鸭梨POD基因的原核表达及成熟度和降温方法对其表达量的影响

韩艳文1,廉双秋2,韩云云1,池 明1,闫师杰3,*

(1.天津农学院园艺园林学院,天津 300384;2.北京正大果业有限公司,北京 101206;3.天津农学院食品科学与生物工程学院,天津市农副产品深加工技术工程中心,天津 300384)

摘 要:利用半定量逆转录多聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技术研究缓慢降温和急速降温两种降温方法及早采、中采、晚采3 种采收成熟度鸭梨的采后果心和果肉中过氧化物酶(peroxidase,POD)基因的表达与鸭梨褐变的关系。结果发现,缓慢降温处理的鸭梨果心POD基因表达量比相同时期采摘的急速降温处理的基因表达量高,这与其对应的褐变指数相一致,说明POD与鸭梨果实褐变密切相关,缓慢降温能有效抑制鸭梨褐变。同时中采鸭梨的POD基因表达量最高,早采次之,晚采最低,这进一步说明成熟度是影响鸭梨褐变的因素之一。实验进一步构建了POD基因cDNA原核表达载体pET-32a-pbPOD,并成功诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,为进一步研究POD表达量对鸭梨果实褐变的机理提供了参考。

关键词:鸭梨;褐变;POD基因;原核表达;成熟度;降温速率

鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd cv. Yali)是我国河北的古老地方品种,产量较大,据统计,2014年河北省鸭梨产量为409.6万吨,占全国总梨产量的25%以上[1]。到2015年,产量增至505.99万吨,占全国梨果总产量的27%[2]。不仅如此,它品质优良,耐贮藏,一般情况在适宜的贮藏环境下鸭梨的品质可保持6~8 个月[3]。但是在贮运时鸭梨果心、果肉存在严重的褐变现象,如何解决鸭梨褐变是目前贮藏领域的一大难题。褐变与鸭梨组织内的多种酶类、酚类以及膜脂过氧化等因素有关[4]。酶促褐变是引起褐变的主要原因,果实中的多酚氧化酶是引起果实酶促褐变的主要酶类[5],而作为植物逆境环境下体内酶促防御系统中的重要成员——过氧化物酶(peroxidase,POD),在果实的衰老与褐变中的作用也应该给予足够的重视,它能将细胞中H2O2还原成H2O,清除果实中的自由基[6]。这说明POD具有一定的自由基清除能力,自由基清除能力在一定程度上可以反映果实的抗氧化能力[7]。同时,POD又是果蔬成熟和衰老的一个指标,POD活性下降会加速果实衰老[8],若能较好地维持POD的活性可以有效延缓果实的衰老[9]。POD是一个大型的多基因家族的成员,在水稻中有138 名成员[10],拟南芥中有73 名成员[11],整个植物的生命周期POD参与广泛的生理过程。目前,在西洋梨[12]、木薯[13]、龙眼[14]以及无核密香葡萄[15]的研究中,从生理生化角度证实了POD基因家族在果实的成熟衰老过程中发挥着重要作用,但是在分子学角度揭示植物中POD基因与抗逆性关系的研究比较少。目前,POD基因克隆与表达方面的研究主要集中在灌木或草本植物上,李宁宁等[16]采用同源克隆技术分离了3 种锦鸡儿属植物的POD基因,并对它们在干旱胁迫条件下的表达特征进行了分析。王海波等[17]为探索小桐子POD73基因对低温环境的响应机制,采用逆转录多聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技术克隆到小桐子POD73基因(jcPOD73)的全长cDNA序列。肖国增等[18]为了研究匍匐翦股颖在盐胁迫下抗氧化酶活性与基因表达的影响机制,用同源克隆的方法克隆了匍匐翦股颖POD基因的片段,得知POD基因的表达量与酶活性的变化趋势一致。在果树果实方面,对POD基因克隆与表达的研究更是寥寥无几。虽然,有闫师杰等[19]发现POD基因编码的蛋白具有POD家族保守存在的所有功能活性位点以及王卓等[20]通过随机克隆测序的方法,得到香蕉遭受枯萎病侵染的标记基因MaPOD1基因。但是,这些结果对于POD基因在果实成熟衰老过程中分子机理的研究还不够全面,尤其将POD基因转入原核生物进行体外表达的研究还鲜见报道。本研究通过对POD活性的测定以及采用半定量RT-PCR技术对POD表达量的分析,将获得基因转入原核生物中研究其体外表达的特性来探索POD基因的生物学功能,为酶促引起褐变的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

