酶解法去除透明质酸发酵液中蛋白质

牛全凤 1,徐 慧 2,李文婧 2,孙文涛 2,李 博 2,程 成 1,刘建军 1,2,*

(1.齐鲁工业大学生物工程学院,山东 济南 250300;2.山东省食品发酵工程重点实验室,山东 济南 250013)

摘 要:为有效降低透明质酸的蛋白质质量分数,通过单因素试验和响应面优化试验对酶解法去除透明质酸发酵液中蛋白质进行研究。在蛋白酶的筛选实验中,结果表明,胰蛋白酶处理后的蛋白质质量分数最低,并确定了胰蛋白酶酶解的最适条件:酶解pH 8.4、酶解温度50 ℃、酶用量44 000 U/g、酶解时间6 h。在此条件下透明质酸的蛋白质质量分数为6.75%,蛋白质去除率为66.25%。经过硅藻土进一步后处理,得到透明质酸产品蛋白质质量分数小于0.1%,蛋白质去除率达到99%以上,符合医药级透明质酸标准。

关键词:透明质酸;蛋白质;胰蛋白酶;响应面法

透明质酸是由Meyer和Plamer于1934年首次从牛眼玻璃体中分离得到的一种直链高分子黏多糖 [1-3],由双糖单位D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖通过β-(1→3)和β-(1→4)糖苷键反复交替连接而成,分子质量在1.0×1 0 5~4.0×1 0 6D之间 [4-6]。因透明质酸具有保水性、高黏弹性和良好的生物相容性,在化妆品、保健品和医疗等领域应用十分广泛,市场前景广阔 [7-9]。但目前我国医药级透明质酸无论是质量还是产量均远远不能满足市场的需求,而蛋白质含量是划分医药级和化妆品级透明质酸的一个重要标准,因此,如何有效去除发酵液中的蛋白质对获得医药级透明质酸具有重要意义 [1 0-13]

本研究选择中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶这3 种专一性较低的蛋白酶 [14-16],利用蛋白酶分解发酵液中的蛋白质,从而降低透明质酸的蛋白质含量,开发出能用于生产高纯度医药级透明质酸的提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

透明质酸发酵液(透明质酸质量浓度约为5.68 g/L,蛋白质质量分数约为20%) 山东省食品发酵工业研究设计院;95%乙醇、氯化钠、三氯乙酸、四硼酸钠、考马斯亮蓝、浓硫酸 国药集团化学试剂有限公司;硅藻土 临江市绿江助滤剂有限公司;咔唑 天津市光复精细化工研究所;葡萄糖醛酸对照品、胰蛋白酶、牛血清白蛋白 生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 仪器与设备

JJ-1精密增力电动搅拌器 金坛市科析仪器有限公司;7 2 2可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;JY2002天平 上海精密科学仪器有限公司;pH计 丹佛仪器(北京)有限公司;循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 透明质酸提取工艺流程

快速搅拌下,在发酵液中加入2 倍发酵液体积的95%乙醇 [17-19],静置3 h后,离心得粗品沉淀。将沉淀在等体积的蒸馏水中复溶,用三氯乙酸调发酵液pH值至4.5,静置1 h,以杀灭菌体、使蛋白质变性。利用蛋白酶酶解发酵液中的蛋白质后,快速搅拌下加入1 倍体积的95%乙醇稀释。采用硅藻土抽滤的方法除去发酵液中的部分菌体和残余蛋白质 [20-23]。最后再添加发酵液1 倍体积的95%乙醇沉淀,沉淀用无水乙醇脱水后五氧化二磷真空干燥得透明质酸成品。

1.3.2 蛋白酶种类的选择

选用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶3 种专一性比较低的酶,在酶用量45 000 U/g(按照发酵液中蛋白质含量计算)各自最适p H值、最适温度条件下酶解处理发酵液3 h,根据蛋白质质量分数,选择酶解效果最佳的蛋白酶。3 种蛋白酶的最适pH值、最适温度条件如表1所示。

表1 3 种蛋白酶的最适pH值、温度条件
Table 1 Optimum pH and temperature conditions for three proteases

酶种类中性蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶pH 7 7 8温度/℃50 60 40

1.3.3 酶解条件单因素试验

单因素试验的基本条件为:酶用量44 000 U/g、酶解温度50 ℃、酶解时间6 h、pH 8.5。各因素梯度分别为:酶用量40 000~50 000 U/g、酶解温度30~70 ℃、酶解时间0~8 h、pH 7.0~9.0。

1.3.4 响应面试验设计

根据Box-Behnken模型试验设计原理,综合单因素试验结果,选取透明质酸提取的酶解pH值(A)、酶解温度(B)、酶用量(C)作为自变量,透明质酸的蛋白质质量分数作为响应值,采用响应面的分析方法,对酶解过程的工艺参数进行优化,响应面试验因素及水平如表2所示。

