普鲁士蓝/石墨烯修饰电极检测酱油中的亚硝酸盐

摘要：利用电化学沉淀普鲁士蓝纳米粒子在石墨烯的表面，采用差分脉冲伏安法对该电极进行表征，并研究亚硝酸根离子在修饰电极上的电化学行为。结果表明：在0.10 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，亚硝酸根在1×10 -6～1×10 -2mol/L浓度范围内呈线性关系，信噪比为3时检出限为3×10 -8mol/L。所构建的普鲁士蓝/石墨烯修饰电极对亚硝酸根离子具有良好的电催化活性，表现出良好的稳定性、重复性和抗干扰能力，同时将所构建的复合材料修饰电极应用于酱油中亚硝酸盐的检测。

关键词：石墨烯；普鲁士蓝；亚硝酸根；差分脉冲伏安法；修饰电极

石墨烯是由一个原子厚度的碳原子根据sp 2键形成的，因此具有很多特殊性能，例如良好的导电性能、较高的比表面积、容易制备等。石墨烯的这些独特性能使其在原电池、超级电容器和电化学传感器等方面具有广阔的应用前景 [1-2]。近年来，为了扩展石墨烯的应用范围和提高石墨烯材料的性能，许多课题组开展了关于石墨烯复合材料的合成和应用工作，比如聚合物/石墨烯 [3-4]、金属氧化物/石墨烯 [5]、金属/石墨烯 [6-12]等，这些石墨烯的复合材料已经成功的被合成，并被应用于催化和生物传感器等领域。

亚硝酸盐外部感官和滋味都与食盐有相似之处，是从亚硝酸中转化而来，并在建筑业、工业中应用广泛，特别是在肉制品加工过程中也经常作为发色剂进行限量使用 [13]。但是亚硝酸盐有比较高的机率引起食物中毒，当人食用大量亚硝酸盐并引起蓄积时，人体组织就会发生缺氧，从而对人体造成严重危害 [14]。亚硝酸盐在人体中还极易转换成亚硝胺。许多动物实验表明，亚硝胺是一种强致癌物质，大量或长时间摄入能够诱发肿瘤，进而引起癌症的发生，对人体健康构成潜在威胁，所以，必须对食品中的亚硝酸盐进行检测和控制。亚硝酸盐的检测技术主要包括光谱法 [15]、色谱法 [16]和电学化学方法 [17]，在实际应用过程中，电化学方法以快速、简便、灵敏度高等优点具有更广泛的应用。

普鲁士蓝（Prussian blue，PB）又名铁蓝、柏林蓝等，是一种蓝色染料，具有立方结构。PB具有耐溶性好、热稳定好等特性，同时还具有良好的电化学可逆性和催化性能。PB是通过作为修饰电极的应用后开始得到了人们重视，利用PB合成的多种复合材料已应用于实际样品的分析检测 [18-22]。例如Li Sujuan等 [23]利用PB/石墨烯修饰电极检测过氧化氢，Wang Zonghua等 [24]利用PB/石墨烯修饰电极检测甲醇氧化。

本实验结合石墨烯的优异性能和PB的电催化性能，制备了PB/石墨烯复合材料，通过扫描电子显微镜和循环伏安法来表征PB成功修饰于石墨烯上，并将复合材料修饰玻碳电极应用于亚硝酸盐的检测，结果显示PB/石墨烯修饰电极相比PB修饰电极显示出更好的性能，同时将所构建的复合材料修饰电极应用于酱油中亚硝酸盐的检测。

1 材料与方法

氧化石墨烯，通过改进Hummers氧化法制备 [25]；亚硝酸钠标准溶液（0.1 mol/L）、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠配制成磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS），所用试剂均为国产分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

CHI620E电化学分析仪上海晨华仪器有限公司；KQ3200DE型数控超声波清洗器昆明市超声仪器有限公司；FK-A组织捣碎机常熟市金坛区环宇科学仪器厂；电化学实验用三电极体系，石墨烯修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极。

将玻碳电极用粒径为0.05 μm的氧化铝粉在麂皮上抛光，然后依次在无水乙醇和二次蒸馏水中超声清洗，室温条件下干燥。将1 mg干燥的氧化石墨烯分散在1 mL蒸馏水中，超声20 min得到1 mg/mL黄褐色氧化石墨分散液。用移液枪移取10 μL氧化石墨烯分散液，将其滴涂在预处理好的玻碳电极表面，并置于室温条件下干燥，得到氧化石墨烯修饰玻碳电极。将制得的氧化石墨烯修饰电极，在0.1 mol/L氯化钾溶液中，采用循环伏安法以100 mV/s的扫描速率在-1.5～0.5 V的电位范围内扫描20 圈，即可得还原态的石墨烯修饰玻碳电极。

