山药低聚糖对2 种双歧杆菌的体外促生长作用

刘 露 1,2,3,张 雁 1,*,池建伟 1,魏振承 1,张名位 1

(1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所,农业部功能食品重点实验室,广东省农产品加工重点实验室,广东 广州 510610;2.华中农业大学食品科学技术学院,湖北 武汉 430070;3.广东丸美生物技术股份有限公司,广东 广州 510530)

摘 要:利用体外模型探讨了山药低聚糖对青春双歧杆菌和动物双歧杆菌的生长促进作用。以山药低聚糖取代葡萄糖为碳源添加到双歧杆菌基础培养基中,发现山药低聚糖对青春双歧杆菌和动物双歧杆菌的体外生长具有显著促进作用:随着山药低聚糖的加入,培养液中活菌数增加,pH值降低。当山药低聚糖取代葡萄糖且质量分数为0.5%时,青春双歧杆菌和动物双歧杆菌的最大生长量分别提高了(10.70±4.93)%和(6.02±2.00)%;pH值分别下降(2.64±0.001)%和(3.85±0.65)%。同时,山药低聚糖可提高青春双歧杆菌和动物双歧杆菌的生长速率,使其生长提前进入稳定期。

关键词:山药;低聚糖;双歧杆菌;促生长作用;益生元

双歧杆菌为革兰氏阳性、严格厌氧且无芽孢的多形态杆菌 [1]。它与人体健康息息相关,可发酵利用非消化性碳水化合物产生对人体有益的短链脂肪酸,其自身的存在与繁殖又可抑制病源菌的生长 [2]。人体内双歧杆菌的数量随着年龄的增长和生理机能的老化而逐渐减少,目前主要可通过口服活菌制剂、摄入合生元或益生元等途径来促进双歧杆菌增殖,维持肠道菌群平衡 [3]。由于双歧杆菌活菌制剂中菌种的活性较难保持,活菌剂和益生元的联合制剂合生元成本和价格较高,限制了其应用范围;摄入益生元因其良好的效果并具有便捷、经济等优点,成为目前应用最广泛的调节肠道微生物菌群的途径。

低聚糖在益生功能方面的优势使其成为应用最广泛的益生元 [4]。研究发现低聚糖具有预防便秘、结肠癌、糖尿病 [5]、冠心病、肿瘤等 [6]功效,特别是具有调节肠道微生态平衡的作用 [7],可被肠道菌群利用,促进益生菌的生长繁殖,抑制有害菌的滋生,从而利于人体润肠通便,安全排毒,提高机体免疫力,降低血糖、血脂,增进矿物质吸收 [8]

目前,植物低聚糖对双歧杆菌体外促进生长作用已有一些研究报道,如大豆低聚糖 [9]、魔芋葡甘低聚糖 [10]、金丝小枣低聚糖 [11]、牛蒡低聚糖 [12]、雪莲果低聚糖 [13]、大蒜低聚糖 [14]等均具有良好的调节双歧杆菌生长功效,而有关山药低聚糖体外促双歧杆菌增殖的功能研究鲜见报道。本实验利用体外模型探讨了不同质量分数山药低聚糖对青春双歧杆菌和动物双歧杆菌的生长促进作用,以期为山药及其低聚糖的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂、培养基

山药购于广州市越秀区果蔬批发市场,产地河南,品种为铁棍山药,新鲜度和成熟度良好;青春双歧杆菌、动物双歧杆菌 广州市微生物研究所;酵母提取物、牛肉浸膏、吐温-80等均为分析纯。

青春双歧杆菌基础培养基用于青春双歧杆菌的菌种活化、活菌计数及山药低聚糖对青春双歧杆菌的体外促生长实验。其配方(广州市微生物研究所提供)如下:大豆蛋白胨5.0 g、胰胨5.0 g、酵母粉10.0 g、葡萄糖10.0 g、盐溶液40.0 mL、L-半胱氨酸0.5 g、0.1%刃天青1.0 mL,蒸馏水定容1 000 mL,p H 6.5~7.0。其中盐溶液的配制:CaCl 20.2 g、Mg SO 4·7H 2O 0.48 g、K 2HPO 41.0 g、KH 2PO 41.0 g、Na HCO 31 0.0 g、NaCl 2.0 g、蒸馏水定容1 000 mL,pH值为6.5。

