β-乳球蛋白与黑米花色苷的相互作用

赵焕焦,吕晓玲*,王梦姝,王璐瑶

(天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457)

摘 要:从荧光光谱、同步荧光光谱、紫外-可见光谱、抗氧化能力和分子对接等方面,研究黑米花色苷(black rice anthocyanin,BRA)与β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)在模拟生理条件下的相互作用。结果显示,BRA对β-LG具有较强的荧光猝灭,猝灭方式为静态猝灭,说明二者发生相互结合,同时计算了结合位点数和结合常数,热力学参数表明疏水作用力为其主要的作用力;根据非辐射能量转移理论,结合距离r为3.14 nm。同步荧光光谱结果显示,BRA与β-LG的相互作用影响乳球蛋白的构象,但不影响色氨酸和酪氨酸的微环境;分子对接结果显示BRA中的主要成分矢车菊-3-O-葡萄糖 苷与β-LG的结合主要是疏水作用力,该结果与热力学参数分析结果相一致。

关键词:黑米花色苷;β-乳球蛋白;荧光光谱;紫外吸收光谱;抗氧化性;分子对接

牛β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)是牛乳中非常重要的乳球蛋白,含量占总乳球蛋白的50%~55%[1],作为功能性配料在食品加工中广泛使用。目前为止,β-LG的结构已经研究的非常清楚,β-乳球蛋白分子由162个氨基酸残基组成,分子质量为18.4 kD,在生理条件下以二聚体形式存在[2]。Stojadinovic等[3]在模拟的胃肠道消化条件下通过荧光光谱和圆二色谱研究了β-LG与茶、咖啡、可可中的多酚提取物之间的非共价相互作用,研究发现p H值对多酚-蛋白质之间的结合常数具有较大的影响,在模拟的胃肠道消化条件下,多酚-蛋白质系统较稳定。Kanakis等[4]通过光谱分析和分子对接的方法研究β-LG与多种茶多酚在生理pH值条件下的相互作用,结果显示茶多酚与β-LG之间的结合力为弱结合力,多酚结合与蛋白质可以改变蛋白质的二级结构,导致蛋白质的β-折叠和α-螺旋含量增加,使蛋白质结构更加稳定。

黑米花色苷(black rice anthocyanin,BRA)为从黑米中提取的生物活性物质,具有抗氧化[5]、降血脂[6]、提高视力、抗肿瘤[7]、抗炎[8]和抗菌、预防动脉粥样硬化[9]、预防肥胖[10]、改善缺铁性贫血[11]等生物活性。BRA在体内发挥作用的过程中,花色苷需要运送到细胞中,而该过程会受到蛋白质的影响[12]。在体内花色苷与蛋白质结合过程中,游离花色苷与结合花色苷之间达到一定的平衡[13]。因此研究BRA与蛋白质的相互作用对了解花色苷在体内的运输、吸收具有重要作用,而BRA与β-LG的相互作用鲜有报道,因此本研究从光谱学、抗氧化和分子对接等方面研究BRA与β-LG之间的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

β-LG 美国Sigma公司;BRA(花色苷含量为30%)陕西森弗天然产物有限公司;其他试剂为国产分析纯;实验室用水为二次去离子水。

1.2 仪器与设备

RF-5301荧光分光光度计 日本岛津公司;TU-1810紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;XMTD-204水浴锅 天津欧诺仪器仪表有限公司;PB-10 pH计 赛多利斯贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

用0.05 mol/L、pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液(内含有0.1 mol/L NaCl,维持缓冲液的离子浓度)配制β-LG的储备液,浓度为2.0×10-5mol/L;并用Tris-HCl缓冲液配制浓度为1.0×10-4mol/L的BRA溶液(以含量最高的矢车菊-3-O-葡萄糖苷分子质量(449.2 D)作为花色苷的近似分子质量)。β-LG和BRA的溶液均需现用现配。

1.3.2 紫外-可见光谱检测

在10 mL离心管中 加入1 mL β-LG储备液,再加入不同量的BRA溶液,后加入Tris-HCl缓冲溶液定容至10 mL,使BRA的浓度分别为0、1×10-5、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、10×10-5mol/L,振荡混匀,在室温条件下静置20 min,使两者充分反应。用紫外分光光度计测定190~400 nm波长处的紫外-可见吸收光谱。

1.3.3 荧光光谱检测

在10 mL离心管中加入1 mL β-LG储备液,再加入不同量的BRA溶液,后加入Tri s-HCl缓冲溶液定容至10 mL,使BRA的浓度分别为0、1×10-5、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、10×10-5mol/L,振荡混匀,分别在299、306、310 K中的水浴锅中,恒温水浴20 min。在激发波长为278 nm,发射波长为290~500 nm,激发和发射狭缝均为3 nm的条件下用荧光分光光度计进行检测。在∆λ为15 nm和60 nm条件下,测样品的同步荧光光谱。

