ℃烘烤4 h) 国药集团化学试剂有限公司;甲酸(分析纯)重庆川东化工有限公司;琼脂(分析纯) 成都市科龙化工试剂厂;葡萄糖(分析纯) 重庆北碚化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

SPX-150-Z生物恒温培养箱 上海博泰实验设备有限公司;RXZ-260C智能人工气候箱 宁波东南仪器有限公司;SW-CJ-1F超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;LDZX-50FBS高压灭菌锅 上海审安医疗器械公司;MS2000生物显微镜 重庆奥赛光电有限公司;Quatrro-Premier XE超高效液相色谱-串联质谱仪(配有Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)) 美国Waters公司;KS260摇床 德国IKA公司;KQ5200DE超声波清洗器 江苏昆山市超声仪器有限公司;3K15离心机 德国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 材料处理

果实接种参照文献[22-24]报道。选择成熟度相近、外观整齐、无机械损伤的温州蜜柑清洗晾干后用75%酒精浸泡2 min消毒,放于保鲜膜上晾干后备用。链格孢菌接种于马铃薯琼脂培养基,28 ℃恒温培养5~7 d后将孢子刮下,制成浓度为8.0×105spores/mL孢子悬浮液。用5 mm打孔器灭菌后在柑橘上打孔。每个果实在一半的面积内打对称的3 个孔,分别滴加20 μL现配的孢子悬浮液。处理后的果实放入托盘内,盘底铺浸润的脱脂棉覆上保鲜膜,摆放好后,托盘口覆上保鲜膜,并置于28 ℃、相对湿度95%的培养箱中培养。接种后分别在不同时间按病斑直径取样,经液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱备用。

1.3.2 取样方法

人工接种链格孢菌的柑橘发病后,采用十字交叉法测量病斑直径,按病斑直径约6、12、18、24、30 mm时取病斑部位的全果(包含果皮和果肉),去除病斑处的柑橘组织后的非病斑部位果皮和非病斑部位果肉部分,分别匀浆,然后分别测定温州蜜柑中病斑部位中全果、非病斑部位果肉和果皮的5 种链格孢霉毒素的含量。

1.3.3 链格孢霉毒素的检测

1.3.3.1 样品前处理

采用QuEChERS对样品进行前处理,分别称取柑橘全果、果肉和果皮样品各5 g(精确至 0.01 g)于50 mL尖底具塞离心管中,加入5.00 mL含1.5%甲酸的乙腈溶液,20 ℃条件下恒温超声提取30 min;再加入2.5 g无水MgSO4和0.4 g NaCl,剧烈振荡1 min后,在10 000 r/min离心5 min,取上清液过0.22 μm有机滤膜,滤液经超高效液相色谱-串联质谱分析。

1.3.3.2 超高效液相色谱条件

色谱柱:Acquity UPLC BEH C18液相色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱温30 ℃;流动相组成:A(0.1%甲酸溶液)+B(乙腈);采用梯度洗脱;梯度洗脱程序:B的初始比例为5%,在0~4.3 min,5%~95% B;4.3~5.0 min,95% B;5.0~5.1 min,95%~5% B;5.1~6.0 min,5% B。进样量:5 μL;流速:0.3 mL/min。

1.3.3.3 质谱条件

离子化模式:电喷雾离子源,正离子模式(positive electrospray ionization,ESI);质谱扫描方式:多反应监测(multiple reactions monitoring,MRM);电离电压:3 kV;离子源温度:120 ℃;脱溶剂温度:380 ℃;脱溶剂气流量:800 L/h;碰撞气流量:0.18 mL/min;锥孔反吹气流量:50 L/h。5 种链格孢霉毒素的监测离子、锥孔电压和碰撞电压等质谱参数如表1所示。

表1 5 种链格孢霉毒素的质谱测定参数
Table 1 Mass spectrometric parameters for fi ve Alternaria mycotoxins

注:*.定量离子。

2 结果与分析

2.1 人工接种后果实的发病情况分析

图1 果实在不同病斑直径时的照片
Fig. 1 Pictures of fruits with different lesion diameters

采用果实打孔接种真菌的方法,用链格孢菌接种温州蜜柑后,其果实3 个孔的病斑直径测量结果见图1和表2,随着发病时间的延长,病斑也逐渐扩大,其中在第1天和第2天时,观察柑橘均未发病,在第3天时,3 个孔的平均病斑直径均增大到6 mm左右,随后随着时间的推移病斑扩大的速度越来越快,在第13天时3 个孔径的平均病斑直径最大可达到33.94 mm。6、12、18、24 mm和30 mm分别表示接种3、5、8、11、13 d时果实的病斑直径大小,根据测量的病斑直径进行取样,检测各阶段果皮、果肉和全果中链格孢霉毒素的含量。

