苯甲酸添加剂的拉曼高光谱分析

王晓彬 1,2,黄文倩 2,王庆艳 2,刘 宸 2,王超鹏 2,杨桂燕 2,赵春江 1,2,*

(1.沈阳农业大学信息与电气工程学院,辽宁 沈阳 110866;2.北京农业智能装备技术研究中心,国家农业智能装备工程技术研究中心,农业部农业信息技术重点实验室,农业智能装备技术北京市重点实验室,北京 100097)

摘 要:对拉曼高光谱成像光谱仪采集苯甲酸添加剂得到的拉曼光谱信号和高光谱图像进行分析。采用小波去噪方法对原始拉曼光谱信号进行预处理,利用正交试验方法确定小波去噪参数的最优组合为小波基函数sym2、分解层数2、重调方式sln、阈值方案Rigrsure,此时信噪比为32.092。对去噪后的拉曼光谱进行谱峰归属和分析,得到了苯甲酸分子在不同波数范围内的特征振动模式,其中在1 636、1 603、1 000、793、615 cm -1和420 cm -1处的拉曼信号较强,可作为苯甲酸的拉曼特征频率。分析不同特征频率条件下的灰度图像,发现图像的亮度与特征频率的峰强相关且变化顺序具有一致性。研究结果为苯甲酸添加剂的检测分析提供研究基础。

关键词:苯甲酸;小波去噪;谱峰归属;图像分析

苯甲酸(benzoic acid,BA),是一种弱酸,主要用于增塑剂、定香剂、抗微生物剂、食品防腐剂等的制作,也用于聚酰胺树脂和醇酸树脂的改性剂及钢铁设备的防锈剂。BA作为常用的酸性食品防腐剂,对霉菌、酵母和细菌有较好的抑制作用。但食用过多含BA添加剂的食品,会造成血液酸碱度失调、肠胃功能紊乱,特别是对一些特殊人群,可能会带来荨麻疹、代谢性酸中毒、哮喘等不良反应 [1]。目前,对BA的检测方法主要有:高效液相色谱法 [2-3]、高效液相色谱-质谱联用法 [4]、气相色谱法 [5]、气相色谱-质谱联用法 [6]等,但这些方法存在样品检测成本高、前处理程序繁琐、检测速度慢等缺陷。

拉曼光谱是一种光的非弹性散射光谱,不同的散射频率反映了分子中不同基团的振动和转动信息,为研究分子结构提供了一种重要的方法 [7]。Peica等 [8]在pH 3~8的范围内分析了食用染料E102的表面增强拉曼光谱,得到了不同基团的振动频率,并对其进行了谱峰归属和分析。Xie Yunfei等 [9]对偶氮甲酰胺添加剂的红外光谱、拉曼光谱和表面增强拉曼光谱进行了研究,在密度泛函理论计算的基础上对不同的振动频率进行了归属,结果显示计算出的拉曼光谱与实验拉曼光谱吻合得很好。高光谱图像技术是一种“图谱合一”技术,通过光谱仪采集待测物的高光谱图像,该图像同时包含了待测物外部的图像信息和待测物内部的光谱信息 [10-12]。拉曼高光谱成像技术是拉曼光谱技术和高光谱成像技术高精度融合的技术,兼有2 种技术的优势,在获得待测物拉曼光谱的同时对其可视化,该技术在食品的添加剂和掺杂物检测方面得到了较好的应用。Dhakal等 [13]利用点扫描拉曼光谱成像系统对奶粉中不同浓度的三聚氰胺进行检测,最低检测量为0.005%;检测到的三聚氰胺浓度和混合物实际浓度之间具有较好的线性关系,相关系数为0.99。Qin Jianwei等 [14]采用拉曼成像光谱系统对脱脂奶粉中的多种掺杂物(硫酸铵、双氰胺、三聚氰胺和尿素)进行检测,基于掺杂物拉曼峰的单波段无荧光图像开发了一种图像分类方法,找到了掺杂物像素数目与掺杂物浓度之间的线性关系。

