白腐乳中呈味肽的分离与鉴定

摘要：目的：从白腐乳中寻找呈味肽，分析其氨基酸序列，人工合成肽样品，研究其滋味特性。方法：白腐乳提取液经过超滤、Sephedex G-15葡萄糖凝胶过滤层析，分离出3 个呈味组分，通过感官评价筛选出呈鲜效果最优的组分，采用反相高效液相色谱对其进一步分离纯化，选择峰面积最大的组分，使用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱结合De Novo软件分析呈味肽的氨基酸序列，人工合成肽样品，对合成肽样品的呈味特性进行分析。结果：在白腐乳中发现并确定序列的肽链3 条，其氨基酸序列分别为：Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro、Asp-Arg-Glu-Lys-Phe-Asp-Glu、Asp-Glu-Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro。其中肽Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro具有鲜味，肽Asp-Glu-Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro兼具鲜味与酸味，肽Asp-Arg-Glu-Lys-Phe-Asp-Glu虽无明显特征滋味，但在味精溶液中则体现出较强的增鲜效果。结论：腐乳的鲜味不仅仅来自于谷氨酸等氨基酸成分，还与小分子肽类的呈鲜作用有关。

腐乳是中国传统发酵食品之一，通过在豆腐胚上接种毛霉等微生物发酵而成，营养丰富、质地细腻柔滑、味道鲜美醇厚，是我国一种常见的佐餐食品。伴随着发酵过程，豆腐胚所含的蛋白质在微生物蛋白酶的作用下逐步水解，产生诸如肽类、氨基酸等小分子物质，赋予腐乳的特征滋味[1]。目前对腐乳中呈味物质的探究大多集中于游离氨基酸，如朱洪康等[2]通过研究绍兴腐乳发酵过程中蛋白质水解与酪氨酸含量变化的规律，发现腐乳中白点的形成是由蛋白质过度水解造成的；蒋丽婷等[3]分析比较了4 种白腐乳的游离氨基酸比例，发现了明显差异；Han Beizhong等[4]通过研究腐乳连续发酵过程中的总氨基酸及游离氨基酸变化，发现红腐乳、白腐乳、青方腐乳中的游离氨基酸都存在差异。而对于腐乳中肽类呈味特性的研究，则仅局限于分析肽类在发酵过程中的含量变化，如苏伟等[5]研究了腐乳发酵过程中小分子肽含量的动态变化规律；倪莉等[6]对腐乳中的大豆蛋白酶解物进行研究，分析了其中的肽类和游离氨基酸含量；呼晴等[7]研究了黄色毛霉发酵腐乳过程中腐乳蛋白含量等的变化；潘进权等[8]利用各种分析技术对发酵过程中大豆蛋白的变化进行了检测分析，包括蛋白质水解度、多肽分子质量分布以及氨基酸组成等。目前鲜见对腐乳中呈味肽进行分离和结构分析的文献。

目前在一些其他食品中已经发现了具有呈味特性的肽类[9-10]。如从暗纹东方鲀鱼肉汤中分离出一种具有鲜味和浓厚感的八肽，虽无明显呈味特性，但能增鲜、改善食品风味[11]；从鱼的水解蛋白浓缩液和花生蛋白水解液中，也分离出了的呈现鲜味的短肽[12-13]。此外赵谋明等[14]对花生粕进行酶解，探究其中的呈味肽及其特性；Rhyu等[15]研究了大豆提取液中的小分子肽，结果发现分子质量为500～1 000 u的肽具有最强的鲜味；彭皖皖等[16]通过酶水解的方式处理小麦蛋白，以获得呈味肽并进开展探索等；Han Fuliang等[17]分离鉴定了中国传统米酒-黄酒中的小分子肽类物质；党亚丽等[18]从巴马火腿酶解物中分离出与火腿呈味特性近似的六肽；刘源等[19]也从东方鲀中分离出具有显著浓厚感的七肽。

