纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌融合子的多重PCR鉴定

张 琳 1,庞丰平 1,霍乃蕊 2,*

(1.山西农业大学食品科学与工程学院,山西 太谷 030801;2.山西农业大学动物科技学院,山西 太谷 030801)

摘 要:为建立纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌融合子快速鉴定的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,根据芽孢杆菌的芽孢形成早期因子基因spo0A和13 株乳酸菌β-半乳糖苷酶基因的保守序列分别设计引物对P1/P2和P3/P4,以亲本菌株DNA为模板,优化每对引物在适宜退火温度条件下的PCR体系,在最优体系下的特异性分析结果表明P1/P2能特异性扩增出spo0A基因片段(308 bp),而7 株乳酸菌全部呈阴性;P3/P4可扩增出所有受试乳酸菌和经表型鉴定确定的阳性融合子中的目标基因片段(576 bp),而对芽孢杆菌无扩增。多重PCR结果表明在P1/P2的最优体系中只有308 bp片段的扩增,而在P3/P4的最优体系中可实现2 个片段的共扩增,对融合后获得的50 个菌株的鉴定结果与单重PCR和表型鉴定结果100%吻合。该体系中模板DNA 1 ng/μL,每条引物0.4 μmol/L,脱氧核糖核苷三磷酸0.25 mmol/L,Taq酶0.06 U/μL;PCR时94 ℃预变性5 min;每个循环(共30 个)94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s,产物末端 72 ℃延伸7 min。该方法简便、快速、特异性好,适用于芽孢杆菌、乳酸菌以及二者融合子的快速鉴定。

关键词:芽孢形成早期因子基因;β-半乳糖苷酶基因;融合子;多重PCR

纳豆芽孢杆菌发酵过程中,伴随着大分子物质的降解,还会产生许多维生素和生理活性物质 [1],因此由纳豆菌发酵而成的纳豆具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降血压、提高蛋白质消化率、预防骨质疏松等多种作用 [2]。纳豆菌为枯草芽孢杆菌的一个亚种 [3],其芽孢形式抗逆性强,具有耐热、耐酸碱、耐干燥、抗紫外线和抗有机溶剂等特性 [4],并且产生的纳豆激酶可改善血液流通循环,减少血栓形成,安全有效 [5],可用于开发相关抗血栓药物 [6-7]。嗜酸乳杆菌是人体肠道的益生菌,具有酸和胆汁耐性、黏附人体上皮细胞、定殖肠道产生细菌素 [8]、抗癌 [9]、刺激免疫应答等特点。实验室前期研究结果表明,嗜酸乳杆菌虽然比其他乳酸菌具有更强的耐酸耐胆盐能力,但其通过胃液时大部分菌体仍然会失活,所以产芽孢乳酸菌育种一直为研究热点。现如今微生物育种技术已从常规的突变筛选发展到基因诱变、基因重组和基因工程,与转基因技术相比,细胞融合技术更安全、更高效,且已广泛应用于很多领域 [10-11]。因此,以纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌为亲本进行细胞融合,获得具有双亲优良性状的融合菌株,其益生功能将进一步增强,且过胃能力进一步加强,如应用于纳豆发酵,可改善其风味,为开发符合中国人群消费的纳豆提供依据。

细胞融合过程中,染色体经交换、重组而达到杂交目的 [12],亲本内和亲本间的融合均可发生,因而杂合融合子的快速筛选和鉴定是细胞融合的关键技术之一,目前,尚缺乏系统的鉴定标准 [13]。已报道的融合子筛选方法有营养缺陷型互补选择、灭活原生质体标记选择、荧光染色法筛选 [14]、免疫学方法筛选 [15]等。上述方法主要从培养特性、个体形态、生化特性、同工酶、G+C含量等指标入手,依赖对多种测定结果的综合评判得出结论 [13]。可见传统鉴定方法复杂、成本高、工作量大、耗时长,因而融合子快速鉴定十分必要。多重PCR技术在同一反应体系中加入多对引物,同时扩增多条目的DNA [16],已应用到了生命科学的各个领域 [17]。设计特异性引物,利用多重PCR技术对纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的融合子进行鉴定,将是一种简单、快速的鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纳豆芽孢杆菌购于日本高桥保藏研究所;嗜酸乳杆菌(CMCC6075)购于中国菌种保藏中心;其他菌株为山西农业大学微生物实验室保存。