动物双歧杆菌基础培养基用于动物双歧杆菌的菌种活化、活菌计数及山药低聚糖对动物双歧杆菌的体外促生长实验。其配方(广州市微生物研究所提供)如下:蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖5.0 g、K 2HPO 40.45 g、KH 2PO 40.33 g、NH 4Cl 1.0 g、Mg SO 4·7 H 2O 0.1 g、L-半胱氨酸0.5 g、0.1%刃天青1.0 mL,蒸馏水定容1 000 mL,pH值为7.5。

1.2 仪器与设备

LRH-250生化培养箱 上海一恒科技有限公司;YQX-Ⅱ厌氧培养箱 上海跃进医疗器械有限公司;J J-C J-1 F洁净工作台 吴江市净化设备总厂;EYELASB-1100恒温水浴锅 东京理化器械株式会社;UV-1800紫外分光光度计 日本岛津公司;BS2105电子天平 德国Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 山药低聚糖的制备 [15]

工艺流程:鲜山药→切片→60 ℃烘9~10 h→粉碎,过80目筛→样品(水分(5.72±0.045)%)称质量→超声波辅助提取→抽滤浓缩→Sevag法脱蛋白→醇沉→上清液浓缩→冷冻干燥→低聚糖提取物。苯酚硫酸法测定 [16]低聚糖含量为(78.46±0.29)%。

1.3.2 双歧杆菌菌种活化

在无菌无氧操作条件下,取双歧杆菌冻干粉,用上述双歧杆菌基础培养基溶解。接种于双歧杆菌基础培养基上,(37±1)℃厌氧培养48 h,然后5%的接种量继续传代培养。活化后,传代3 次,取第3代菌液-80 ℃保存备用。

1.3.3 山药低聚糖对双歧杆菌体外生长的影响

在各菌种培养基中添加不同质量分数的山药低聚糖取代其中葡萄糖,青春双歧杆菌培养基中山药低聚糖质量分数分别达到0.125%、0.25%、0.5%、1.0%,其中质量分数达到1.0%时,为全取代葡萄糖;动物双歧杆菌培养基中山药低聚糖质量分数分别达到0.125%、0.25%、0.5%、1.0%,其中质量分数达到0.5%时,为全取代葡萄糖;分别于(37±1)℃厌氧静置培养,24 h后取出发酵液,测定发酵液OD 600 nm[17]、pH值及活菌数 [18]。以葡萄糖基础培养基为对照组,比较不同质量分数山药低聚糖对双歧杆菌的增殖效果 [11]

1.3.4 山药低聚糖对双歧杆菌体外生长曲线的影响

通过无菌手套在厌氧培养箱中进行以下实验操作:150 mL三角瓶内加入50 mL培养基,依据1.3.3节中的实验结果分别在以上两种双歧杆菌培养基中加入增殖效果最佳质量分数的山药低聚糖,静置培养48 h,每隔4 h从三角瓶中吸取0.1 mL发酵液,采用平板计数法,测定培养基中活菌数,以葡萄糖基础培养基为对照,研究山药低聚糖对双歧杆菌体外生长曲线的影响。

1.4 数据处理和统计分析

检测数据结果用 ±s表示,数据分析运用SPSS 18.0软件,采用方差分析进行统计分析,各处理组间的差异比较用最小显着差数法,P<0.05时有统计学意义。运用Microsoft Excel 2010软件绘制统计图表。

2 结果与分析

2.1 山药低聚糖对双歧杆菌体外生长的影响

2.1.1 OD 600 nm的变化

图1 山药低聚糖对青春双歧杆菌(A)和动物双歧杆菌(B)体外生长发酵液OD 600 nm的影响
Fig. 1 Impacts of Chinese yam oligosaccharide on the OD 600 nmof Bifi dobacterium fermentation broth