根据对腐乳的风味及生产过程的分析，在腐乳中极有可能存在具有呈味特性的肽类。本实验通过超滤和凝胶柱层析对腐乳中的水溶性蛋白进行分离，利用反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）对其进行进一步分离纯化，通过基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（matrixassisted laser analytical ionization time-of-flight/time-offl ight mass spectrometry/mass spectrometry，MALDI-TOF/ TOF MS/MS）分析其氨基酸序列，从一级结构上对其呈味特性进行分析，对筛选出来的白腐乳呈味肽进行合成，分析其呈味特性，进行研究验证。通过对腐乳呈味肽的探究，有助于发掘新型呈味肽、研发调味新品、丰富呈味理论；同时有助于深入了解腐乳品质、改善腐乳生产工艺。

1 材料与方法

Sephdex G-15葡聚糖凝胶美国GE公司；乙腈天津科密欧化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

HD-3型紫外检测仪、层析玻璃柱（2.0 cm×60 cm）上海沪西仪器厂；0.22 μm微孔滤膜天津津腾公司；Milli-Q Gradient超纯水系统、Labscale小型切向流超滤系统、Pellicon XL（PLCCC5 50 cm2）超过滤膜管匣美国Millipore公司；LC-20AT 高效液相色谱仪日本岛津公司；Jupiter Proteo C18柱（90 Å，250 mm×4.6 mm， 4 μm）美国Phenomenex公司；ABI4700 MALDI-TOF/ TOF MS/MS仪美国应用生物系统公司。

将腐乳块从瓶中取出、沥干，去掉坯膜，均质。称取样品，以1∶4（m/V）的比例加入重蒸水，40 ℃搅拌1 h，在2 000×g，4 ℃条件下离心30 min，新星普通滤纸过滤；滤液在4 ℃条件下1 000×g离心30 min，用Whatman No.1滤纸进行2 次过滤后，将滤液冻干；冻干粉末溶解于5 倍的重蒸水中，用0.22 μm滤膜过滤，滤液即为水溶性物质提取液[20]。

将1.3.1节中水溶性物质提取液在25 ℃、0.4 MPa的条件下经Pellicon XL（50 cm2）超过滤膜管匣超滤，将分子质量在5 000 u以下的部分截留出来。收集滤过液，冷冻干燥后于－18 ℃保存。

取1.3.2节中冻干粉用超纯水溶解，经0.22 μm水相滤膜过滤后，通过Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱进行分离。分离条件：玻璃层析柱2.0 cm×60 cm，上样量3 mL，流速1 mL/min，检测波长280 nm。

根据GB/T 16291.1—2012《感官分析选拔、培训与管理评价员一般导则》第1部分：优选评价员的要求，对感官评定小组成员进行培训。采用滋味稀释分析法[21-22]，并根据实验状况对其进行适当调整。将样品定容至100 mL，配成10 mg/mL 溶液，按体积比1∶1用超纯水进行逐步稀释，每次取各组分逐步稀释的样品溶液5 mL，按照质量浓度降低的顺序呈送给8 个经过感官培训的评定员，每个稀释水平溶液采用三角测试法[23]进行评定。当某个稀释水平的溶液与两个空白（水）的滋味差异刚好能被识别出来时，记录此时的稀释倍数，各评定员记录倍数的平均值即为稀释值。

将凝胶层析分离出的组分冻干粉，用超纯水溶解为18 mg/mL的溶液，经RP-HPLC进行进一步分离纯化。色谱柱为Jupiter Proteo C18柱，柱温30 ℃，进样体积20 μL，流动相A：0.1%甲酸溶液，流动相B：乙腈；梯度洗脱：0～10 min：90%～10% A，10%～90% B；10～20 min：95% A，5% B；流速0.6 mL/min；检测波长214 nm。将色谱峰分别收集，浓缩冷冻干燥后，于－18 ℃保存。