细菌基因组DNA小量提取试剂盒 北京庄盟国际生物基因科技有限公司;Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、BL2000 DNA Marker 北京博雅宏兴科技有限公司;邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG) 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

电泳仪 北京君煮东方电泳设备有限公司;凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司;NanoDrop 2000C核酸仪 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞融合

用已建立的融合方法 [18]将纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌进行融合,高渗培养基涂布再生后,随机挑取50 个彼此分离的菌落,平板划线进一步进行纯化,获得菌落纯菌株,用于鉴定和保藏。

1.3.2 模板制备和引物设计

使用细菌DNA提取试剂盒提取亲本菌株和融合菌株DNA,用核酸仪测定DNA质量浓度,调整终质量浓度为5 ng/μL,-20 ℃保存。

表1 用于序列比对分析的13 株乳杆菌β-半乳糖苷酶基因列表
Table1 β-Galactosidase genes of 13Lactobacillus for sequence alignment

基因名称NCBI基因编号菌种名称bgl1061722植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum WCFS1)lacA3252620嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus NCFM)lacM3251495嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus NCFM)lacZ3251504嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus NCFM)lacZ1115654乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis Il1403)lacZ3977972唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius UCC118)LAF_RS045956233288发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum IFO 3956)LCRIS_RS070709107336弯曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus ST1)LDB_RS051454085367德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842=JCM 1002)LHE_RS1998016795584瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus CNRZ32)LJ_RS029902743617约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii NCC 533)LREU_RS057005188229罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri DSM 20016)LSEI_11044421647干酪乳杆菌(Lactobacillus casei ATCC 334)

根据NCBI数据库中提供的枯草芽孢杆菌芽孢形成早期因子(stage 0 sporulation protein A,spo0A)基因序列(ID:938655,全长804 bp),用软件Primer Premier 5设计芽孢杆菌特异性引物。在NCBI数据库中查找β-半乳糖苷酶基因的序列(表1),用软件MEGA 6比对分析寻找保守序列,设计乳酸菌特异性引物 [19]并由生工生物工程有限公司合成。

1.3.3 温度梯度PCR退火温度的确定

以亲本菌株DNA为模板,设置8 个退火温度进行梯度PCR扩增:模板DNA(5 ng/μL)5 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)(2.5 mmol/L)2.5 μL、Taq酶(5 U/μL)0.3 μL,双蒸水补至25 μL。PCR扩增条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,温度梯度退火30 s,72 ℃延伸60 s,30 个循环;产物末端72 ℃延伸7 min,本研究所有PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳(100 V,40 min),并使用凝胶成像系统观察拍照 [20]

1.3.4 单重PCR体系优化

以1.3.3节所筛选的退火温度及PCR条件,设计试验对2 对引物的PCR体系进行优化 [21],各因素与水平设计如表2所示。

表2 PCR体系设计的因素与水平
Table2 Factors and levels used in the experimental design for optimization of PCR system

?