本研究利用拉曼高光谱成像光谱仪采集了BA添加剂的拉曼光谱和高光谱图像。采用正交试验方法得到最优的小波参数去除原始拉曼信号中的高频噪声;依据不同官能团的振动模式对去噪后的拉曼光谱分为3 个波段进行谱峰的归属和分析,寻找BA的拉曼特征频率;对特征频率条件下的灰度图像进行分析,探索图像亮度与频率强度之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

BA(分析纯) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

I0785MM8000MF-1X20B-SCAN型激光器(功率10 W) 美国Innovative Photonic Solutions公司;LPD01-785RU-25型分光片 美国Semrock公司;InSpector R10E光谱仪 芬兰Specim公司;iKon-MDU934P-BEX2-DD型电荷耦合元件(charge-coupled device,CCD)相机 英国Andor公司;培养皿(直径38 mm,深度5 mm) 科晶生物科技有限公司;研钵(外径8.2 cm,内径6.8 cm) 上海康朗生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 拉曼高光谱成像系统

图1 拉曼高光谱成像系统
Fig.1 Raman hyperspectral imaging system

如图1所示,系统采用波长785 nm线激光器作为激发光源,激光线投射到45°角放置的波长785 nm分光片上,分光片使得反射激光线垂直入射到样品表面。光谱仪安装在16 位的CCD相机上,CCD具有1 024×1 024像素的区域阵列,波长800 nm时量子效率大于90%,波长1 000 nm时量子效率大约为45%,在图像采集过程中,CCD热电冷却到-65 ℃以尽量减少暗电流。样品经激光线照射后发生散射,透过分光片散射信号通过由拉曼成像光谱仪和CCD相机组成的检测模块采集。相机通过USB电缆连接至电脑,实现相机的控制和数据的传输。样品放置于单轴机动定位平台,该平台通过计算机控制步进电机发生移动,工作距离为20 cm,系统采用推扫方式获取高光谱数据。整个系统除计算机外放置在一个黑色的箱子中,以避免环境光的影响。使用五铃光学开发的Spectral Image-VNIR-R软件实现相机和步进电机的控制以及数据的采集。

1.3.2 数据采集

将BA标准品置于研钵中,研磨为粉末后移入培养皿中。调整焦距确定镜头到样品表面的距离为20 cm。将样品放置在线激光的中心位置,平台以0.074 3 mm/s的速率移动,拉曼光谱采集范围为785~1 000 nm(对应拉曼位移0~2 728 cm -1),分辨率为0.278 nm,积分时间为1 000 ms。

1.3.3 光谱处理和图像分析

由于受激光光源强度变化、CCD热稳定噪声以及外界杂散光等不确定因素的影响,采集到的拉曼信号中含有大量的高频噪声,对拉曼峰的位置和强度产生影响。为去除高频噪声影响,提高拉曼信号的质量,需对采集到的原始拉曼信号进行预处理 [15]。小波分析具有基函数选择灵活、去相关性和良好的时频局部性等优点,在拉曼信号去噪方面具有较好的应用,其去噪过程为:首先选择合适的小波基函数对拉曼信号进行不同层数分解,其次通过阈值量化分离出每一层的高频信号,最后对处理后的光谱信号进行重构以去除噪声 [16]。本研究采用小波去噪方法对BA的拉曼光谱信号进行预处理,从而获得高质量的拉曼信号。

用小波分析对光谱信号进行去噪时,需要选择的参数有:小波基函数、分解层数、重调方式和阈值方案。小波分析具有不同的小波族,每种小波族包含多种小波基函数,本实验参照文献[17-19],选用haar、db2、sym2和coif1 4 种常用的小波基函数。分解层数对去噪效果的影响较大,分解层数过多(大于5)时,低频信号的信息丢失严重,造成信噪比下降;分解层数为1时,信号中依然存在大量高频噪声,去噪效果不理想,因此分解层数选择为2、3、4、5 层。小波分析有2 种重调方式:sln和mln,前者是依据第1层的系数来调整阈值,后者是依据每一层的噪声估计来调整阈值。常用的阈值方案有4 种,分别为Rigrsure、Heursure、Sqtwolog和Minimaxi。合理的参数选择不仅可以完整的保存低频信号而且可以最大限度的去除高频噪声。以上述4 项参数为正交试验的因素,不同参数条件下的数值为正交试验的水平,建立L 16(2 1×4 3)的混合正交试验用于选择最优的小波去噪参数,试验结果以信噪比(signal to noise ratio,R SN)为评价指标,按下式计算。

式中:f(i)为原始信号; (i)为去噪重构后的信号;n为信号长度。

R SN越高,光谱的去噪效果越好。正交试验因素水平设计如表1所示。

表1 小波去噪混合正交试验的因素和水平
Table1 Factors and levels used in orthogonal arry design for the optimization of wavelet de-noising

?

