罗 凯，黄秀芳，周毅峰，张 弛 *
（湖北民族学院生物科学与技术学院，生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000）
摘 要：利用人工种植的碎米荠为原料，研究其粗多糖的提取工艺参数及抗氧化活性。首先对提取条件的单因素进行优化，在单因素试验基础上，进行提取条件的响应面优化。单因素优化条件为：质量分数2%复合酶（m（纤维素酶）∶m（果胶酶）=2∶1）、酶解时间90 min、酶解温度60 ℃、酶解pH 4.0。响应面优化结果为：酶解时间91.8 min、酶解温度57.1 ℃、酶解pH 4.17。在此条件下，碎米荠粗多糖提取率最高，粗多糖提取率预测值为4.14%，验证实验得到实际粗多糖的平均提取率为4.07%；与理论预测值相比，其相对误差约为1.62%。抗氧化活性研究结果显示，碎米荠多糖具有抗氧化活性，且效果优于VC。该实验结果为碎米荠多糖的提取以及多糖的性质研究提供理论依据。
关键词：碎米荠；多糖；提取条件；优化
壶瓶碎米荠（Cardamine hupingshanensis），简称碎米荠属1～2 a生草本植物，属十字花科。大部分生长在海拔约1 000 m的山坡林下沟边湿地，全世界发现了大约130 种，我国发现大约40 种。分布于我国南北各地 [1]。碎米荠最初出现在《野菜谱》上 [2]，碎米荠的幼嫩茎叶可以作为珍贵的野菜食用且口感良好。碎米荠药用也有很长的历史 [3]，《食性本草》和《食疗本草》均有相关记载。碎米荠属中大多数种类都可以作为药用，如紫花碎米荠（Cardamine tangutorum）能治黄水疮和筋骨疼痛 [4]；大叶碎米荠（Cardamine macrophylla）当作草药用可以利通小便、止痛和治疗败血病 [5]；华中碎米荠（Cardamine urbaniana）的根状茎可以治哮喘和支气管炎 [6]；光头山碎米荠（Cardamine engleriana）的植株能化痰止咳；弹裂碎米荠（Cardamine impatiens）可以用于月经不调；水田碎米荠（Cardamine lyrata Bunge）和碎米荠（Cardamine hirsuta）可以清热去湿气；弯曲碎米荠（Cardamine fl exuosa）可以清热去湿健胃和止泻 [7]。同时有研究证明碎米荠具有超强的硒聚集功能 [8-12]，其聚集的硒部分与多糖进行结合，因此碎米荠多糖与一般植物多糖相比较，其功能更加丰富。碎米荠多糖不仅可以使癌细胞的DNA合成受阻而抑制癌细胞生长，而且可以通过提高相关酶的活性来拮抗重金属中毒和抗氧化活性的能力 [13-16]。碎米荠多糖的提取效率和质量对于进一步开发碎米荠资源，生产出碎米荠保健品具有十分重要的意义。本实验在对人工种植碎米荠多糖提取条件的探索下，运用响应面法优化复合酶法提取多糖的工艺，并进行其体外抗氧化活性研究，旨在为碎米荠的开发利用提供一定的理论依据。
1.1 材料与试剂
碎米荠采自于恩施市碎米荠人工种植基地。
纤维素酶（15 U/mg）、果胶酶（500 U/mg）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、苯酚、浓硫酸、氢氧化钠、三正丁醇乙醇、氯甲烷、无水乙醇、乙醚（均为分析纯） 成都市科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
500 g XFB-200型多功能粉碎机 永康市小宝电器有限公司；DHG型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；AL204电子天平（精确至0.000 1 g） 梅特勒-托利多仪器有限公司；AKHL-Ⅲ-24超纯水机 成都康宁试验专用纯水设备厂；RE5205型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；5417R型离心机 德国Eppendorf公司；UV-3802H型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；DF-101J型磁力搅拌器、SHZ-D（III）型循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂；DHZ-C大容量冷冻恒温振荡器 江苏太仓市试验设备厂。