1.3.5 引物特异性分析

用建立的单重PCR方法对实验室现有的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及清酒乳杆菌、弯曲乳杆菌等7 株乳酸菌进行PCR,验证引物对P1/P2的特异性;选取经表型鉴定已获得的5 株融合子、清酒乳杆菌、植物乳杆菌、肉葡萄球菌DNA进行PCR,分析P3/P4的特异性 [22]

1.3.6 融合子的单重PCR鉴定

用建立的针对两亲本菌株及其引物对的单重PCR体系分别对融合后随机挑取的50 个菌株进行扩增,两个目的基因片段都被扩增者为阳性融合子。

1.3.7 融合子多重PCR鉴定

在建立的两个单重PCR体系中同时加入P1/P2和P3/P4 2 对引物,进行PCR扩增,若2 个目的条带同时出现,则为阳性融合子,相应体系也被确定为融合子鉴定的多重PCR体系。

1.3.8 融合子的表型筛选

对上述50 个菌株进行表型筛选,判断双重PCR对融合子进行快速鉴定的准确性。对菌落菌体进行革兰氏染色,观察芽孢。β-半乳糖苷酶显色反应 [23]时取1 mL培养液于1.5 mL EP管中,12 000 r/min离心2 min,弃上清液,生理盐水重悬菌体,加1 滴甲苯充分摇匀使酶释放,37 ℃水浴5 min,加入0.25 mL ONPG溶液,37 ℃水浴20~30 min,观察结果。

2 结果与分析

2.1 引物设计与分析

针对spo0A基因设计的引物为P1和P2。对表1中的13株乳酸菌的β-半乳糖苷酶基因序列比对,获得如下保守序列:

1 TGGCTTACAC AAATAATTTA CAAATCATCT ATGGTGATGC CACTTTAGGA ATCACTGGTA

61 AAAACTTCCA TTATCTTTTC AGCTACGAAC GAGGTGGGTT AGAATCACTC AACATCAATA

121 ACAAAGAATG GTTATATCGT GTGCCGACCC CTACTTTCTG GCGAGCTACT ACCGATAATG

181 ATCGAGGTAA TGGCTTTAAT TTAAAGGCAT CTCAATGGCT CGGTGCTGAT ATGTTTACTA

241 AATGCACTAA AATCGAATTA AAGGTAGATG ACCGACAATT CGACGAACTT CCAATTGCTC

301 CAATTAATAA TCAATTCAGT AATCATGAAT ATGCTGACCA TGTTCAAATT GCGTTTTGGT

361 ATCAAACTCT AACTAATCCA GCAACTGACG TTAAAATCAT TTATAATATT GATAATACTG

421 GTTGTATTAA TATAGTCATG CATTATTTTG GTAAAAAAGG ATTGCCACCA TTACCAGTGA

481 TTGGAATGCG TTTCATCATG CCAACTGCTG CAACTGGCTT TGACTACGAA GGACTTTCGG

541 GGGAAACTTA TCCTGACCGA ATGGCTGGTG CAAAAGAAGG AAAATTCCAT GTTGATGGCT

601 TACCAGTAAC TAAATATTTA GTACCACAAG AAAACGGGAT GCATATGCAA ACTAAGGCAC

661 TCAAAATCAC TCGTTCTTCT ACTTTAAATA ATGCTGATCA AGAAAGTGAA TTTAGTCTAA

721 AGCTTAAGCA AGATAAACAA CCGTTTAATT TTAGTTGTTT ACCCTACACT GCTGAAGAAT

781 TAGAAAATGC TACTCATCTC GAGGAATTAC CACTTGCTCG CAGAACTGTG TTAGTTATTG

841 CTGGAGCTGT GCGCGGCGTT GGTGGTATCG ACAGCTGGGG TGCTGATGTT GAAAAGCAAT

901 ATCACATTAA TCCTGAAAAA GACTACGAAT TTT

该序列长度为933 bp,据此设计引物P3和P4(下划线部分),各引物的序列、DNA熔解温度(T m值)及目的片段长度见表3。

表3 引物序列与产物长度
Table3 Primer sequences,T mand the lengths of the corresponding PCR products

目标基因引物引物序列(5′→3′)T m/℃产物长度/bp spo0AP1CATCATCGCAAAGCAGTA52.7308 P2AAACAACGAGGAAATGGA50.5 β-半乳糖苷酶保守序列P3ACGAGGTGGGTTAGAATC55.0576 P4TTGAGTGCCTTAGTTTGC52.7