套袋鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd cv. Yali),采自河北省深州市;微孔膜:大小85 cm×70 cm、厚度0.05~0.06 mm、孔径15~20 μm,由国家农产品保鲜工程技术研究中心(天津)生产。

原核表达载体pET-32a(+) 北京天恩泽生物有限公司;大肠杆菌菌株E.coli BL21 北京天根生物技术有限公司;M-MLV反转录试剂、DNA聚合酶、Omega胶回收试剂盒等RT-PCR所用试剂 北京索莱宝有限公司;限制性内切酶、T4 DNA连接酶 大连宝生物工程公司;质粒小量提取试剂盒 上海生物工程技术服务有限公司;其他常规药品均为进口或国产分析纯试剂。DNA序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2 仪器与设备

PCR仪、2000c型紫外分光光度计、-80 ℃超低温冰箱、核酸蛋白测定仪 美国Thermo公司;凝胶成像系统 上海天能科技有限公司;垂直板电泳仪及电泳槽 Bio-Rad生命医学产品(上海)有限公司;Z323K冷冻离心机 德国Hermle公司;超净工作台 苏州净化设备有限公司;VORTEX-GENIE2漩涡混匀器 美国Scientif i c Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 鸭梨采收与样品预处理

根据当地农户的鸭梨大量采收期为依据,选择2014年9月6日(可溶性固形物含量(soluble solid content,SSC)为10.7%,果肉硬度为12.01 kg/cm2)、9月16日(SSC为12%,果肉硬度为10.87 kg/cm2)和9月26日(SSC为12.6%,果肉硬度为10.18 kg/cm2)作为早、中、晚的3 个采收时间。采摘质量约230 g、无机械伤、无虫害的果实,套网套装入内衬保鲜膜的纸箱中运抵天津农学院冷库。

鸭梨进行挑选后分装,依然装入内衬微孔膜的专用包装纸箱中,每箱50 个鸭梨,共6 个处理。早、中、晚缓降温处理的鸭梨放入12 ℃冷库中,每5 d降2 ℃,30 d将温度降至(0±1) ℃,然后在此温度条件下贮藏,记为早缓、中缓、晚缓;早、中、晚急降温处理的鸭梨直接放入(0±1) ℃冷库中贮藏。每20 d取样进行指标测定,每次随机选取20 个鸭梨果实,沿果心线外侧切分果实,迅速将果肉、果心切成块状的样品分别用液氮急冻,然后置于-70 ℃条件下保存,记为早急、中急、晚急。

1.3.2 鸭梨果心褐变率的测定

将鸭梨果实沿中心部位横切,观察鸭梨果心是否褐变。本实验总共6 个处理,每个处理随机选取30或40 个鸭梨果实进行统计,按下面公式计算。

1.3.3 引物设计与合成

根据GenBank上FJ478154.1公布的梨属POD基因的m R N A及C D S信息,用软件P r i m e r 5.0设计引物:P O D-F:5’-G C G A A T T C C A C T GCTGCTGGACTCAACA-3’;POD-R:5’-GCGAAGCT TCCACAATCAACAAACCCTTG-3’。所需上游、下游引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.4 RT-PCR检测POD基因表达