1.3 方法
1.3.1 碎米荠粗多糖酶法提取工艺 [17-20]
碎米荠材料干燥粉粹，过80 目筛，60 ℃干燥2 h。称取100 g置于250 mL圆底烧瓶，加石油醚100 mL，75 ℃回流1 h脱脂，过滤，石油醚回收重复利用，滤渣挥干备用。准确称取1 g处理样品，加蒸馏水100 mL，调pH值，升温至50 ℃，加入酶，不同条件下进行酶解，离心，滤液加体积分数95%乙醇溶液使体系中乙醇含量达80%，冰箱静置过夜沉淀。适量水溶解，加入3 倍体积Sevag试剂，振荡、静置、分液，再进行2～3 次振荡分离后醇沉过夜。沉淀再次溶解，定容至10 mL，苯酚-硫酸法测定粗多糖含量，按公式（1）计算提取率：
1.3.2 标准曲线的制作及粗多糖含量的测定
粗多糖含量检测方法及标准曲线的制作参考文献[21-22]。
1.3.3 碎米荠粗多糖提取单因素试验
在碎米荠粗多糖的酶法提取制备过程中，影响提取率最重要的因素是酶的种类和有效质量浓度。为了研究这些因素对粗多糖提取率的影响规律，对反应条件进行设置：控制碎米荠酶解温度为60 ℃，酶解pH值为4，然后分别选择不同质量分数的果胶酶、纤维素酶以及2 种酶的复合酶，对碎米荠粉末进行持续60 min的酶解反应。对提取液进行处理，测定碎米荠粗多糖的提取率。
选取优化后的最优复合酶，控制其他反应条件（如酶解温度60 ℃、pH 4），分别测定酶解时间为30、60、90、120、150 min时碎米荠粗多糖的提取率；根据以上研究结果，选取最优复合酶组合，控制其他反应条件（如酶解时间60 min、pH 4），分别测定酶解温度为30、40、50、60、70 ℃时碎米荠粗多糖的提取率。
1.3.4 响应面优化试验设计
在单因素优化试验的基础上对最优复合酶的酶解时间（A）、酶解温度（B）和酶解pH值（C）3 个因素进行三因子响应面设计，优化碎米荠粗多糖的复合酶提取工艺参数，试验设计的方案见表1。对各因素水平下碎米荠粗多糖提取率进行测定，并以计算所得碎米荠粗多糖的提取率为响应值进行统计学回归分析。
表1 复合酶提取碎米荠粗多糖的响应面试验因素水平
Table1 Coded values and corresponding actual values of factors used in Box-Behnken design
水平因素A酶解时间/minB酶解温度/℃C酶解pH 1 60503.0 0 90604.0 -1120705.0
1.3.5 碎米荠粗多糖体外抗氧化活性实验 [21-22]
分别取不同质量浓度的样品溶液2 mL以及DPPH溶液2 mL（0.08 mg/mL），置于预先编号的洁净三角瓶中（100 mL），混匀，待反应进行30 min后于波长517 nm处测定其吸光度，用VC标准品作为对照。按照公式（2）计算碎米荠粗多糖对DPPH自由基的清除率：
式中：A DPPH为DPPH溶液的吸光度；A 样品为加入样品溶液或加入VC后样品DPPH溶液的吸光度。
1.4 数据处理
在本实验数据检测中，每组数据均检测3 次取平均值，采用Origin 7.5软件以及Excel 2007进行处理。
2.1 单因素试验结果
2.1.1 酶种类和质量分数对碎米荠粗多糖提取率的影响
表2 酶种类和质量分数对碎米荠粗多糖提取率的影响
Table2 Effects of type and dosage of enzyme on the yield of polysaccharides from Cardamine hupingshanensis
注：纤∶果表示纤维素酶与果胶酶质量比。
?