将1.3.5节中冻干粉用超纯水溶解为2.4 mg/mL的溶液，取1.0 μL 样品点样于MALDI不锈钢靶板上，在室温条件下自然干燥。另点1.0 μL 10 mg/mL的α-氰基-4-羟基肉桂酸溶剂（溶液为50%的乙腈）在室温条件下自然干燥，作空白对照。通过MALDI-TOF/TOF MS/MS对样品和基质进行分析，基质和样品的肽指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF）质量扫描范围为300～1 500 u。根据De Novo软件给出的可选序列再结合人工分析确定肽段可能序列。

将1.3.6节中经分离纯化鉴定的呈味肽为目标肽，委托吉尔生化（上海）有限公司进行固相化学合成，得到相应多肽。

对合成肽的呈味特性，采用滋味轮廓的方式描述。呈味特性强度的量化采用滋味稀释法，增鲜特性则通过滋味轮廓描述、比较稀释法进行定量评价，同时以滋味增强系数作为其增味作用的量化指标。滋味稀释法（taste dilution analysis，TDA）又称TD值法，其将人的舌头作为生物感应器，检测食品中某滋味物质的阈值。比较稀释法（comparative taste dilution analysis，cTDA）是Ottinger等[24]在对美拉德反应产物中的甜味物质研究时建立的方法，基于TDA的cTDA在大致步骤上与前者相同，但在滋味活性因子（TD值）的测定上有所不同：若测定样品对某种滋味的增强特性，首先将样品溶解于其标准呈味物质的低浓度溶液中，空白对照溶液也改为这种低浓度溶液，按照三角检验法测定其阈值，然后计算其滋味增强系数[21]。

滋味增强系数的测定：在检测某种滋味增效剂对甜味的增强系数时，应首先配制葡萄糖和滋味增效剂的混合溶液，然后进行体积比1∶1的逐步稀释；再配制只含有葡萄糖的标准溶液。再由感官评定员选出与标准葡萄糖溶液有相同的甜味强度的那个混合溶液稀释水平，然后即可按照下式计算滋味增强系数f[23]。

式中：ρ1为标准葡萄糖溶液的质量浓度/（mg/L）；ρ2为混合溶液的葡萄糖质量浓度/（mg/L）。

感官评价、呈味特性研究数据，采用统计分析软件SPSS 22.0作单因素方差分析，结果表示为±s。

2 结果与分析

将超滤样品冻干粉，用超纯水溶解，每次上样3 mL，流速1 mL/min，检测波长280 nm，分离出F-1、F-2及F-3 3 个呈味组分，如图1所示。

图1 白腐乳呈味组分的Sephadex G-15凝胶色谱图
Fig.1 Sephadex G-15 gel chromatographic prof i le of 3 fractions from white sufu

分别将超滤滤过液和经过凝胶层析柱分离得到的F-1、F-2和F-3 3 个呈味组分，制备成冻干粉，进行感官评定，结果见表1。

表1 白腐乳超滤液及凝胶层析分离组分的感官评定结果
Table1 Sensory evaluation of the fractions from white sufu separated by ultra fi ltration and gel fi ltration chromatography

注：F为未经分离的超滤滤过液。

由表1可知，3 个组分的TD值分别为5、2和0，其中样品F-1感官特性与滤液F最为接近，具有突出的呈鲜特性，TD值达到5；样品F-2的鲜味较弱，TD值较低；F-3无明显呈味特性。

结合2.2节感官评定结果，选取呈味特性最好的分离组分F-1进行RP-HPLC，进一步分离纯化，并从F-1中分离出F-1-1、F-1-2和F-1-3 3 个组分。检测波长为214 nm，F-1的洗脱情况如图2所示。

图2 凝胶分离组分F-1的RP-HPLC图
Fig.2 Reversed-phase high performance liquid chromatographic pro fi le of F-1

白腐乳呈味组分F-1经过RP-HPLC分离后，产生F-1-1、F-1-2、F-1-3 3个组分，收集其中峰面积最大的组分F-1-3，采用MALDI-TOF-MS分别对其进行检测，结果如图3所示。

图3 F-1-3在MALDI-TOF-MS中的质谱图
Fig.3 Identif i cation of fl avor peptide F-1-3 by MALDI-TOF-MS