以采摘时期、降温方法和贮藏时间不同的鸭梨果实为试验材料,采用CTAB法提取鸭梨果心和果肉部位的总RNA,参照孙雯等[21]的方法,略有改动。使用2000c型紫外分光光度计测定RNA浓度,OD260nm/OD280nm的比值确定RNA纯度。经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。反转录反应参照M-MLV反转录酶说明书,Oligo(dT)为引物合成cDNA第一链,以反转录cDNA为模板、POD-F、POD-R为引物进行扩增,扩增程序为:95 ℃预变性4 min,94 ℃变性35 s,60 ℃退火35 s,72 ℃延伸45 s,共30 个循环;72 ℃延伸7 min。

蔷薇科Actin基因保守引物作为内参引物,序列为:Actin-F:5’-CAG TGG TCG TAC AAC TGG TAT-3’;Actin-R:5’-AGG TAG CTC ATA GCT CTT CTC-3’。对所设计的引物POD-F、POD-R以及Actin基因进行24、27、30、35、40 个循环数条件的优化。使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,用应凝胶成像仪照相并保存电泳图片。

1.3.5 pMD18-POD的制备

采用上述1.3.4节得到的cDNA为模板,用POD-F和POD-R为引物再次进行PCR扩增[22]。采用Omega琼脂糖凝胶回收试剂盒,按照说明书对PCR产物纯化回收。回收产物与T载体连接,参照pMD18-T Vector的说明书进行操作,产物于4 ℃保存备用。

1.3.6 原核载体的构建

1.3.6.1 引物设计及目的片段的获得

以携带目的基因的重组质粒(pMD18-POD)为模板,以POD-ORF-F、POD-ORF-R为引物进行PCR扩增,以获得基因的读码框(open reading frame,ORF)编码区序列。引物序列如下:POD-ORF-F:CGCGGATCC ATGGCTTCTTCTTCTTCTTCCAGAG,下划线部分为Bam HⅠ位点;POD-ORF-R:CCGCTCGAGCTAGTCCC GGATTTTATTGGCAAC,下划线部分为Xho Ⅰ位点。引物由上海生工生物工程有限公司合成。扩增程序为:在PCR仪中94 ℃预变性4 min 后,94 ℃变性45 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环,最后72 ℃延伸7 min 结束反应。2%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物。采用Omega琼脂糖凝胶回收试剂盒,按照说明书对PCR产物纯化回收,获得目的片段。

1.3.6.2 目的片段与pET-32a(+)载体的连接

将RT-PCR产物Bam HⅠ和Xho Ⅰ双酶切,建立50 μL酶切体系,反应条件:37 ℃反应4 h,2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。同样将表达载体pET-32a(+)用Bam HⅠ和Xho Ⅰ双酶切,采用Omega公司的胶回收试剂盒,回收并纯化产物,通过2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。将RT-PCR经双酶切后产物与经双酶切的pET-32a(+)载体定向连接,反应条件:16 ℃连接过夜[23]

1.3.6.3 重组质粒DNA的转化

参照刘晓峰[24]的方法。采用氯化钙法制备E.coli BL21菌株感受态细胞,并转化。取出-70 ℃保存的大肠杆菌BL21菌株感受态细胞于冰上放置3 min,5 μL连接产物加入100 μL感受态细胞中,混匀,置于冰上30 min, 42 ℃水浴中热击90 s,立即冰浴2 min。然后加入800 μL无抗生素的SOC新配制液体培养基,混匀后在37 ℃摇床(150×g)中预培养60 min。吸取150 μL菌液涂布于含有100 mg/L氨苄青霉素(ampicillin,Amp)的LB固体培养基平板上,37 ℃过夜培养。

1.3.6.4 重组质粒DNA的小量提取及酶切鉴定

重组质粒DNA的提取参照上海生工生物工程有限公司质粒小量提取试剂盒说明书进行。用Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切检测目的片段插入情况,反应条件:37 ℃反应4 h,琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

1.3.7 鸭梨POD基因原核表达的检测

1.3.7.1 IPTG诱导剂加入量的优化

参考文献:[25]方法,挑取带有重组质粒pET-32apbPOD的菌液接种至含有Amp(100 μg/mL)的LB液体培养基中,在37 ℃、250×g振荡培养过夜,第2天按1%的接种量接种到新鲜的Amp(100 μg/mL)的LB液体培养基中,培养到OD600nm在0.6时,加入不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导剂,使菌液最终浓度为0.1、0.4、0.8、1.0 mmol/L。在37 ℃条件下诱导表达3 h,离心收集菌体。