表2 果实接种后3 个孔的病斑直径结果
Table 2 Lesion diameter in fruits inoculated in three holes after peeling mm

2.2 5 种链格孢霉毒素的质谱图

质量浓度为100 μg/L标准溶液中5 种链格孢霉毒素的MRM定量离子对质谱图,见图2。

图2 5 种链格孢霉毒素的MRM离子质谱图
Fig. 2 MRM chromatograms of fi ve Alternaria mycotoxins

2.3 方法验证

本实验按照1.3.3.1节方法准确称取柑橘果皮、全果和果肉样品,在5、20 μg/kg和100 μg/kg 3个水平下加标,每个水平重复测定5 次。5 种毒素的平均回收率在83.5%~102.9%之间,相对标准偏差均小于10%(表3),结果表明,该方法对柑橘样品不同含量的5 种链格孢霉毒素的测定均具有较高的回收率和精密度,满足检测要求。

表3 柑橘的果皮、果肉以及全果中5 种链格孢霉毒素的添加回收率和精密度(n=5)
Table 3 Recoveries and precisions for fi ve Alternaria mycotoxins in citrus peel, pulp and whole fruit (n= 5)

续表3

2.4 温州蜜柑果实发病过程中Ten含量变化及分布

图3 柑橘中Ten含量随着病斑直径扩增的变化
Fig. 3 Change in Ten content in citrus with increasing lesion diameter

图3 显示,在病斑直径为6、12 mm时,非病斑部位果肉中还未产生Ten,非病斑部位果皮中的Ten含量分别为1.99 μg/kg和3.86 μg/kg,含量较低;在病斑直径为18~30 mm时,非病斑部位果肉中Ten含量逐渐增加,最高达27.38 μg/kg;非病斑部位果皮中Ten含量依次递增,在病斑直径为30 mm时,达67.56 μg/kg;而在病斑部位全果中,在病斑直径为6 mm时,Ten含量达69.16 μg/kg;12 mm时,迅速增加,高达291.48 μg/kg。在整个病程中病斑部位全果中的Ten含量均比非病斑部位果皮中高,最高达373.94 μg/kg;从以上数据可以说明,果皮不仅对病害发展有一定的防御作用,还可能因为其含有高浓度的类黄酮和酚酸等物质,可以对Ten毒素的侵扰与迁移有一定的阻挡作用。

2.5 温州蜜柑果实发病过程中ALT含量变化及分布

图4显示,当病斑直径从6 mm扩展到30 mm,非病斑部位果肉中一直都未产生ALT;在病斑直径为6、12 mm时,非病斑部位果皮中还未产生ALT;在病斑直径为18~30 mm时,非病斑部位果皮中ALT含量分别为4.95、 5.41 μg/kg和9.19 μg/kg,毒素扩散缓慢。整个病程中,病斑部位全果中均有ALT产生,含量从5.57 μg/kg增长至16.61 μg/kg。以上数据可以看出,柑橘病斑部位全果和非病斑部位果皮中的ALT含量随着病斑直径的扩大而逐渐增加,其增长速度慢于其他几种毒素。

图4 柑橘中ALT含量随着病斑直径扩增的变化
Fig. 4 Change in ALT content in citrus with increasing lesion diameter

2.6 温州蜜柑果实发病过程中AME含量变化及分布

图5 柑橘中AME含量随着病斑直径扩增的变化
Fig. 5 Change in AME content in citrus with increasing lesion diameter

图5 显示,在病斑直径为6、12 mm时,非病斑部位果肉和果皮中均还未产生AME,在18~24 mm时,非病斑部位果肉中有AME产生,由12.85 μg/kg突增至107.09 μg/kg,在病斑直径为30 mm时,又下降至29.57 μg/kg;非病斑部位果皮中AME含量随着病斑直径逐渐递增,最高达195.96 μg/kg;整个病程中,病斑部位全果中均有AME产生,在病斑直径为6 mm时,达22.63 μg/kg,之后随着病斑直径的增加,毒素含量加速扩增,最高达1 395.82 μg/kg。以上数据可以说明,柑橘病斑部位全果和非病斑部位果皮中的AME含量随着病斑的扩大逐渐增加,非病斑部位果肉中AME含量在后期有下降趋势,很有可能是培养过程的水分活度的变化以及温度的影响所导致。