排除基质峰，选取信号较强的3 个离子峰F-1-3a（m/z 791）、F-1-3b（m/z 938）、F-1-3c（m/z 1 035）进行MS-MS分析，3 条肽链的二级质谱如图4所示。

根据其间产生的离子碎片识别肽段的氨基酸序列，并通过De Novo软件从头测序及数据库搜索匹配出多条肽链，选取可信度较高的3 条肽链进行讨论分析，结果见表2。

图4 F-1-3在MALDI-TOF/TOOFF MMSS/MMSS图
Fig.4 Identi fi cation of fl avor peptide F-1-3 by MALDI-TOF/TOF MS/MS

表2 白腐乳凝胶分离组分F-1中鉴定的特征肽段
Table2 Speci fi c peptide sequences identi fi ed in peptide fraction F-1
from white sufu separated by gel fi ltration chromatography

由表2可知，3 条肽链F-1-3a（DFKREP）、F-1-3b（DREKFDE）和F-1-3c（DEDFKREP）氨基酸序列分别为：Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro、Asp-Arg-Glu-Lys-Phe-Asp- Glu、Asp-Glu-Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro。有研究表明，肽的感官特征与其氨基酸的组成密切相关，其味感主要取决于组成氨基酸的原有味感，一般地，Glu、Asp、Gln、Asn 之间相互结合或与Thr、Ser、Ala、Gly、Met（Cys）相互结合形成的多元酸钠盐呈鲜味[25]。同时鲜味分子一般需要有相当于3～9 个碳原子脂链长的肽链[26]。如从牛肉酶解液中分离出的牛肉辛肽Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala具有鲜味[27-28]；崔春等[29]从盐酸脱酰胺面筋蛋白的发酵液中分离纯化得到的一条肽段Asp-Cys-Gly具有明显的鲜味增强效果。综上所述，表2中3 条肽链F-1-3a、F-1-3b和F-1-3c都较为符合鲜味理论现有研究成果，极有可能对腐乳的鲜味呈现积极作用。因此选取以上3 条肽链进行化学合成，以验证其呈味特性。

F-1-3a、F-1-3b和F-1-3c 3 条肽链为目标肽，委托吉尔生化（上海）有限公司进行固相化学合成，得到3 个多肽。分别命名为HC-1（F-1-3a）、HC-2（F-1-3b）和HC-3（F-1-3c），3 条合成肽的纯度均达到95%以上，满足感官评价的需要。

分别配制0.35 g/100 mL的食盐溶液，1 g/100 mL的蔗糖溶液，0.08 g/100 mL的柠檬酸，0.35 g/100 mL的味精溶液，0.08 g/100 mL的奎宁，以这5 种溶液分别作为咸、甜、酸、鲜、苦的评价标准品，采用5 点线性坐标，以标准品为5 分，将某一滋味极弱计做0，某一滋味极强计做10。分别对样品的咸、甜、酸、鲜、苦等滋味打分[30]，结果见表3。

由8个评定员感官评定小组通过描述法对3 条合成肽的水溶液呈味特性进行了语言描述；按照滋味稀释法对其阈值进行测定。取10 mg样品配成2 mL质量浓度为5.0 mg/mL的母液。取200 μL母液，稀释至1 mL，用三角检验法，按体积比1∶1逐渐稀释，直至多数人刚好与另外两个空白对照区分开来，此时的样品质量浓度即为样品的呈味阈值。结果见表3。

表3 合成肽样品的呈味特性与阈值
Table3 Flavor characteristics and umami threshold of the synthetic peptide samples

由表3可知，合成肽HC-1和HC-3呈鲜特性明显，无苦味等不良风味，阈值较味精阈值（300 mg/L）更低，合成肽HC-3在酸味特性上与柠檬酸相当，部分掩盖了其鲜味的呈现；合成肽HC-2无显著呈味特性，但具有明显的浓厚感。