图1 引物对P1/P4(b)在不同退火温度条件下的PCR产物
Fig.1 Amplification by P1/P2 (a) and P3/P4 (b) at different annealing temperatures /P2(a)和P3

2.2 退火温度的确定温度梯度PCR结果如图1所示,靶片段都得到了特异性扩增。由于51.4 ℃接近P1/P2的T m(52.7/50.5 ℃),53 ℃接近P3/P4的T m值(55/52.7 ℃),且这两个温度也很接近,方便进行多重PCR,因此分别选择51.4 ℃和53 ℃作为退火温度对反应体系进行优化。

2.3 单重PCR体系优化

表 4β-半乳糖苷酶基因片段和芽孢基因片段的PCR体系设计
Table4 Experimental design and results for PCR of β-galactosidase and sporulation genes

?

设计17 个反应体系 [21],以PCR产物质量浓度为指标,考察模板DNA用量(A)、引物用量(B)、dNTP用量(C)、Taq酶用量(D)对扩增产物质量浓度的影响,筛选每对引物的最优反应体系。

图2 17 个体系P1/P2(a)和P3/P4(b)的PCR结果
Fig.2 PCR results of P1/P2 (a) and P3/P4 (b) in 17 systems

由表4和图2可知,组合16为P1/P2扩增纳豆芽孢杆菌spo0A基因片段的最优扩增体系。组合8为P3/P4扩增嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因片段的最优扩增体系,这2 个组合扩增产物质量浓度最大,条带最亮。经换算组合16的PCR体系为:模板DNA 1 ng/μL、引物0.3 μmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、Taq酶0.08 U/μL;组合8的PCR体系为:模板DNA 1 ng/μL、引物0.4 μmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、Taq酶0.06 U/μL。

2.4 引物特异性检验结果

图3 引物P1/P2对spo0A特异性扩增电泳图
Fig.3 Electrophoretogram of specific amplif i cation products with primer P1/P2

如图3所示,3 株芽孢杆菌即纳豆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌均出现了目标条带;而所有7株乳酸菌扩增结果呈阴性,说明引物P1、P2具有特异性。

图4 引物P3/P4特异性扩增电泳图
Fig.4 Electrophoretogram of specific amplifi cation products with primer P3/P4

同理对通过表型鉴定筛选出的5 株融合子、DNA进行扩增,结果如图4所示,引物P3/P4对嗜酸乳杆菌、其他乳酸菌及5 株阳性融合子和其他乳酸菌均呈阳性扩增,而纳豆芽孢杆菌呈阴性,说明引物P3/P4具有特异性,可以用于融合子鉴定。

2.5 融合子的单重PCR鉴定

P2对50 个菌株的PCR扩增结果
Fig.5 Results of PCR with P1/P2 for 50 infusant strains
图5 引物P1/

用已建立的PCR方法,利用引物对P1/P2从再生平板上挑取的50 个菌株进行鉴定,结果如图5,亲本纳豆芽孢杆菌呈扩增阳性,嗜酸乳杆菌呈阴性,所有50 个样品均呈阳性结果,但不一定都是阳性融合子,因为没有发生融合的以及自身融合的纳豆芽孢杆菌也会呈现阳性结果,因此需要进行β-半乳糖苷酶基因片段的检测,二者均呈阳性者方可鉴定为融合子。

图6 引物P3/P4对50 个样品菌株的PCR结果
Fig.6 Results of PCR with P3/P4 for 50 infusant strains

由图6可知,P3/P4引物在其优化的PCR体系下,对纳豆芽孢杆菌和待检菌株33、43、45均未扩增出目标条带,说明不含β-半乳糖苷酶基因。其他47 个待检菌株既能扩增出芽孢杆菌的特异性基因,又能扩增出乳酸菌的特异性基因,因此为阳性融合子。

2.6 多重PCR方法的建立

图7 在引物对P1/P2优化体系下50 株菌的多重PCR结果
Fig.7 Results of multiplex PCR of 50 strains under the optimized system with the primer pair P1/P2