如表2可知，不同种类和配比的酶对碎米荠粗多糖的提取率影响各不相同，但规律基本一致，且粗多糖的提取率都随酶质量分数的升高呈现先增大后稍微有减少的变化趋势。纤维素酶、果胶酶、纤维素-果胶复合酶（1∶1、1∶2、2∶1，质量比）均在质量分数为2%时，碎米荠粗多糖提取率达到最大。其中，由质量分数为2%的纤维素-果胶复合酶（2∶1）辅助提取时，碎米荠粗多糖的提取率最高达到3.95%。因此本研究拟定质量分数为2%的纤维素-果胶复合酶（2∶1）为最佳复合酶，并进行后续试验。
2.1.2 酶解时间对碎米荠粗多糖提取率的影响
图1 酶解时间对碎米荠粗多糖提取率的影响
Fig.1 Effect of hydrolysis time on the yield of polysaccharides from Cardamine hupingshanensis
由图1可知，在提取的前90 min内，随着酶解时间的延长，碎米荠粗多糖的提取率逐渐上升；但在90 min后提取率反而呈逐步下降趋势。这种变化趋势可能与酶发挥作用的最适反应时间以及酶的最适反应温度有关，因此发现酶促提取时间越长不一定越适合酶的活力发挥。据此，最佳的碎米荠酶解时间为90 min，此时粗多糖的提取率最高。
2.1.3 酶解温度对碎米荠粗多糖提取率的影响
图2 酶解温度对碎米荠粗多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on the yield of polysaccharides from Cardamine hupingshanensis
如图2所示，温度低于50 ℃时，随着温度的提升，酶的活性也随着升高，碎米荠粗多糖的提取率也随之提高；但温度超过50 ℃以后，粗多糖的提取率变化不大，温度超过60 ℃以后，提取率下降十分明显，这可能是当温度升高到一定程度时，酶蛋白开始受热变性，使得酶的活性降低，从而降低了粗多糖的提取率。据此拟确定碎米荠粗多糖提取的最佳酶解温度应约为60 ℃。
2.1.4 酶解pH值对碎米荠粗多糖提取率的影响
pH值过小（过酸）、过大（过碱）都能使酶蛋白变性而失活，pH值的改变能影响酶活性中心上必须基团的解离程度，同时也可以影响底物和辅酶的解离程度，从而影响酶分子对底物分子的结合和催化，只有在特定的pH值条件下，酶、底物和辅酶的解离状态，最适宜它们相互结合，并发生催化作用，从而使酶反应速度达到最大值。如图3所示，当提取液的pH值由2.0升至4.0时，碎米荠粗多糖的提取率随着pH值的升高而提高，在pH值大于4.0后碎米荠粗多糖的提取率随着pH值的升高而下降。结果表明复合酶在pH 4.0条件下活性较好，因此将酶解最佳pH值定为4.0，此时碎米荠粗多糖的提取率最高。
图3 酶解pH值对碎米荠粗多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of initial pH on the yield of polysaccharides from Cardamine hupingshanensis
2.2 响应面试验结果
2.2.1 碎米荠粗多糖提取率的二次多项回归方程
表3 复合酶提取碎米荠粗多糖的响应面试验设计及结果
Table3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis
?
通过单因素优化试验发现：在酶解过程中当纤维素酶与果胶酶的复配比例2∶1（质量分数2.0%）、酶解的时间控制在90 min、温度控制在60 ℃、pH值调至4.0时，能够得到碎米荠粗多糖的最大提取率。如表3所示，将酶解时间、酶解pH值和酶解温度作为研究的对象条件，以碎米荠粗多糖提取率为响应值，共得到17 个试验点，其中12 个为析因点，1 个为中心点，中心点试验进行了5 次，用来估计误差。利用Design-Expert 7.5软件对表3数据进行多元回归拟合，得到碎米荠粗多糖提取率对以上因素的二次多项回归模型为：Y=4.074+0.065A-0.414B+0.210AB-0.255AC-0.356BC-0.781A 2-0.563B 2-0.638C 2。
2.2.2 回归模型的方差分析
表4 二次多项式回归模型的方差分析
Table4 Analysis of variance the regression model
?
对复合酶法辅助提取碎米荠粗多糖的回归数学模型进行方差分析，以检验方程的有效性和各因子的偏回归系数，回归模型的方差分析如表4所示。通过统计学分析可以发现，该试验选用的模型极显著（P＜0.000 1），方差的失拟项不显著（P=0.136 5＞0.05），说明模型的选择是合适的；另外，所选模型的R 2为0.997，证明该模型能解释99.7%的结果值的变化规律，仅有总变异0.3%不能用该模型来解释，基本可用于复合酶辅助提取碎米荠粗多糖的分析与预测。同时，表4结果还显示，在此试验设计中，A项显著（P＜0.05），B、AB、AC、BC、A 2、B 2、C 2项均为极显著（P＜0.01），C项不显著。
2.2.3 响应面交互作用分析与最佳提取条件的确定
图4 各因素交互作用的响应面与等高线图
Fig.4 Response surface and contour plots showing the effect of various hydrolysis conditions on the yield of polysaccharides from Cardamine hupingshanensis
如图4所示，通过对以上3 个曲面的分析可以预测和检验变量的响应值以及确定变量之间的相互关系 [25]，响应面越陡，反映出各因素之间的两两交互作用越显著。同样，等高线的形状也可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反 [26]。通过响应面的陡峭程度分析发现，酶解时间对碎米荠粗多糖提取率的影响最大，其次是酶解温度和酶解pH值，这与方差分析结果一致。
通过Design-Expert 7.5软件分析，获得碎米荠粗多糖的最佳复合酶辅助提取条件：酶解时间91.8 min、酶解温度57.1 ℃、酶解pH 4.17。在此条件下，碎米荠粗多糖的提取率最高，粗多糖的提取率预测值为4.14%，在此条件下做验证实验（做3 个平行实验），得到实际粗多糖的平均提取率为4.07%；与理论预测值相比，其相对误差约为1.62%，说明模型可以较好地反映出碎米荠粗多糖提取的条件。
2.2.4 碎米荠粗多糖体外抗氧化活性分析
图5 碎米荠粗多糖对DPPH自由基的清除率
Fig.5 DPPH free radical-scavenging effect of Cardamine hupingshanensis polysaccharides