1.3.4 DPPH法测定抗氧化

称取7.9 mg 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)溶解于100 mL无水乙醇中,配制成浓度为2 ×10-4mol/L的DPPH工作液。用Tris-HCl缓冲液分别配制1×10-5mol/L的β-LG溶液和1×10-4mol/L BRA溶液以及它们的混合溶液,静置20 min后,取1 mL DPPH工作液与待测溶液进行混合,以无水乙醇代替样品为空白(A空白),以无水乙醇代替DPPH为对照(A对照)。室温条件下避光处静置反应30 min,使用紫外分光光度计在517 nm波长处测定吸光度(A样品),平行测3 次,并计算各样品的DPPH自由基清除率,如式(1)所示。

1.3.5 分子对接

β-LG三级结构来自RCSB蛋白质数据库(蛋白质编号:2Q2M),矢车菊-3-O-葡萄糖苷的三级结构从美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)的Pubchem Compound中获得,并使用D iscover studio 2.5软件对蛋白质和C-3-G的三维结构进行对接前处理。选用Autodock 4.2.6软件进行 分子对接,用LGA 算法预测C-3-G 与β-LG对接时可能存在的构型。通过能量最低理论选择最优结果,并通过Ligplus程序和Discover studio 2.5软件对得到的最优对接结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 BRA与β-LG的荧光光谱的影响

蛋白质中因含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等发色团而具有内源性荧光的特性[14]。图1为在278 nm的激发波长、290~500 nm的发射波长范围下,加入BRA对β-LG荧光光谱的影响。从图1可以看出,随着BRA浓度的增加,β-LG在334 nm左右有最大发射波长,而BRA在此范围内没有发射峰,不会造成干扰,β-LG在334 nm的荧光强度呈现有规律的降低,说明BRA与β-LG发生了相互作用,β-LG的内源性荧光发生了猝灭。

图1 不同浓度的BRA溶液对β-LG荧光光谱的影响
Fig.1 Fluorescence spectra of β-LG in the presence of various concentrations of BRA

2.2 BRA与β-LG相互作用的荧光猝灭机理研究

荧光猝灭机理根据随温度变化的特点可以分为静态猝灭和动态猝灭[15]。静态猝灭是由于分子之间形成复合物而导致荧光猝灭,具有随着温度的升高,猝灭常数下降的特点。动态猝灭是分子间发生相互碰撞导致荧光强度下降,该过程会受到扩散效应的影响,所以具有随着温度的升高,动态猝灭常数会增大的特点。根据Stern-Volmer方程[16]可以计算出不同温度条件下的猝灭常数,从而可以初步判断该反应的荧光猝灭机理:

式中:F0为β-LG未加入花色苷时的荧光强度;F为β-LG加入花色苷的荧光强度;Kq为猝灭速率常数/(L/(mol•s));Ksv为猝灭常数/(L/mol);[Q]为BRA的浓度/(mol/L);τ0为无花色苷时蛋白质的平均荧光寿命/s。一般认为,10-8s为生物大分子的平均荧光寿命[4]

图2 不同温度条件下β-LG与BRA的Stern-Volmeerr曲线图
Fig.2 Stern-Volmer plots of β-LG interacting with black rice anthocyanin at three te mpuratures

表1 不同温度条件下β-LG与BRA的Stern-Volmer的相关参数
Table1 Stern-Volmer parameters of β-LG quenching caused by BRA at three different temperatures

注:R2为线性相关系数。

从图2、表1可以看出,在实验研究的浓度范围内,F0/F与[Q]具有很好的线性关系,说明在该反应中可能只存在一种猝灭机理[18],随着温度的升高,猝灭常数Ksv呈现下降的趋势,可以推断BRA与β-LG的荧光猝灭机理属于静态猝灭方式,且不同温度条件下的猝灭速率常数Kq值都大于2×1010L/(mol•s),这说明BRA对β-LG的猝灭方式应该主要是形成了稳定复合物的静态猝灭[19]

2.3 BRA与β-LG的结合常数和结合位点数

在静态猝灭过程中,可由双对数曲线方程计算结合常数Ka、结合位点数n:

式中:Ka为小分子与乳球蛋白之间的结合常数/(L/mol);n为结合位点数。

表2 BRRAA--β-LG复合物的结合参数和热力学参数
Tab le 2 Binding parameters and thermodynamic parameters of BBRRAA--β-LG complex

从表2可以看出,BRA与β-LG的结合位点数n都在1附近,说明BRA与β-LG结合可能是形成了1∶1的复合物。同时可以看到结合常数Ka随着温度的升高逐渐 降低,说明该反应可能是一个放热的过程,结合常数Ka数量级在104,说明结合能力较强,BRA-β-LG复合物具有较好的稳定性[20]