引物P1/P2的优化PCR体系中加入4 条引物各0.75 μL,双蒸水补齐至25 μL,51.4 ℃退火。PCR结果(图7)表明该体系只扩增出了引物P1/P2的目标条带,可见该体系不可用。

图8 在引物对P3/P4优化体系下50 株菌的多重PCR结果
Fig.8 Results of multiplex PCR of 50 strains under the optimized system with the primer pair P3/P4

在已建立的引物对P3/P4的PCR优化体系中,加入4 条引物各1 μL,补双蒸水至25 μL,53 ℃退火进行PCR,由图8可知,经单重PCR鉴定的阳性融合子均扩增出了预期大小的双条带,依然是33、43、45号菌株没有扩增出乳酸菌的特异性片段,因此选择该体系作为纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌融合子鉴定PCR体系。

表5 50 个融合子的单重PCR和多重PCR鉴定结果
Table5 Results of multiplex PCR and monoplex-PCR of 50 infusant strains

注:+.阳性,出现该条带;-.阴性,无该条带。

?

由表5可知,多重PCR鉴定结果与单重PCR鉴定结果一致,但更快捷和经济。

2.7 表型鉴定

图9 菌体革兰氏染色芽孢观察
Fig.9 Observation of the spores by Gram staining

50 株待检测菌的菌落菌体经革兰氏染色,均可观察到和待检菌体5一样的成熟芽孢(图9),与PCR结果相符。

β-半乳糖苷酶显色反应结果表明,嗜酸乳杆菌溶液变黄呈阳性,而纳豆芽孢杆菌溶液不变色为阴性。待检菌株只有33、43、45呈阴性,说明不产β-半乳糖苷酶,其余呈阳性,与PCR结果相符。因此,该多重PCR方法成立,结果可靠,可用于纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳酸菌融合子的快速鉴定。

3 讨论与结论

多重PCR的原理、试剂和操作都与普通PCR相同,但其反应过程复杂,许多因素会影响其结果 [24]。在多重PCR中,引物设计是关键,目前尚缺乏简单实用的多重PCR引物设计软件,本研究设计的组合2 对引物P1/P2和P3/P4,靶片段相差268 bp,电泳时能够完全区分,保证了结果的准确判定。多重PCR还要考虑组合2 对引物相近的T m值,P1/P2和P3/P4的T m值均在52 ℃左右,保证多重PCR在同一退火温度条件下实现各自的特异性扩增。利用Primer Premier 5软件对引物进行分析,最大可能地避免了引物之间二聚体、发夹结构、环状结构以及引物与非靶标模板之间的互补等影响扩增效率的问题 [25-26]。可见从引物设计角度分析,P1/P2和P3/P4可以保证多重PCR的顺利进行。

本研究结果表明,针对芽孢形成早期因子基因spo0A设计的引物P1/P2,特异性检测结果表明对芽孢生成菌具有特异性。纳豆芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌的一个亚种,而枯草芽孢杆菌是典型的产芽孢模式微生物,其芽孢生成过程中的关键蛋白在所有能形成芽孢且基因测序完成的细菌中都存在,所以研究枯草芽孢杆菌芽孢形成所得出的结论普遍适用于所有芽孢杆菌科。spo0A是细胞从营养生长期进入芽孢形成期的关键应答调节蛋白,是芽孢阶段重要的转录调控因子,存在于所有芽孢杆菌 [27]。针对乳酸菌β-半乳糖苷酶基因设计的引物P3/P4,对芽孢生成菌无扩增,而只对乳酸菌和阳性融合子有扩增,因而具有特异性;因此从特异性角度出发,P1/P2和P3/P4不仅可用于纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌融合子的鉴定,还可用于地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等芽孢生成菌和保加利亚乳杆菌、清酒乳杆菌、植物乳杆菌、肉葡萄球菌等乳酸菌融合子的鉴定。因为根据乳酸菌的定义,所有乳酸菌均具有发酵乳糖生产乳酸的能力,而这种能力离不开β-半乳糖苷酶的作用。