大多数从植物体内提取的多糖都具有抗氧化活性。在实验过程中，发现并验证了碎米荠粗多糖也具有一定的抗氧化活性，并对其抗氧化活性与VC的抗氧化活性进行比较。如图5所示，在设定的质量浓度范围内，随着碎米荠粗多糖质量浓度的升高，对DPPH自由基清除率也随之升高，在测定的质量浓度范围内，其DPPH自由基清除率均大于VC。
酶具有速度快、专一性强和反应条件温和的优点，在酶提取多糖的研究中所用的酶有果胶酶、淀粉酶、半纤维素酶和纤维素酶等 [21-22]。酶在提取植物多糖时能快速除去没有生物活性纤维素、分解细胞壁和淀粉杂质等，从而能大大提高提取率 [23-24]。本实验利用人工种植的碎米荠为原料，研究其粗多糖的复合酶法提取工艺参数及其抗氧化活性。抗氧化活性实验结果证明碎米荠粗多糖具有抗氧化活性，在一定的质量浓度范围内，其抗氧化活性强于VC，与其他植物多糖相比较，碎米荠粗多糖的抗氧化活性略强于阿克苏骏枣多糖 [25]，略差于松茸多糖 [26]，这可能与粗多糖的提取纯度有关，下一步实验将对碎米荠粗多糖进一步纯化，进行后续研究。实验结果为碎米荠多糖的提取以及多糖的性质研究与运用提供了一定的理论依据。
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Optimization of Multi-Enzymatic Extraction of Polysaccharides from Cardamine hupingshanensis and Their Antioxidant Activity
LUO Kai, HUANG Xiufang, ZHOU Yifeng, ZHANG Chi
*
(Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province, College of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)
Abstract：The extraction of crude polysaccharides from cultivated Cardamine hupingshanensis was optimized by the combined use of one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The results of one-factor-at-a-time experiments demonstrated hydrolysis with a mixture (2:1, m/m) of cellulase and pectinase at a dosage of 2% (m/m) at 60 ℃ and an initial pH of 4.0 for 90 min to be optimum for the extraction of polysaccharides. Furthermore, the extraction conditions optimized by response surface methodology were as follows: hydrolysis time, 91.8 min; hydrolysis temperature, 57.1 ℃; and intial pH, 4.17. Under these conditions, the predicted maximum yield of polysaccharides of 4.14% was obtained, and experiments gave an average value of 4.07%, indicating a relative error of about 1.62% the predicted and experimental values. The results of antioxidant assays showed that Cardamine hupingshanensis. polysaccharides possessed antioxidant activity better than that of VC. Our experimental results provide an experimental basis for studying the extraction and properties of Cardamine hupingshanensis polysaccharides.
Key words：Cardamine hupingshanensis; polysaccharide; extraction parameters; optimization
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201704038
中图分类号：TS255.36
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）04-0237-06
引文格式：
罗凯, 黄秀芳, 周毅峰, 等. 响应面试验优化复合酶法提取碎米荠多糖工艺及其抗氧化活性[J]. 食品科学, 2017, 38(4): 237-242. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704038. http://www.spkx.net.cn
LUO Kai, HUANG Xiufang, ZHOU Yifeng, et al. Optimization of multi-enzymatic extraction of polysaccharides from Cardamine hupingshanensis and their antioxidant activity[J]. Food Science, 2017, 38(4): 237-242. (in Chinese with English abstract)
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201704038. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-06-21
基金项目：湖北民族学院博士启动基金项目（MY2015B031）；国家自然科学基金地区科学基金项目（31360498）；湖北省教育厅重点项目（D20131902）；恩施州科技局技术支撑项目（D20160055）
作者简介：罗凯（1979—），男，副教授，博士，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：luokai_79@163.com
*通信作者：张弛（1965—），男，教授，硕士，研究方向为地方特色食品资源开发。E-mail：zhtzu@163.com