将还原态的石墨烯修饰玻碳电极置于含有2 mmol/L铁氰化钾、2 mmol/L氯化铁和0.1 mol/L氯化钾的混合溶液，采用循环伏安法以50 mV/s的扫描速率在0～1.0 V电位范围内扫描60 圈，使PB沉积在电极表面，即得PB/石墨烯修饰玻碳电极。

按照GB/T 5009.39-2003《酱油的卫生检验方法》方法对原料进行预处理。称取酱油样品0.5 mL于100 mL锥形瓶中，加入浓硝酸5 mL，过氧化氢2 mL，加热消解至样品溶液呈透明后，继续加热驱赶剩余酸液至近干，冷却后转移至100 mL容量瓶，用二次蒸馏水定容待测。

2 结果与分析

图1 石墨烯（A）和PB/石墨烯复合材料（B）扫描电子显微镜表征
Fig.1 SEM characterization of graphene (A) and Prussian blue/graphene(B)

由图1A可以看出，石墨烯成薄片状，在片层结构上分布有大量褶皱，这归因于石墨烯层间的π-π堆积作用。这种结构使得二维的石墨烯聚集在一起趋向于三维结构而能稳定存在，由图1B可知，有很多的沉积粒子附着在了石墨烯电极表面，所以这也证实了PB成功修饰在石墨烯的表面。

图2 电化学沉积石墨烯的循环伏安图
Fig.2 Cyclic voltammograms of electrochemical deposition of graphene

由图2可知，在氧化石墨烯还原的第1圈在-0.8 V开始的位置还原峰电流急剧增加，这说明氧化石墨烯上的大量含氧基团被还原，随着扫描圈数的增加，还原峰电流很快减小直至消失，这说明氧化石墨烯的还原过程非常迅速并且是不可逆的。石墨烯修饰电极的制备为PB/石墨烯修饰电极的制备提供具有良好导电性和电极转移效果的基底电极。

图3 电化学沉积PB/石墨烯的循环伏安图
Fig.3 Cyclic voltammograms of electrochemical deposition of Prussian blue (PB)/ graphene

由图3可知，在0.2 V附近出现了一对氧化还原峰，这是PB和普鲁士白之间的相互转化，0.8 V附近的一对氧化还原峰对应于PB和柏林绿之间的相互转换，这2 处氧化还原峰的出现说明PB成功的修饰在石墨烯修饰电极上。

图4 不同扫描速率条件下的循环伏安图
Fig.4 Cyclic voltammograms at diff i erent scan rates

从图4可以看出，在0.237 V/0.149 V（对Ag/AgCl参比电极）出现PB的一对可逆的氧化还原峰，这是PB和普鲁士白的相互转换，氧化峰和还原峰电位差为88 mV，与理论值59 mV无显著性差异，这说明在PB/石墨烯修饰玻碳电极上发生了快速的电子转移，这可能是由石墨烯的良好导电性能引起的。由图4插图可以看出，还原峰电流跟扫描速率的平方根成正比的，这说明在此扫描速率范围内电极表面的反应动力学是扩散控制过程，实验结果与前人研究结果相一致 [26-28]。

如图5所示，当pH值在5.0～9.0范围内变化时，亚硝酸根氧化峰峰电位逐渐负移，峰电流先增大后减小，峰电流在pH值为7.0时最大，因此选择pH值为7.0的0.10 mol/L PBS溶液作为测定亚硝酸根的支持电解质溶液。

图5 pH值的优化
Fig.5 pH optimization for electrochemical detection of nitrite

图6 裸玻碳（A）、PB/玻碳电极（B）、石墨烯/玻碳电极（C）和L PBS的差分脉冲伏安法测定
Fig.6 Differential pulse voltammograms (DPV) of bare glassy carbon electrode (GCE) (A), PB/GCE(B), graphene/GCE (C) and PB/graphene/ GCE (D) in 0.1 mol/L PBS PB/石墨烯/玻碳电极（D）在0.1 mol/

如图6A～C可知，氧化石墨烯修饰到裸玻碳电极上以后，亚硝酸盐的氧化峰电流降低，这是由于氧化态的石墨烯导电性能不好，PB修饰到玻碳电极上以后也对亚硝酸盐具有很好的电催化活性。如图6C、D可知，石墨烯和PB/石墨烯修饰到电极上以后，氧化电位明显正移了（0.72 V），并且PB/石墨烯/玻碳电极比其他3 种电极对亚硝酸盐显示出了更高的氧化峰电流，这主要是因为氧化态石墨烯经过还原到还原态石墨烯以后和PB的协同作用的影响，使得复合电极具有更好的电催化活性。从图4看出，在40～200 mV/s范围内电极表面的反应动力学是扩散控制过程，根据文献[29]报道，这属于双质子参与的双电子转移过程，反应方程式如下：

图7 PB/石墨烯修饰电极对不同浓度的亚硝酸根的测定
Fig.7 Detection of different nitrite concentrations by the PB/graphene modified electrode