2.4 热力学参数与相互作用力的确定

小分子与蛋白质之间的作用力主要为疏水作用力、静电相互作用、氢键以及范德华力[21]。可以根据反应热力学参数的大小和正负来判断结合的主要作用类型。BRA与β-LG之间的相互作用符合热力学公式。

式中:ΔG为生成自由能变/(kJ/mol);ΔS为熵变/(J/(mol•K));ΔH为焓变/(kJ/mol);Ka为结合常数;R是气体常数,8.314 J/(mol·K);当温度变化不大时,反应的ΔH、ΔS可看作常数。

根据公式计算得到的该反应热力学参数如表2所示,ΔG<0说明BRA与β-LG之间的反应是自发的,根据Ross等[22]总结的作用类型与其热力学参数的关系可以看出,ΔH>0且ΔS>0,表明BRA与β-LG之间的主要作用力是疏水作用力。

2.5 BRA与β-LG的结合距离

当供体的发射光谱(蛋白质)与受体的吸收光谱(小分子)发生重叠时,且二者之间的最大距离小于7 nm,供体和受体之间存在非辐射能量转移,使蛋白质的荧光强度下降[22]。受体与供体之间的距离可以由下列公式进行计算。

式中:K2为偶极空间取向因子,K2=2/3;N为介质折射常数,取水和有机物折射指数的平均值1.336;F(λ)为荧光给体在波长为λ时的荧光强度;ε(λ)为受体在波长λ时的摩尔吸光系数;R0是E为50%时的临界能量转移距离;φ为蛋白的荧光量子产率,通常取蛋白质中色氨酸的量子产率0.15;J为给体荧光发射光谱与受体吸收光谱的重叠积分[24]

图3 BRA吸收光谱与β-LG的荧光光谱的重叠图
Fig.3 Spectral overlap (shaded portion) of black rice anthocyanin absorption spectrum and β-LG fl uorescence spectrum

由图3可知,β-LG的荧光光谱与BRA的紫外吸收光谱发生了重叠。根据公式计算得J=4.492× 10-15cm3/(mol•L),R0=2.21 nm,E=0.108,r=3.14 nm,可以看出结合距离r小于7 nm,所以BRA与β-LG之间发生能量转移的可能性很高[25]

2.6 BRA对β-LG构象的影响

2.6.1 BRA对β-LG的紫外吸收光谱的影响

图4 不同浓度BRRAA与β-LG的紫外吸收光谱图
Fig.4 UV-Vis absorption spectra of β-LG with different concentrations of balck rice anthocyanin

图4 为在pH 7.4生理条件下,BRA与β-LG相互作用的紫外吸收光谱图。固定β-LG浓度,加入不同浓度的BRA溶液,随着BRA含量的增加,BRA-β-LG混合体系位于209 nm附近的紫外吸收峰逐渐增加,并发生了红移现象(209~217 nm),位于278 nm峰也随着花色苷浓度增加而升高,但峰没有发生位移,表明BRA与β-LG之间发生了相互作用,引起了肽链的伸展和蛋白空间结构的变化[26],生成了新的构象改变了紫外光谱[27],进一步证明了BRA与β-LG之间为静态猝灭,与荧光检测的结果相一致。2.6.2 同步荧光光谱研究BRA对β-LG构象影响

图5 加入不同浓度BRAA后的β-LG同步荧光光谱图
Fig.5 Synchronous fl uorescence spectra of β-LG with different concentrations of balck rice anthocyanin

在小分子与蛋白质相互作用的研究领域,同步荧光光谱经常用来研究荧光基团微观结构的变化以及蛋白质构象的变化。在蛋白质的同步荧光光谱中,当∆λ=15 nm和∆λ=60 nm时,分别显示蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的光谱特性[28]。从图5可以看出,随着BRA浓度的增加,β-LG的同步荧光强度逐渐下降,但最大发射波长没有发生迁移,说明BRA改变了β-LG的构象,但对色氨酸残基和酪氨酸残基所处的微环境疏水性影响不大。

2.7 β-LG对BRA抗氧化性的影响

由图6可知,BRA、β-LG、BRA-β-LG的DPPH自由基清除率分别为72.56%、36.66%和85.72%,加入β-LG后,与BRA自身的抗氧化能力相比只增加了13.16%,这种增加可能是由于增加了一种抗氧化剂[29],而β-LG与BRA的抗氧化能力之间又发生了遮掩作用。黄酮类化合物主要是通过羟基与自由基反应,形成共振稳定的半醌式自由基而中断氧化链式反[30]。这可能是由于BRA结构中的羟基参与β-LG相互作用中的氢键形成,导致羟基的屏蔽。