采用小波分析对拉曼光谱进行预处理,找到BA的拉曼特征频率。通过对比不同拉曼特征频率条件下的灰度图像,获取BA的图像特征。数据处理和分析过程基于Matlab 7.11软件平台完成。

2 结果与分析

2.1 BA的拉曼高光谱

图2 BA分子结构图(A)和高光谱示意图(B)
Fig.2 Molecular structure diagram and hyperspectral image of BA

BA的分子式为C 7H 6O 2,其分子结构如图2A所示。BA分子结构主要由苯基和羧基组成,其中含有C—C、C=C、C—O、C=O、C—H等官能团。不同官能团包含不同的振动模式,依据不同官能团的不同振动模式产生的振动频率,对BA的拉曼光谱进行归属和分析,找出BA的拉曼特征频率 [20]

如图2B所示,背景和培养皿不会对BA的拉曼信号产生干扰,但BA拉曼光谱信号中存在大量噪声,因此须对BA原始拉曼光谱信号进行预处理,以最大限度地去除噪声影响,从而更清晰地对BA的拉曼光谱进行归属和分析。

2.2 小波去噪参数的选择

由表2可看出,因素D(阈值方案)对结果影响最大,在该因素条件下极差为3.861;其次为因素B(分解层数),各水平间R SN的极差为2.087;再者为因素A(小波基函数),极差为0.825;对结果影响最小的为因素C(重调方式),极差仅为0.215。各因素间综合比较,得到对BA原始拉曼光谱去噪的最佳参数组合为A 3B 1C 1D 1,即小波基函数sym2、分解层数2、重调方式sln、阈值方案Rigrsure,此时获得最佳的去噪效果,R SN为32.092。采用上述参数对BA原始拉曼信号去噪后的光谱信号,如图3所示,与原始拉曼光谱信号相比,信号中的高频噪声明显减少,拉曼信号更加明显,有利于谱峰的归属和分析。

表2 小波去噪混合正交试验结果
Table2 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of wavelet de-noising

?

图3 小波去噪后的BA拉曼光谱
Fig.3 Raman spectrum of BA after wavelet de-noising

为了更清楚地表征BA分子的拉曼光谱特征,根据苯基和羧基的不同振动模式,对照其他具有相同基团或官能团的物质的振动光谱,将去噪后的BA拉曼光谱分为1 700~1 200、1 200~700 cm -1和700~200 cm -13 个波数段进行谱峰归属和分析。

2.3 1 700~1 200 cm -1波数段的BA拉曼光谱

图4 1 700~1 200 cm -1范围内BA拉曼光谱
Fig.4 Raman spectrum of BA in the range of 1 700–1 200 cm -1

如图4所示,BA在此波数范围内的拉曼峰数目较少,其中1 636 cm -1和1 603cm -1处拉曼强度较高,其他谱峰的强度较弱,分别位于1 514、1 444、1 320 cm -1和1 285 cm -1。在BA的拉曼谱峰中,该波数范围内的拉曼谱峰主要由苯环和羧酸的伸缩振动引起 [21-23]

苯的简并环伸缩振动在1 596 cm -1附近产生2 个拉曼频率,其不受取代基的影响,该振动的出现可表明芳香环的存在。在BA的拉曼光谱中,该振动分别位于1 603 cm -1和1 636 cm -1处。

在苯衍生物的光谱中,1 630~1 450 cm -1范围内出现碳碳伸缩振动谱带,各谱带的强度与取代基的位置及其推电子或接受电子的性质有关。从图4可看出,这些振动分别位于1 514 cm -1和1 444 cm -1处。