由图1可知,双歧杆菌在以山药低聚糖为碳源的培养基中能够生长增殖。对双歧杆菌而言,培养基中山药低聚糖质量分数并不是越高越好,以其质量分数为0.5%的增殖效果最好,相对于葡萄糖基础培养基对照组,青春双歧杆菌和动物双歧杆菌中的OD 600 nm分别提高了12%、16%,差异显著(P<0.05);山药低聚糖质量分数为0.125%、0.25%和1.0%时,青春双歧杆菌增殖效果不显著。山药低聚糖质量分数为0.125%、0.25%和1.0%时,动物双歧杆菌增殖效果显著优于对照组(P<0.05),但0.5%质量分数组增殖效果最好,与对照组差异极显著(P<0.01)。

2.1.2 pH值的变化

由图2可见,随着低聚糖质量分数的升高,培养基中产酸量增大,pH值均较对照组低。在青春双歧杆菌培养基发酵液中,山药低聚糖质量分数为0.5%(取代了基础培养基中葡萄糖的50%)时,p H值最低,比对照下降(2.64±0.001)%,差异显著(P<0.05);在动物双歧杆菌培养基发酵液中,pH值随山药低聚糖的加入而显著降低(P<0.05),各替代质量分数之间无显著性差异,在山药低聚糖全部取代葡萄糖,质量分数为0.5%时,比对照组下降(3.85±0.65)%,差异显著(P<0.05)。究其原因,山药低聚糖促进双歧杆菌增殖效果优于葡萄糖,进而产生更多量的短链脂肪酸,使得发酵液pH值更低 [19]

图2 山药低聚糖对青春双歧杆菌(A)和动物双歧杆菌(B)体外生长发酵液pH值的影响
Fig. 2 Impacts of Chinese yam oligosaccharide on the pH of Bifi dobacterium fermentation broth

2.1.3 活菌数的变化

图3 山药低聚糖对青春双歧杆菌(A)和动物双歧杆菌(B)体外生长发酵液活菌数的影响
Fig. 3 Impacts of Chinese yam oligosaccharides on the viable count of Bifi dobacterium in fermentation broth

如图3所示,在青春双歧杆菌培养液中,活菌数与OD 600 nm呈正相关,与p H值负相关,山药低聚糖质量分数为0.5%(取代了基础培养基中葡萄糖的50%)时,其活菌数比对照组增加了(10.70±4.9 3)%,呈显著性差异(P<0.05)。在动物双歧杆菌培养液中,培养24 h后,其活菌数随着山药低聚糖质量分数的提高呈上升趋势,均显著高于对照组。当山药低聚糖全部取代葡萄糖质量分数达到0.5%时,活菌数比对照组增加了(6.02±2.00)%(P<0.05)。这说明山药低聚糖作为碳源对双歧杆菌进行增殖的能力优于葡萄糖。但是,山药低聚糖质量分数增加到1.0%时,双歧杆菌的生长没有呈现继续增加的趋势,可能是低聚糖质量分数进一步提高导致渗透压增加,对细菌有一定脱水作用,抑制了益生菌的进一步生长,说明山药低聚糖对益生菌的促生长作用表现在一定的质量分数范围以内。

2.2 山药低聚糖对双歧杆菌体外生长曲线的影响

由上述山药低聚糖对青春双歧杆菌和动物双歧杆菌体外生长的结果可知,山药低聚糖对青春双歧杆菌和动物双歧杆菌均有显著促增殖作用。当山药低聚糖质量分数为0.5%时,增殖效果显著,其中,动物双歧杆菌培养基为全取代葡萄糖;青春双歧杆菌培养基为50%取代葡萄糖。以下是当山药低聚糖质量分数为0.5%时对双歧杆菌体外生长曲线影响的实验结果。