1.3.7.2 蛋白样品的制备

重组表达菌液100 mL 5 000×g离心20 min,加入石英砂和液氮研磨后,加入10 mL磷酸盐(pH 7.0)并对其冰浴超声波破碎,功率400 W,超声5 s,间隔10 s,共20次,20 000×g离心10 min,收集上清液备用。

1.3.7.3 电泳检测蛋白表达

采用1 2%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测蛋白表达情况。将100 μL样品和100 μL 2×SDS样品缓冲液在1.5 mL微离心管中充分混合,煮沸10 min。用微量注射器缓慢上样,尽量使样品在上样孔的底部成一均匀薄层,低分子质量蛋白质Marker上样量为10 μL;样品上样量为15 μL。空置的加样加等体积1×SDS的空白样品缓冲液,避免相邻泳道样品的扩散。采用40 V恒压电泳,当样品进入浓缩胶后改为60 V恒压电泳。待溴酚蓝到达底部时,停止电泳。考马斯亮蓝染色45 min。脱色,直至背景脱去。最后测定总蛋白含量。

1.4 数据处理与分析

数据采用Excel 2010软件进行统计分析,用SPSS 17.0进行方差分析和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 成熟度及降温方式对鸭梨果心褐变率的影响

图1 成熟度及降温方法不同对鸭梨果心褐变率的影响
Fig.1 Effects of different cooling methods on fruit core browning rate of ‘Yali’ pears

从图1可以看出,6 种处理的鸭梨果心褐变率的变化趋势都是随着贮藏期的延长逐渐上升的,但是处理之间差异明显(P<0.05),说明成熟度及降温方式对采后鸭梨果心褐变率影响较大。可明显看出中采鸭梨的褐变率低于早采和晚采,差异极显著(P<0.01),中采鸭梨果心出现褐变的时间为贮藏40 d,而晚采鸭梨在贮藏20 d时就已经出现了褐变,其褐变情况最严重。可能由于晚采鸭梨成熟度较高,贮藏后期衰老严重导致褐变严重[26]。从降温方式来看,缓慢降温处理的果心褐变率都低于同期采收经急速降温处理的鸭梨。尤其中采缓降的鸭梨褐变率明显低于其他组(P<0.01),而晚采急降的褐变情况最为严重。到贮藏后期,褐变率达到了90%以上。

2.2 成熟度及降温方法不同对鸭梨采后POD基因表达量的影响

2.2.1 对采后鸭梨果心POD基因表达量的影响

通过RT-PCR技术对早采、中采、晚采鸭梨果实采用急速降温和缓慢降温两种方式及不同贮藏时间鸭梨果心POD基因表达变化如图2所示,其中Actin基因作为内参基因。结果表明,随着贮藏时间的延长,鸭梨果心POD基因的表达量呈缓慢降低趋势;从条带亮度上看,相同贮藏时间相同降温处理的鸭梨果心POD基因含量:中采鸭梨POD基因表达量高于早采鸭梨果心表达量,早采鸭梨果心POD基因表达量高于晚采鸭梨果心POD基因表达量。从降温方式来看,缓慢降温处理的鸭梨果心POD基因表达量高于同时期采收经急降温处理的鸭梨果心POD基因表达量。这一结果与上述的鸭梨果心的褐变率变化趋势一致,说明POD基因的表达量与鸭梨果心的褐变具有密切的联系。

图2 不同降温方法对鸭梨果心PPOODD基因表达的影响
Fig.2 Effects of different cooling methods on POD expression in fruit core of pears