羧酸会发生强烈地缔合,以二聚体形式呈现。在羧酸的二聚体光谱中,有一处耦合振动:O—H键的变形振动(1 440~1 395 cm -1)和C—O键的伸缩振动(1 300~1 250 cm -1),该振动可在1 320 cm -1和1 285 cm -1处找到。

2.4 1 200~700 cm -1波数段的BA拉曼光谱

图5 1 200~700 cm -1范围内BA拉曼光谱
Fig.5 Raman spectra of BA in the range of 1 200–700 cm -1

如图5所示,在这个波数范围内,BA拉曼光谱谱峰强度较高,主要由C—H键的面内面外弯曲振动、苯环的呼吸振动和C—C键的伸缩振动引起 [22-24]

苯环中C—H面内变形振动在1 200~960 cm -1范围内具有一系列的谱带,这些谱带通常靠近1 160、1 100、1 070 cm -1和1 030 cm -1。对BA来说,在1 179 cm -1和1 128 cm -1处可观察到该振动谱带。

对于单取代苯,最有价值的是1 030 cm -1附近的谱带和伴随出现在1 000 cm -1附近很强的环呼吸振动谱带。在BA中,这两处拉曼峰分别位于1 025 cm -1和1 000 cm -1处。

苯环的C—H面外弯曲振动谱带位置取决于邻近的与苯环相连接的氢原子的数目,氢原子数为1时,位于900~860 cm -1。对BA而言,该振动可在868 cm -1处找到。

C—C键在拉曼光谱中产生强谱带,793 cm -1归属于苯基和羧基相连接的C—C键的伸缩振动,Balachandran等 [24]在对m-三氟甲基BA的振动光谱(拉曼和红外光谱)研究中也发现该处为C—C键的伸缩振动,与本实验吻合。

2.5 700~200 cm -1波数段的BA拉曼光谱

图6 700~200 cm -1范围内BA拉曼光谱
Fig.6 Raman spectra of BA in the range of 700–200 cm -1

如图6所示,在此波数范围内拉曼谱峰数目较少且强度相对较弱:615 cm -1和420 cm -1处拉曼峰明显,其他谱峰分别位于657、496 cm -1和340 cm -1处。主要由苯环变形振动和整个骨架的振动引起 [22-23,25]

苯环变形振动谱带的频率随取代基类型的不同而发生变化,通常出现在650~620、580~430 cm -1范围及450 cm -1附近。在BA中,该振动分别位于657、615 cm -1和496 cm -1处。

较低频率谱带一般由整个骨架的振动引起。420 cm -1归属于整个骨架的面外弯曲变形;340 cm -1归属于整个骨架的伸缩振动。

2.6 BA的拉曼特征频率

通过对去噪后BA拉曼光谱的谱峰归属和分析,得到了BA分子不同波段的特征振动模式。在1 636、1 603、1 000、793、615 cm -1和420 cm -1处有6 个强度较高的谱峰,这些谱峰代表了苯基和羧基的振动频率,因此,这6 个谱峰可作为BA的拉曼特征峰。依据BA的拉曼特征峰频率,选取高光谱图像中特征频率对应的灰度图像,对BA的形态进行表征。

2.7 BA拉曼特征频率的图像分析

图7 掩膜处理后BA拉曼特征频率的灰度图像
Fig.7 Gray images obtained from Raman characteristic frequencies of BA after mask processing

图8 BA拉曼特征频率的灰度直方图
Fig.8 Gray histograms obtained from Raman characteristic frequencies of BA

对BA拉曼特征频率的灰度图像进行掩膜处理以屏蔽背景区,如图7所示,在6 个拉曼特征频率条件下,待测物BA均可辨识,但不同频率条件下灰度图像的亮度不同。为更清楚地表示出不同特征频率灰度图像亮度的高低,计算目标区BA的灰度值,如图8所示,直方图倾向于灰度级高(255)的一侧,图像越明亮;直方图倾向于灰度级低(0)的一侧,图像越灰暗。对比不同图像的灰度直方图可看出,1 000 cm -1对应的灰度值主要集中在130~170处,灰度图像最明亮;793 cm -1对应的灰度值主要集中在90~130处,亮度次之;1 603 cm -1对应的灰度值主要集中在90~110处,亮度再次之;1 636 cm -1和615 cm -1对应的灰度值均主要集中于50~85处,但倾向于灰度级高的一侧,1 636 cm -1对应的像素点数大于615 cm -1处,因此1 636 cm -1较为明亮;420 cm -1灰度值主要集中在50~75处,图像最为灰暗。结合图3可看出,灰度图像亮度的高低与该频率条件下的拉曼峰强有关:峰强越强,亮度越高;峰强越弱,亮度越低。BA拉曼特征频率的峰强由强到弱分别为1 000、793、1 603、1 636、615、420 cm -1,灰度图像亮度的变化顺序与其相一致。