2.2.1 活菌数随时间的变化曲线

图4 山药低聚糖对青春双歧杆菌(A)和动物双歧杆菌(B)活菌数变化曲线的影响
Fig. 4 Impacts of Chinese yam oligosaccharides on the growth curves of viable counts of Bifi dobacterium adolescentis and Bifi dobacterium animalis in vitro

由图4可以看出,山药低聚糖对青春双歧杆菌和动物双歧杆菌的增殖效果优于葡萄糖对照组。培养的前4 h,山药低聚糖组和葡萄糖对照组中,活菌数都没有明显的提高;培养4 h后,两种发酵液中双歧杆菌的活菌数都开始有明显的增长趋势,且山药低聚糖组发酵液中活菌数比葡萄糖组同时间的活菌数高;双歧杆菌在山药低聚糖组发酵液中,在16 h时进入稳定期,而葡萄糖组的双歧杆菌在20 h时,才到稳定期。且都是在32 h后开始进入衰亡期。以山药低聚糖为碳源培养的双歧杆菌均比对照组生长速率快,青春双歧杆菌和动物双歧杆菌最大生长速率分别提高3.63%、11.68%。

2.2.2 pH值随时间的变化曲线

图5 山药低聚糖对青春双歧杆菌(A)和动物双歧杆菌(B)pH值变化曲线的影响
Fig. 5 Impacts of Chinese yam oligosaccharides on pH changes during the growth of Bifi dobacterium adolescentis and Bifi dobacterium animalis

由图5可以看出,随着培养时间的延长,pH值呈下降趋势。在青春双岐杆菌培养基发酵液中,几乎没有过渡期,p H值下降趋势很明显,直到28 h后才稳定。这可能是接菌过高所致。在动物双歧杆菌培养基发酵液中,发酵的前4 h,山药低聚糖组和葡萄糖对照组中pH值的变化均不明显。4 h后,两种发酵液中pH值变化呈显著的下降趋势。且都在28 h后趋势开始平缓。在p H值下降期间,山药低聚糖组发酵液中pH值比葡萄糖对照组pH值低,其中动物双歧杆菌的pH值变化更为显著。

3 讨 论

以山药低聚糖取代基础培养基中的葡萄糖作为碳源体外培养双歧杆菌,发现动物双歧杆菌和青春双歧杆菌均在培养基中山药低聚糖质量分数为0.5%时,增殖效果最佳。但在动物双歧杆菌培养基中山药低聚糖是全取代葡萄糖;而在青春双歧杆菌培养基中是50%取代葡萄糖,当其为全取代时,促生长效果减弱。

动物双歧杆菌和青春双歧杆菌分别在山药低聚糖不同的取代量时达到最大的增殖效果,可能与菌种的特异性有关。已有研究表明益生菌对低聚糖的利用情况具有菌株特异性 [2 0]。李艳丽等 [2 1]在研究低聚木糖对益生菌的体外增殖时发现,低聚木糖在培养基中质量分数为0.2%时对乳酸杆菌增殖效果最好,而在质量分数0.4%时对枯草芽孢杆菌起到最好的增殖作用;Robert等 [22]在研究人乳低聚糖对双歧杆菌体外生长代谢时发现,长双歧杆菌婴儿亚种能很好的利用人乳低聚糖进行增殖,两岐双歧杆菌次之,而长双歧杆菌长亚种、短双歧杆菌及青春双歧杆菌只能少量代谢利用人乳低聚糖。

青春双歧杆菌在0.5%山药低聚糖中增殖显著,但在1.0%时促增值效果减弱。表明山药低聚糖作为青春双歧杆菌培养基的碳源有适宜的质量分数。这与卢旭 [23]、李丹丹 [24]的研究结果具有相似性。卢旭 [23]在研究莲子低聚糖分别以l、3、5、7、10 g/L的质量浓度取代葡萄糖添加到基础培养基时发现,莲子低聚糖质量浓度增加到10 g/L时,对青春双歧杆菌促增殖效果减弱,以7 g/L(1.4倍的取代量)的添加质量浓度效果最佳。李丹丹 [24]研究了牛蒡菊糖取代基础培养基乳糖作为碳源促进青春双歧杆菌增殖的效果,当其添加量分别为0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%时,以1.0%(50%的取代量)的增殖效果最好。这可能是因为高含量的低聚糖在培养基中形成了较高的渗透压,对细菌产生了一定的脱水作用,抑制了其进一步的生长,而质量分数过低其促进作用又不明显 [25]