2.2.2 对鸭梨采后果肉POD基因表达量的影响

通过RT-PCR技术对早采、中采、晚采鸭梨果实采用急速降温和缓慢降温两种方式及不同贮藏时间鸭梨果肉POD基因表达变化如图3所示,其中Actin基因作为内参基因。结果表明,随着贮藏时间的延长,鸭梨果肉POD基因的表达量呈缓慢降低趋势。从条带亮度上看,相同贮藏时间相同降温处理的鸭梨果肉POD基因含量:中采鸭梨POD基因表达量高于早采鸭梨果肉表达量,早采鸭梨果肉POD基因表达量高于晚采鸭梨果肉POD基因表达量,并且缓慢降温处理的鸭梨果肉POD基因表达量高于同时期采后经急降温处理的鸭梨果肉POD基因表达量。

图3 成熟度及降温方法不同对鸭梨果肉POD基因表达的影响
Fig.3 Effects of different cooling methods on POD expression in pulp of pears

2.3 鸭梨果实pbPOD基因的原核表达

2.3.1 原核表达载体构建

图4 PCRR扩增PPOODD基因ORF编码区
Fig.4 PCR-ampli fi ed products of POD gene

用引物POD-ORF-F和POD-ORF-R对其ORF扩增得到一条约1 000 bp的片段,如图4所示。利用NCBI上提供的ORF Finder对POD序列进行分析,发现鸭梨POD基因包含一个1 011 bp的编码区(CDS),与图4中显示的条带相符合。目的片段经Bam HⅠ和Xho Ⅰ双酶切回收后,经T4连接酶连接插入到经同样限制性内切酶双酶切pET-32a(+)载体上,构建了原核表达载体pET-32a-pbPOD。将其转化E. coli BL21菌株感受态细胞内,进行菌液PCR鉴定以及Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,结果如图5所示,说明目的片段已经正确插入pET-32a(+)载体中,原核表达载体构建成功。将构建成功的重组质粒进行测序,测序结果与NCBI上发表序列比对,相似性为100%,且目的片段插入方向与读码框正确,测序结果显示该片段与编码序列完全一致。因此鸭梨POD基因原核表达载体构建成功。

图5 重组pET-32a-pbPOD质粒双酶切检测
Fig.5 Restriction enzyme digestion map of pET-32a-pbPOD

2.3.2 鸭梨果实pbPOD的原核表达

图6 pET-32a-pbPOD融合蛋白在不同浓度IPTG诱导下的表达
Fig.6 Expression of pET-32a-pbPOD fusion protein at different concentrations of IPTG

重组表达质粒转入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)后,37 ℃条件下在IPTG浓度0.0、0.1、0.4、0.8、1.0 mmol/L诱导3 h后获得细菌。从12% SDS-PAGE分析可见(图6),重组体经IPTG诱导后出现一条特异条带,分子质量大约38 kD的新蛋白,然而未诱导的重组质粒却没有此特异条带,新蛋白与理论上鸭梨POD分子质量一致,因此说明得到的新蛋白是目的蛋白。结果表明重组质粒pET-32a-pbPOD在IPTG诱导下产生了重组蛋白,并得以高效表达;从表达趋势上看,0.4 mmol/L IPTG诱导的重组蛋白表达量最高。说明POD可以在体外表达,且表达量较高,为进一步研究POD表达量对鸭梨果实褐变的机理提供了理论参考。

3 讨论与结论

本实验选择的原核表达载体是pET系列融合表达系统中的pET-32a(+),它是IPTG诱导型表达载体,它的反应机理是在正常情况下pET-32a(+)载体上的lac阻碍物与lac启动子结合从而抑制其转录,但诱导剂IPTG可以与lac阻碍物结合进而实现目的基因高水平转录。pET-32a(+)载体表达的目的蛋白N端带有His-tag,经过Tag切割后可以获得目的蛋白,由只有6 个组氨酸组成的Hi-tag在pH 8.0时不带电、几乎没有任何免疫原性而且很小,对目的蛋白的分泌、折叠及蛋白结构功能几乎没有影响,更重要的是6His-tag可以螯合Ni2+,可以使表达的目的蛋白在后期分离中通过镍柱分离纯化[27]