图6 6 β-LG对BRA抗氧化性的影响
Fig.6 Effect of β-LG on antioxidant capacity of black rice anthocyanin

2.8 矢车菊-3-O葡萄糖苷与β-LG分子对接

图7 矢车菊-3-O-葡萄糖苷与β-LG复合物的最优对接构象
Fig.7 Best docked conformations of C-3-O–β-LG complexes

通过AUTODOCK软件对矢车菊-3-O-葡萄糖苷与β-LG进行分子对接,得到的最优结果如图7所示。从图7B可以看出,有12 个氨基酸残基参与了与矢车菊-3-O-葡萄糖苷的对接,其中Leu31、Pro38、Leu39、Val41为疏水氨基酸并且与矢车菊-3-O-葡萄糖苷很近,所以它们之间存在较强的疏水作用力。图7C显示出矢车菊-3-O-葡萄糖苷与β-LG之间形成3 个氢键,分别为矢车菊-3-O-葡萄糖苷分子B环上3’-OH与β-LG的Lys60、Lys69之间、A环上7-OH与β-LG的Glu112之间,氢键有利于BRA-β-LG复合物的形成,使矢车菊-3-O-葡萄糖苷的三级结构更加适应于β-LG的三级结构[31]。因此在矢车菊-3-O-葡萄糖苷与β-LG结合过程中疏水作用力发挥着主要作用,还兼存在着氢键的作用。

3 讨 论

本研究从光谱学,抗氧化和分子对接等方面研究BRA与β-LG之间的相互作用。结果显示,BRA与β-LG的反应为静态猝灭机制,生成BRA-β-LG复合物,β-LG与BRA之间存在着能量转移也导致β-LG的荧光强度下降。通过热力学参数计算得到,它们之间主要作用力为疏水作用力,这一结果通过分子对接得到了印证。同步荧光光谱结果显示,BRA加入导致β-LG构象发生变化,但不影响酪氨酸和色氨酸残基的微观环境,与紫外分光检测结果一致。抗氧化能力检测结果显示,与β-LG相互作用后,BRA DPPH自由基清除的能力上升,但增加程度低于加入β-LG的抗氧化性,说明β-LG与BRA之间发生抗氧能力的屏蔽作用。

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Interaction between β-Lactoglobulin and Black Rice Anthocyanin

ZHAO Huanjiao, LÜ Xiaoling*, WANG Mengshu, WANG Luyao
(College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Abstract:In this work, we studied the interaction between black rice anthocyanin (BRA) and β-lactoglobulin (β-LG) by fl uorescence spectroscopy, synchronous fl uorescence spectroscopy, ultraviolet-visible spectroscopy, antioxidant capacity and molecular docking under simulated physiological conditions. The results showed that black rice anthocyanin had a strong abil ity to quench the fl uorescence of β-lactoglobulin in a static mode. The bindin g const ants (Ka) and site number s (n) were obtained at diff erent temperatures. The m ajor interacti on force was hydrophobic interact ion in the binding of BRA to β-lactoglobulin based on the thermodynamic parameters. According to Förster’s non-radiative energy transfer theory, the donor-acceptor proximity in BRA-β-LG complex was calculated as 3.14 nm. The synchronous fluorescence spectra reve aled that interaction with BRA caused conforma tional changes in β -LG, but did not affect the microenvironme nt of tryptophan and tyrosine residues. Molecular docking indicated that the main driving force of the interaction between cyaniding-3-O-glucoside (the major component of black rice anthocyanin) and β-lactoglobulin was hydrophobic interaction, which was consistent with the result obtained from thermodynamic parameter analysis.

Key words:black rice anthocyanin (BRA); β-lactoglobulin (β-LG); fl uorescence spectroscopy; ultraviolet spectroscopy; antioxidant capacity; mol ecular docking

DOI:10. 7506/spkx1002-6630-201709014

中图分类号:TS202.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)09-0085-06

引文格式:

赵焕焦, 吕晓玲, 王梦姝, 等. β-乳球蛋白与黑米花色苷的相互作用[J]. 食品科学, 2017, 38(9): 85-90. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201709014. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Huanjiao, LÜ Xiaoling, WANG Mengshu, et al. Interaction between β-lactoglobulin and black rice anthocyanin[J]. Food Science, 2017, 38(9): 85-90. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx10 02-6630-201709014. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-04-21

基金项目:“十二五”国家科技支撑计划项目(2011BAD23B02)

作者简介:赵焕焦(1992—),女,硕士研究生,研究方向为食品添加剂。E-mail:zhaohuanjiao0203@163.com

*通信作者:吕晓玲(1960—),女,教授,硕士,研究方向为食品营养与安全。E-mail:lxling@tust.edu.cn