此外,山药低聚糖对双歧杆菌的体外促生长作用机理还与其低聚糖种类 [26]、单糖组成 [27]、聚合度 [28]、侧链的取代程度 [29]、糖苷键的位置等 [30]分子结构特征有关,这方面的研究尚有待进一步展开。

4 结 论

以山药低聚糖取代葡萄糖为碳源添加到双歧杆菌基础培养基中,发现山药低聚糖对青春双歧杆菌和动物双歧杆菌均具有良好的体外促生长作用。随着山药低聚糖的加入,培养液中活菌数增加,p H值降低。当山药低聚糖取代葡萄糖且质量分数为0.5%时,培养结束后,青春双歧杆菌和动物双歧杆菌的活菌数分别提高了(10.70±4.93)%和(6.02±2.00)%;p H值分别下降(2.64±0.001)%和(3.85±0.65)%。山药低聚糖可促使青春双歧杆菌和动物双歧杆菌的生长提前进入稳定期,提高青春双歧杆菌和动物双歧杆菌的生长速率。

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Promoting Effects of Oligosaccharides from Chinese Yam on the Growth of Two Species of Bifidobacteria in Vitro

LIU Lu 1,2,3, ZHANG Yan 1,*, CHI Jianwei 1, WEI Zhencheng 1, ZHANG Mingwei 1
(1. Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture, Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Sericultural & Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510610, China; 2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 3. Guangdong Marubi Biotechnology Co. Ltd., Guangzhou 510530, China)

Abstract:In the present work, the growth-promoting effects of Chinese yam oligosaccharides on B ifidoba cterium adolescentis and Bifidobacterium animals in vitro were examined. Being used as a substitute of carbon source for glucose in culture medium, Chinese yam oligosaccharides had signifi cant promoting effects on the growth of bifidobacteria. With the increase in added Chinese yam oligosaccharides, the viable count of the probiotic bacteria increased, while the pH value decreased. By glucose substitution with 0.5% Chinese yam oligosaccharides, the viable counts of B. adolescentis and B. animals increased by (10.70 ± 4.93)% and (6.02 ± 2.00)%, respectively, and the pH value decreased by (2.64 ± 0.001)% and (3.85 ± 0.65)% respectively. Meanwhile, Chinese yam oligosaccharides promoted the growth rate of bifidobacteria and resulted in earlier onset of the stationary growth phase.

Key words:Chinese yam; oligosaccharides; Bifidobacterium; growth-promoting effects; prebiotics

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706020

中图分类号:TS201.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)06-0130-06

引文格式:

刘露, 张雁, 池建伟, 等. 山药低聚糖对2 种双歧杆菌的体外促生长作用[J]. 食品科学, 2017, 3 8(6): 13 0-1 35.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706020. http://www.spkx.net.cn

LIU Lu, ZHANG Yan, CHI Jianwei, et al. Promoting effects of oligosaccharides from Chinese yam on the growth of two species of Bifidobacteria in vitro[J]. Food Science, 2017, 38(6): 130-135. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201706020. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-05-10

基金项目:广东省工业高新技术项目(2013B010102011);广州市产学研协同创新重大专项(201508020036);

广东省省属科研机构改革创新领域项目(2016B070701012);广东省应用型科技研发专项(2015B020230005)

作者简介:刘露(1990—),女,硕士研究生,研究方向为食品工程。E-mail:949556157@qq.com

*通信作者:张雁(1967—),女,研究员,博士,研究方向为食品生物化学。E-mail:zhang__yan_@126.com