大肠杆菌BL21(DE3)plysS菌株带有质粒plysS,具有氯霉素抗性。此质粒含有表达T7溶菌酶的基因,T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰IPTG诱导的表达[28]。适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达,转化效率高[29]

本实验通过半定量RT-PCR分析POD基因表达量的变化,结果表明POD基因表达的变化趋势与POD活性以及其同工酶的变化趋势基本一致,也与鸭梨果心褐变指数变化趋势相符[30],说明POD基因的表达量与鸭梨果心的褐变有着密切的联系。

根据POD基因的生物信息学分析结果,本实验选用pET-32a(+)原核融合表达载体和大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株,在37 ℃诱导基因表达,得到了预期的结果,为进一步纯化该蛋白打下了基础。

本研究通过半定量RT-PCR研究发现中采鸭梨的果心和果肉的POD基因的表达量高于早采和晚采。缓慢降温处理的鸭梨果心、果肉POD基因的表达量高于相同成熟度采收经急速降温处理的鸭梨,并且果肉POD基因的表达明显高于果心,中采缓降鸭梨的POD基因表达量最高,晚采缓降最低。实验成功构建原核表达载体pET-32a-pbPOD并转化到原核表达宿主菌BL21(DE3)之中,经诱导剂IPTG的诱导,表达出了目的蛋白POD,其分子质量大约为38 kD,与预测结果一致,并且得出0.4 mmol/L IPTG诱导的重组蛋白表达量最高,为进一步研究POD表达量对鸭梨果实褐变机理提供了理论参考。

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Prokaryotic Expression of POD Gene from ‘Yali’ Pears and Effects of Maturity and Cooling Rate on the Expression of POD Gene during Storage

HAN Yanwen1, LIAN Shuangqiu2, HAN Yunyun1, CHI Ming1, YAN Shijie3,*
(1. College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Beijing Chia Tai Fruit Industry Company Limited, Beijing 101206, China; 3. Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing, College of Food Science and Biological Engineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)

Abstract:In the present study, the relationships between browning development and peroxidase (POD) gene expression in both core and flesh tissues of ‘Yali’ pears subjected to different cooling methods (rapid cooling or slow cooling), as well as those collected at different harvest dates (early, mid and late) were investigated using semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The results showed that the expression level of POD gene in pear core with slow cooling treatment was higher than that in rapidly cooled fruits at the same harvest time, indicating that POD gene was closely related to the browning of pear core. Additionally, the POD activity was the highest in mid harvested pears, followed by early harvested pears, and late harvested pears had the lowest POD activity, which suggested that maturity played an important role in ‘Yali’ pear browning. Also, the prokaryotic expression of POD gene (cDNA) in ‘Yali’ pears was investigated. A prokaryotic expression vector (pET-32a-pbPOD) for POD gene cDNA was established, and then induced successfully to be expressed in E. coli BL21(DE3). This study may provide a foundation for studying the mechanism of the browning of ‘Yali’ pears.

Key words:‘Yali’ pear; browning; POD gene; prokaryotic expression; maturity; cooling rate

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201709007

中图分类号:TS255.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)09-0040-06

引文格式:

韩艳文, 廉双秋, 韩云云, 等. 鸭梨POD基因的原核表达及成熟度和降温方法对其表达量的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(9): 40-45. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201709007. http://www.spkx.net.cn

HAN Yanwen, LIAN Shuangqiu, HAN Yunyun, et al. Prokaryotic expression of POD gene from ‘Yali’ pears and effects of maturity and cooling rate on the expression of POD gene during storage[J]. Food Science, 2017, 38(9): 40-45. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201709007. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-05-24

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31471630)

作者简介:韩艳文(1990—),女,硕士研究生,研究方向为果蔬贮藏与保鲜。E-mail:sxtyhanyw@126.com

*通信作者:闫师杰(1971—),男,教授,博士,研究方向为果蔬贮藏保鲜、食品质量与安全。E-mail:yanshijie@126.com