配制样品与味精的混合溶液：样品质量浓度为1 g/L，味精质量浓度为300 mg/L；另外准备2 份300 mg/L的味精溶液作为空白对照。

由8 位评定员比较滋味稀释法分析样品的增鲜程度，按照三角检验法原则，使用时将混合溶液按体积比1∶1逐渐稀释，直至多数人刚好能够与两个空白对照区分开来。此时混合液中味精质量浓度为ρ2。空白对照的味精质量浓度为ρ1，计算滋味增强系数f，结果见表4。

表4 合成肽样品的鲜味增强效果
Table4 Umami-enhancing effects of the synthetic peptide samples

由表4中滋味增强系数f值分析可知，对鲜味的增强效果为合成肽HC-1＝合成肽HC-2＞合成肽HC-3。

经过感官评价的数据分析可知，合成肽HC-1（DFKREP）与合成肽HC-3（DEDFKREP）自身鲜味特性明显，但在鲜味增强效果上合成肽HC-1有与合成肽HC-2相当的特性，而合成肽HC-3则对鲜味的增强几乎没有作用。合成肽HC-2（DREKFDE）虽然5 种基本滋味特性均不明显，但其对鲜味的增味作用最强。

3 结论

通过超滤、凝胶层析、RP-HPLC和MALDI-TOF/TOF MS/MS分析等手段，从广和牌白腐乳中筛选得出3 条具有呈鲜特性的肽链，分别为Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro、Asp-Arg-Glu-Lys-Phe-Asp-Glu、Asp-Glu-Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro。

对人工合成肽样品的呈味特性进行分析，发现肽Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro具有鲜味，肽Asp-Glu-Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro兼具鲜味与酸味，肽Asp-Arg-Glu-Lys-Phe-Asp-Glu虽无明显特征滋味，但在味精溶液中则体现出较强的增鲜效果。研究结果表明腐乳的鲜味不仅仅来自于谷氨酸等氨基酸成分，还和小分子肽类的呈鲜作用有关。

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Isolation and Identif i cation of Flavor Peptides from White Sufu (Fermented Tofu)

LIAO Shun, HU Xuexiao, JIN Erqing, PENG Cong, WU Jianzhong*
(Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

Abstract：Objective: To identify the fl avor peptides from white sufu, analyze their amino acid sequences, and evaluate the taste characteristics of their synthetic counterparts. Methods: Ultra-f i ltrati on and glucose gel Sephedex G-15 fi ltration chromatography were applied to separate flavor fractions from white sufu extracts. The fraction with the best sensory evaluation was further purif i ed by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). The subfraction with the maximum chromatographic peak area was identified by using matrix-assisted laser analytical ionization timeof-flight/time-of-flight mass spectrometry/mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF MS/MS) with De Novo software. The potential fl avor peptides were also artif i cially synthesized and their sensory properties were evaluated. Results: Three fl avor peptides were obtained from white sufu. Their amino acid sequences were identif i ed as Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro, Asp-Arg-Glu-Lys-Phe-Asp-Glu, and Asp-Glu-Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro. The fi rst peptide had obvious umami taste. The third one had both umami and sour tastes. The second had less obvious taste although it could enhance the umami fl avor of sodium glutamate solution. Conclusion: The umami fl avor of white sufu not only cames from amino acids such as glutamate, but also was related to small peptides.

廖顺, 胡雪潇, 金二庆, 等. 白腐乳中呈味肽的分离与鉴定[J]. 食品科学, 2017, 38(9): 113-118. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201709018. http://www.spkx.net.cn

LIAO Shun, HU Xuexiao, JIN Erqing, et al. Isolation and identif i cation of fl avor peptides from white sufu (fermented tofu)[J]. Food Science, 2017, 38(9): 113-118. (in Chinese with English abstract)

基金项目：农业部农业科技成果转化项目（201 4GB2E000037）；广东省科技计划项目（2013B020503051）

作者简介：廖顺（1994—），女，硕士研究生，研究方向为水产品与蛋白质。E-mail：lsbonny@163.com

*通信作者：吴建中（1964—），男，副教授，博士，研究方向为农副产品的深加工及综合利用。E-mail：wjzxlyx@sina.com

白腐乳中呈味肽的分离与鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论