2.7 温州蜜柑果实发病过程中AOH含量变化及分布

图6显示,在病斑直径为6、12 mm时,非病斑部位果肉和果皮中均还未产生AOH;在18~30 mm时,非病斑部位果肉中AOH含量逐渐增加,最高达132.96 μg/kg;非病斑部位果皮中AOH依次递增,在30 mm时,达301.91 μg/kg;整个病程中,病斑部位全果中均有AOH产生,在病斑直径为6 mm时,产生8.18 μg/kg的AOH,在12 mm时,迅速增至308.20 μg/kg,可见其扩散速度之快,之后随着病斑直径的扩增,AOH含量逐渐增加,最高可达689.19 μg/kg。非病斑部位果肉中AOH含量在后期有下降趋势,很有可能是培养过程的水分活度的变化以及温度的影响所导致。

图6 柑橘中AOH含量随着病斑直径扩增的变化
Fig. 6 Change in AOH content in citrus with increasing lesion diameter

2.8 温州蜜柑果实发病过程中TeA含量变化及分布

图7 柑橘中TeA含量随着病斑直径扩增的变化
Fig. 7 Change in TeA content in citrus with increasing lesion diameter

图7 显示,在病斑直径为6 mm时,非病斑部位果肉和果皮中TeA含量分别为65.35 μg/kg和76.76 μg/kg,病斑部位全果中的TeA含量为3.05×103μg/kg,说明TeA的产生速度很快,侵入果肉很迅速。在病斑直径为12~30 mm时,非病斑部位果肉中TeA含量逐渐增加,扩散速度极快,最高达40.68×103μg/kg;非病斑部位果皮中TeA含量随着病斑的扩大逐渐增加,最高达26.34×103μg/kg,非病斑部位果皮中TeA含量低于果肉中的TeA含量,说明TeA一旦在果肉中产生,其在果肉中的产生速度快于果皮中;病斑部位全果中的TeA含量由9.08×103μg/kg增加至55.88×103μg/kg。这与Logrieco等[18]对成熟的椪柑、橙子和柠檬接种,检测到链格孢霉毒素中也是TeA含量最高而相一致。

3 讨 论

由链格孢菌引起的柑橘褐斑病是一种极具破坏力的真菌病害,该病害在宽皮柑中的红橘、椪柑上发病较为严重[25-27]。因此,本实验选择占我国宽皮柑总量最多的温州蜜柑作为褐斑病侵染的易感实验材料进行接种。

本实验采用纯种链格孢菌接种温州蜜柑,按不同发病程度研究5 种链格孢霉毒素的产生分布规律,结果发现温州蜜柑的不同部位毒素含量有明显差异,就非病斑部位而言,发病过程中果皮中大多数链格孢霉毒素(除TeA)的含量明显高于果肉,这与Magnani等[16]的研究结果相一致,说明果皮在一定的程度上有防御作用。从本研究结果也可以看出,TeA在任何部位中的任何一次按病斑直径取样中的含量比其他毒素(Ten、ALT、AME和AOH)都高,然而TeA是链格孢霉毒素中唯一的含氮代谢产物,能够抑制哺乳动物的蛋白质的合成,同时与其他链格孢霉毒素具有协同作用可产生慢性毒性效应,因此在柑橘果实加工和副产物利用过程中需要引起高度重视。

温州蜜柑果实感染链格孢菌后所产生的多种链格孢霉毒素含量不一致,而且在一定范围内有些链格孢霉毒素的含量呈现下降趋势,很有可能是培养过程中水分活度的变化以及温度的影响所导致。水分活度和温度等均能影响链格孢菌产毒的能力[28]。链格孢菌最适生长温度一般在20~25 ℃之间,最低生长温度为-2~5 ℃,最高为31~32 ℃。链格孢所需产孢温度为25~28 ℃,在pH 4~4.5条件下,菌丝才可能生长,当pH 2.7~8.0时,菌丝生长最低水分活度为0.85,最适水分活度为0.98。Pose等[29]研究表明AOH的最适合产毒温度为21 ℃,AME最适产毒温度为35 ℃,最适水分活度均为0.954。Patriarca等[30]研究表明ALT最适合产毒温度为30 ℃,最适水分活度为0.98。Hasan等[31]认为TeA的最适合产毒温度为21 ℃,最适水分活度为0.982。