3 结论

本实验采用拉曼高光谱成像光谱仪采集BA添加剂的拉曼光谱和高光谱图像。对采集到的拉曼光谱信号进行小波去噪预处理,正交试验设计找出去除高频噪声的最佳参数组合,结果显示小波分析方法具有较好的去噪效果。将去噪后的BA拉曼光谱分为3 个波数段进行谱峰归属和分析,得到不同波段条件下基团的振动模式,其中6处强度较高的拉曼信号,可作为BA的拉曼特征频率。对高光谱图像中拉曼特征频率对应的灰度图像进行分析,计算对应的灰度直方图,结合BA的拉曼光谱,发现灰度图像亮度变化顺序与特征频率峰强的强弱变化顺序相一致。研究结果为BA添加剂的拉曼光谱分析提供判别依据,将促进食品中BA添加剂的快速检测研究。

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Analysis of Benzoic Acid by Raman Hyperspectral Imaging

WANG Xiaobin 1,2, HUANG Wenqian 2, WANG Qingyan 2, LIU Chen 2, WANG Chaopeng 2, YANG Guiyan 2, ZHAO Chunjiang 1,2,*
(1. College of Information and Electrical Engineering, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. Key Laboratory of Agri-informatics, Ministry of Agriculture, Beijing Key Laboratory of Intelligent Equipment Technology for Agriculture, National Research Center of Intelligent Equipment for Agriculture, Beijing Research Center of Intelligent Equipment for Agriculture, Beijing 100097, China)

Abstract:Raman spectral signals and hyperspectral images of benzoic acid were collected by a Raman hyperspectral imaging spectrometer, and the information was analyzed. The original Raman signal of benzoic acid was preprocessed by a wavelet de-noising method. Optimal parameters for wavelet de-noising that provided the best signal-to-noise ratio (32.092) was determined using an orthogonal array design were established as follows: sym2 wavelet function was used, decomposition level was 2, reset mode was ‘sln’, and threshold option scheme was ‘Rigrsure’. The de-noised Raman spectra were assigned and analyzed. The characteristic vibration modes of benzoic acid in different wavenumber ranges were obtained. The strong spectral peaks at 1 636, 1 603, 1 000, 793, 615 and 420 cm -1could be used as the Raman characteristic frequency of benzoic acid. The Raman characteristic frequencies corresponding to the gray level image obtained from the hyperspectral image were analyzed. The brightness of the image was correlated with the peak intensity of the characteristic frequency, and both changed in the same order. These research results provide a basis for the detection and analysis of benzoic acid.

Key words:benzoic acid; wavelet de-noising; spectral peak assignment; image analysis

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704047

中图分类号:O657.31;TS211.7

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)04-0290-06

引文格式:

王晓彬, 黄文倩, 王庆艳, 等. 苯甲酸添加剂的拉曼高光谱分析[J]. 食品科学, 2017, 38(4): 290-295. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201704047. http://www.spkx.net.cn

WANG Xiaobin, HUANG Wenqian, WANG Qingyan, et al. Analysis of benzoic acid by Raman hyperspectral imaging[J]. Food Science, 2017, 38(4): 290-295. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704047. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-07-11

基金项目:北京市优秀人才项目(2015000021223ZK40);北京市农林科学院青年科研基金项目(QNJJ201423)

作者简介:王晓彬(1989—),男,博士,研究方向为智能检测技术。E-mail:tawangxiaobin@126.com

*通信作者:赵春江(1964—),男,研究员,博士,研究方向为农业信息化技术。E-mail:zhaocj@nercita.org.cn