本研究对13 株乳酸菌β-半乳糖苷酶基因序列进行比对,根据保守序列设计得到了特异性强的P3/P4引物对。在此之前,根据β-半乳糖苷酶曾设计了若干对引物,但这些引物虽然可以高效扩增嗜酸乳杆菌的目标片段,但在有的乳酸菌中没有扩增片段;有的虽然可对所有乳酸菌实现特异性扩增,但对已经通过单重PCR以及表型鉴定筛选出的阳性融合子无扩增,也被弃用,这也就揭示了本研究为什么在P3/P4特异性检测时分析其对4 个阳性融合子的扩增情况。

本研究建立的双重PCR体系,对纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌融合子的鉴定结果与表型鉴定和单重PCR鉴定结果100%吻合,说明所建立的双重PCR体系和方法可靠准确、方便快捷,为芽孢生成菌和乳酸菌融合子的快速鉴定提供了技术保障。

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Identif i cation of Lactobacillus acidophilus-Bacillus natto Fusant by Multiplex PCR

ZHANG Lin 1, PANG Fengping 1, HUO Nairui 2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

Abstract:A multiplex polymerase chain reaction (mPCR) assay for the rapid identif i cation of Lactobacillus acidophilus-Bacillus natto fusant was developed in this paper. The primer pair P1/P2 was designed based on the spo0A gene encoding the stage 0 sporulation protein A of Bacillus subtilis, as well as the primer pair P3/P4 according to the conserved sequence of the β-galactosidase gene of 13 lactic acid bacterial (LAB) strains. Using the genomic DNA of the parental strains as template, PCR systems for each primer pair were optimized under the predetermined annealing temperature. The specif i city analysis showed that P1/P2 could amplify the spo0A fragment (308 bp) but all seven LAB strains gave negative results; P3/P4 could amplify the target fragment (576 bp) from all LAB and fi ve identif i ed positive fusants but not from Bacillus subtilis. Results of multiplex PCR demonstrated that the optimal PCR system for P1/P2 could only amplify its own 308 bp target DNA, while in the optimal system for P3/P4 both target DNA fragments could be obtained. The results of identif i cation of 50 fusant strains by multiplex PCR showed 100% consistency with that of traditional PCR and phenotype identif i cation. The mPCR system contained 1 ng/μL template DNA, 0.4 μmol/L primer (each), 0.25 mmol/L dNTP, 0.06 U/μL Taq polymerase, and the PCR conditions were as follows: 5 min predenaturation at 94 ℃, 30 cycles of denaturation at 94 ℃ 30 s, annealing at 53 ℃ for 30 s, and extension at 72 ℃ for 60 s. This method proved to be a rapid, convenient method with high specif i city for the eff i cient identif i cation of spore-forming bacteria, LAB and their fusant.

Key words:stage 0 sporulation protein A gene (spo0A); β-galactosidase gene; fusant; multiplex polymerase chain reaction

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704016

中图分类号:TS201.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)04-0093-07

引文格式:

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张琳, 庞丰平, 霍乃蕊. 纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌融合子的多重PCR鉴定[J]. 食品科学, 2017, 38(4): 93-99.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704016. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Lin, PANG Fengping, HUO Nairui. Identif i cation of Lactobacillus acidophilus-Bacillus natto fusant by multiplex PCR[J]. Food Science, 2017, 38(4): 93-99. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704016. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-04-19

基金项目:山西省人社厅2013年留学回国人员科技活动择优资助项目

作者简介:张琳(1991—),女,硕士研究生,研究方向为食品生物技术。E-mail:zhanglinmailbox@163.com

*通信作者:霍乃蕊(1972—),女,教授,博士,研究方向为生物技术与食品安全。E-mail:tgnrhuo@163.com