由图7可看出，当亚硝酸根离子浓度为0时，电流为0，响应电流随着亚硝酸根离子浓度的增加而逐渐增加。由图7插图可知，随着亚硝酸根浓度的增加，峰电流也逐渐增大，线性范围为1×10 -6～1×10 -2mol/L，检出限为3×10 -8mol/L，相关系数r为0.998 6。相较于石墨烯修饰电极检测亚硝酸盐有较宽的线性范围和较低的检出限 [30]。

在优化的实验条件下，使用该修饰电极对0.57 mmol/L亚硝酸根连续平行测定5 次，其测定结果的相对标准偏差为1.03%，表示复合电极重复性较好。将制备好的电极放在冰箱中7 d，在相同实验条件下测得的电流为原来的95.1%，说明制备的电极稳定性较好。对同样方法制备的5 根不同电极的重复性和稳定性进行研究，结果显示：电极的重复性实验中，测量结果的相对偏差均在5%以内；电极的稳定性实验中，7 d内电流的降低值均小于10%。

为了研究一些无机离子和有机物对亚硝酸盐测定的影响，选取浓度为N

浓度100 倍的Cl -、Na +、K +、S

、N

、H 2P

、HP

、P

无机离子和浓度为N

浓度10 倍的氢醌、葡萄糖和对乙酰氨基酚进行了干扰测试。实验结果表明当测定相对误差不大于5%时，常见的离子和有机物对检测不产生干扰。

取10 mL处理好的酱油样品溶液加入小烧杯中，并量取10 mL PBS与之混合均匀。向其中加入1×10 -3mol/L的亚硝酸根标准溶液进行加标实验，采用本法测定，平行测定5 次，同时采用GB 5009.33—2010《食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定》中盐酸奈乙二胺法测定酱油中亚硝酸盐的含量，如表1所示。所构建的PB/石墨烯修饰电极测定的结果与国标法测定的结果有很好的一致性，同时采用标准加入法进行加标回收实验来验证该法的可行性，平均回收率在95%～106%之间。

表1 酱油中亚硝酸根含量的测定结果
Table1 Analytical results for the determination of nitrite in commercial soy sauce samples

3 结论

本实验基于石墨烯复合材料的优异性能，利用电化学沉积技术在玻碳电极上沉积PB/石墨烯纳米复合薄膜并应用于检测食品中的亚硝酸盐。石墨烯较大的比表面积和PB良好的电催化作用结合起来，使得所制备的PB/石墨烯修饰电极对亚硝酸盐的检测具有高的电催化活性，并且具有较高灵敏度，较低的检出限和较宽的线性范围，同时该复合材料也成功地应用于各类市售酱油中亚硝酸盐的检测。在本实验中，PB/石墨烯修饰电极对亚硝酸盐的线性检测范围为1×10 -6～1×10 -2mol/L，检出限为3×10 -8mol/L。

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Detection of Nitrite in Soy Sauce Using a Prussian Blue/Graphene Modif i ed Electrode

GAO Hongli, TANG Zhe, CAO Li, LI Zhaozhou, LI Daomin, LI Songbiao, HOU Yuze
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

Abstract：In this work, we prepared graphene-based nanocomposite material by electrochemically depositing Prussian blue (PB) nanoparticles on the surface of graphene. Differential pulse voltammetry (DPV) was used to characterize the electrode and study the electrochemical behavior of nitrite ion on the modif i ed electrode, and the electrode was used to detect nitrite in soy sauce. The results showed that the Prussian blue/graphene modif i ed electrode had a good electrocatalytic activity to nitrite ion in 0.10 mol/L PBS buffer solution (pH 7.0). In the concentration range of 1 × 10 -6-1 × 10 -2mol/L, the method presented a linear relationship. The limit of detection (LOD) was 3 × 10 -8mol/L at a signal-to-noise ratio of 3. The Prussian blue/graphene modif i ed electrode showed a good stability, reproducibility and anti-interference ability.

Key words：graphene; Prussian blue; nitrite; differential pulse voltammetry; modif i ed electrode

高红丽, 唐喆, 曹力, 等. 普鲁士蓝/石墨烯修饰电极检测酱油中的亚硝酸盐[J]. 食品科学, 2017, 38(4): 255-259.

GAO Hongli, TANG Zhe, CAO Li, et al. Detection of nitrite in soy sauce using a Prussian blue/graphene modified electrode[J]. Food Science, 2017, 38(4): 255-259. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704041. http://www.spkx.net.cn

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（21605037）；河南科技大学青年基金项目（2015QN040）

作者简介：高红丽（1979—），女，讲师，博士，研究方向为纳米材料在食品分析中的应用。E-mail：ghl3488579@163.com

普鲁士蓝/石墨烯修饰电极检测酱油中的亚硝酸盐

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论