链格孢菌侵染柑橘果实后,产生浅棕色或黑色斑点的腐烂(图1),由本实验的检测结果可知,柑橘在人工接种产毒霉菌后,产生的链格孢霉毒素会从病斑部位扩散到非病斑部位,且速度极快,即在链格孢菌侵染过程中果实内部有毒素产生,而当果实用来制罐头、榨汁及果皮综合利用的时候,为避免链格孢霉毒素在产品中的残留,提高食用安全性,应该剔除腐烂果,不能取非病斑部位用于加工利用,鲜食亦是如此。同时在柑橘贮存期间应该及时将有病斑的柑橘和健康的柑橘分离开来,以避免更多的污染。

4 结 论

本实验采用超高效液相色谱-串联质谱法结合QuEChERS,研究感染链格孢菌后温州蜜柑中的5 种链格孢霉毒素的产生和分布规律,结果表明不同部位组织间5 种链格孢霉毒素含量产生和积累是不同步的。其中TeA含量最高,增长速度最快并在所有部位中均有检出。同时研究表明柑橘感染产毒霉菌后易产生毒素,并从病斑部位扩散到非病斑部位从而对人体产生危害,这对监控柑橘类水果的原料及其加工食品的食用安全性具有较高的价值。

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Production and Distribution of Alternaria Mycotoxins in Satsuma Mandarin (Citrus unshiu Marc.) Artifi cially Inoculated with Alternaria alternate

JIANG Liyan1,2, GONG Lei1, GE Zhixing1, LIU Yanyu1, MA Liang2,*, ZHAO Qiyang1,3, WANG Chengqiu1,3, JIAO Bining1,2,3,4,*
(1. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Citrus Products, Ministry of Agriculture, Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China; 2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 3. Quality Supervision and Testing Ce ntre for Citrus and Seedling, Ministry of Agriculture, Chongqing 400712, China; 4. National Citrus Engineering Research Center, Chongqing 400712, China)

Abstract:An utra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was established using quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe (QuEChERS) pre-treatment to investigate the production and distribution of fi ve Alternaria mycotoxins including tentoxin (Ten), alternariol (AOH), alternariol monomethyl ether (AME), altenuene (ALT) and tenuazonic acid (TeA) in whole fruits, healthy pulp and healthy peel of citrus inoculated with Alternaria alternate. The results demonstrated that the contents of various Alternaria mycotoxins produced in whole fruits, healthy pulp and healthy peel changed differently with increasing lesion diameter. TeA, Ten, AME and AOH were detected in all tested parts of the fruit. Among these, the average concentration of TeA was the highest, ranging from 3.05 × 103to 55.88 × 103μg/kg and from 65.35 to 40.68 × 103μg/kg in lesion and non-lesion areas, respectively. The concentrations of Ten, AME and AOH in the infected location were in the range of 69.16‒373.94, 22.63‒1 395.82 and 8.18‒689.19 μg/kg,respectively, while in the health location, the values were in the range of 0‒67.56, 0‒195.96 and 0‒301.91 μg/kg, respectively. ALT was detected in both healthy peel and infected whole fruits (up to 16.61 μg/kg) rather than healthy pulp. These results indicate that Alternaria mycotoxins produced in infected citrus can rapidly spread from the infected to the healthy parts, resulting in the accumulation of a large amount of mycotoxins in citrus. Therefore, we should pay more attention to this problem in fresh food processing and risk assessment to ensure consumer safety.

Key words:Satsuma mandarin; Alternaria mycotoxins; ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); distribution pattern

收稿日期:2016-04-12

基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2013CB127803);国家自然科学基金青年科学基金项目(31301476);

国家现代农业(柑桔)产业技术体系建设专项(CARS-27);

国家农产品质量安全风险评估重大专项(GJFP2015004;GJFP2016004);中央高校基本科研业务费专项(XDJK2013B035)

作者简介:蒋黎艳(1989—),女,硕士研究生,研究方向为食品安全与质量控制。E-mail:lyj5423@163.com

*通信作者:马良(1979—),女,副教授,博士,研究方向为食品安全与食品检测技术。E-mail:zhyhml@163.com

焦必宁(1964—),男,研究员,本科,研究方向为果蔬贮藏加工技术与质量安全。E-mail:bljiao@tom.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201708039

中图分类号:TS201.6

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)08-0251-07

引文格式:

蒋黎艳, 龚蕾, 盖智星, 等. 人工接种温州蜜柑后链格孢霉毒素的产生及分布规律[J]. 食品科学, 2017, 38(8): 251-257.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201708039. http://www.spkx.net.cn

JIANG Liyan, GONG Lei, GE Zhixing, et al. Production and distribution of Alternaria mycotoxins in Satsuma mandarin (Citrus unshiu Marc.) artifi cially inoculated with Alternaria alternate[J]. Food Science, 2017, 38(8): 251-257. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201708039. http://www.spkx.net.cn