表2 响应面试验因素及水平
Table 2 Factors and their coded and actual levels used in response surface analysis

水平因素A酶解pH B酶解温度/℃C酶用量/(U/g)-1 8.0 40 42 000 0 8.5 50 44 000 1 9.0 60 46 000

1.3.5 测定方法

透明质酸质量浓度采用咔唑法 [24]测定,蛋白质质量分数采用考马斯亮蓝法 [25]测定,并按以下公式计算。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶种类的选择

表3 蛋白酶种类对酶解效果的影响
Table 3 Influence of different proteases on protein removal

酶种类中性蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶蛋白质质量分数/%13.63 17.11 7.89

由表3可知,胰蛋白酶的酶解效果明显优于中性蛋白酶与木瓜蛋白酶,酶解后蛋白质质量分数最低,因此选择胰蛋白酶,并对其酶解条件进一步优化。

2.2 酶解法提取发酵液中透明质酸的单因素试验

2.2.1 酶用量的选择

图1 酶用量对透明质酸蛋白质质量分数的影响
Fig. 1 Influence of enzyme dosage on the protein content

由图1可知,随着酶用量的增加,蛋白质质量分数逐渐降低,这是因为酶浓度越高,酶解反应速率越快。当酶用量增加到44 000 U/g时,蛋白质质量分数达到最低值。继续增加酶用量,蛋白质质量分数增高,分析是因为酶本身就是一种蛋白质,过量添加酶制剂带入了大量外源蛋白质。因此酶用量选择44 000 U/g。

2.2.2 酶解温度的选择

图2 酶解温度对透明质酸蛋白质质量分数的影响
Fig. 2 Influence of reaction temperature on the protein content

由图2可知,随着酶解温度的升高,透明质酸的蛋白质质量分数呈现先降低后升高的趋势,在酶解温度50 ℃时蛋白质质量分数最低。温度过低会抑制酶活力,温度逐渐升高,酶催化反应的速度逐渐加快,当温度升高到50 ℃时透明质酸的蛋白质质量分数达到最低,温度过高则会使酶变性,丧失酶活力。因此酶解温度选择50 ℃。2.2.3 酶解pH值的选择

图3 酶解pH值对透明质酸蛋白质质量分数的影响
Fig. 3 Influence of initial pH on the protein content

由图3可知,当酶解p H值为8.5时,透明质酸的蛋白质质量分数最小,效果最佳。偏离此pH值,酶的空间构象改变,酶活力降低,且pH值过高会使胰蛋白酶失活。因此选择酶解pH值为8.5。

2.2.4 酶解时间的选择

图4 酶解时间对透明质酸蛋白质质量分数的影响
Fig. 4 Influence of hydrolysis time on the protein content

由图4可知,随着酶解时间的延长,透明质酸的蛋白质质量分数逐渐减小,6 h之后蛋白质质量分数趋于稳定,这说明在6 h时间里酶解反应已经进行得较为充分。酶解时间过长,不但影响生产效率,还容易发生微生物污染,分解破坏透明质酸。考虑到实际生产问题选择6 h为酶解时间。

2.3 响应面优化试验结果

2.3.1 Box-Behnken试验设计与结果分析

根据单因素试验结果,选择酶解p H值(A)、酶解温度(B)、酶用量(C)为Box-Behnken设计的3 个因素,优化酶解条件的响应面试验设计及结果见表4。

表4 Box-Behnken试验设计与结果
Table 4 Box-Behnken design with experimental results

试验号A酶解pH B酶解温度C酶用量蛋白质质量分数/% 1 1 0 -1 8.49 2 0 0 0 6.83 3 1 -1 0 8.73 4 1 1 0 8.83 5 -1 0-1 7.47 6 0 -1 1 8.43 7 0 1 -1 7.96 8 -1-1 0 7.62 9 -1 0 1 8.34 10 0 0 0 6.86 11 0 0 0 6.68 12-1 1 0 8.37 13 0-1-1 7.98 14 1 0 1 8.83 15 0 1 1 8.75 16 0 0 0 6.75 17 0 0 0 6.64

2.3.2 回归模型的建立与显著性检验

表5 回归模型的方差分析
Table 5 Analysis of variance for the regression model

注:*.差异显著(P<0.05);**.差异极显著(P<0.01)。下同。

差异源平方和自由度均方F值P值回归模型10.980 9 1.220 115.60<0.000 1**残差0.074 7 0.011失拟项0.038 3 0.013 1.44 0.355 6纯误差0.035 4 8.870×10 -3总计11.050 16 R 2=0.993 3 R 2 Adj=0.984 7

利用Design-Expert 8.0软件对表4数据结果进行回归分析,对数据进行多元回归拟合,获得pH值、酶解温度和酶用量的二次回归方程为:

Y=6.740+0.390 A+0.170 B+0.300 C-0.160 A B-0.130AC+0.033BC+0.820A 2+0.083B 2+0.720C 2

由表5可知,该回归模型P<0.000 1,表明方程模型达到极显著,方法可行;失拟项P>0.05,表明不显著;该模型的决定系数R 2为0.993 3,调整决定系数 为0.984 7,说明拟合程度良好,试验产生的误差较小。因此该回归模型成立,可以用此模型对酶解提取发酵液中透明质酸进行分析及预测。

表6 回归方程系数显著性分析
Table 6 Significance test for each regression coefficient of the developed regression equation

差异源平方和自由度均方F值P值A酶解pH 1.190 1 1.190 112.39<0.000 1** B酶解温度0.170 1 0.170 15.67 0.005 5 C酶用量0.750 1 0.750 71.11<0.000 1** AB 0.110 1 0.110 10.01 0.015 8 AC 0.070 1 0.070 6.66 0.036 5 BC 0.029 1 0.029 2.74 0.141 9 A 22.820 1 2.820 267.68<0.000 1** B 22.810 1 2.810 266.05<0.000 1** C 22.130 1 2.130 202.02<0.000 1**

由表6可知,影响透明质酸蛋白质质量分数的因素顺序为:酶解pH值>酶用量>酶解温度。其中酶解pH值与酶用量的影响达到极显著水平;酶解温度的影响达到显著水平;酶解pH值与酶解温度的交互作用、酶解pH值与酶用量的交互作用的影响达到显著水平。

2.3.3 响应面试验分析结果

图5 酶解pH值和酶解温度对透明质酸蛋白质质量分数的交互影响
Fig. 5 Response surface and contour plots showing the effects of initial pH and reaction temperature on the protein content

由图5可知,酶解p H值与酶解温度两因素之间的交互作用显著,其中酶解p H值对透明质酸的蛋白质质量分数影响很大,随着酶解p H值的增加,蛋白质质量分数先逐渐减少后迅速增加,酶解pH值过高会导致胰蛋白酶逐渐失活,本身成为一种蛋白杂质。由图6可知,酶解pH值与酶用量两因素之间的交互作用显著,随着酶用量的增加,透明质酸的蛋白质质量分数先减少后增加,分析原因可能是随着酶用量的增加,酶解效果逐渐增强,当酶用量超过44 000 U/g时,酶浓度趋于饱和。由图7可知,酶解温度与酶用量两因素之间的交互作用不显著,其中随着温度的增加,透明质酸的蛋白质质量分数先减少后增加,分析原因可能是与酶的最适温度有关。

图6 酶解pH值和酶用量对透明质酸蛋白质质量分数的交互影响
Fig. 6 Response surface and contour plots showing the effects of initial pH and enzyme dosage on the protein content

图7 酶解温度和酶用量对透明质酸蛋白质质量分数的交互影响
Fig. 7 Response surface and contour plots showing the effects of reaction temperature and enzyme dosage on the protein content

通过响应面分析得到酶解提取发酵液中透明质酸的最佳工艺条件为酶解pH 8.38、酶解温度48.87 ℃、酶用量44 000 U/g,该工艺提取得到的透明质酸蛋白质质量分数为6.70%。考虑实际需要对上述工艺条件进行调整,即酶解pH 8.4、酶解温度50 ℃、酶用量44 000 U/g。以此条件为标准进行3 次验证实验,得到的透明质酸的蛋白质质量分数为6.75%,与理论值接近,同优化前蛋白质质量分数7.96%相比,降低了约15%。表明运用响应面法优化得到的该模型具有一定的实践指导意义。

2.4 硅藻土后处理

因酶解处理后的发酵液中仍含有部分菌体和残余蛋白质,因此采用硅藻土抽滤的方法进行后处理。快速搅拌下加入发酵液1 倍体积的95%乙醇稀释,利用1 cm厚的硅藻土预敷层进行抽滤,后往滤液中继续加入1 倍体积的95%乙醇沉淀,干燥后得到透明质酸产品,蛋白质质量分数小于0.1%,符合医药级透明质酸标准。

3 结 论

透明质酸的产业前景广阔,国际市场对医药级透明质酸的需求逐年增长,鉴于我国透明质酸的质量问题一直制约着其应用领域。本研究以透明质酸的蛋白质质量分数为评价指标,在中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶中选取蛋白质去除率最高的胰蛋白酶作为酶解法提取发酵液中透明质酸的最适蛋白酶。通过单因素试验和响应面优化试验考察了酶用量、酶解温度、酶解pH值和酶解时间对透明质酸蛋白质质量分数的影响,确定了酶解法提取发酵液中透明质酸的最佳工艺条件为酶解pH 8.4、酶解温度50 ℃、酶用量44 000 U/g、酶解时间6 h,在此条件下透明质酸的蛋白质质量分数为6.75%。经过硅藻土抽滤处理后,得到透明质酸产品蛋白质质量分数小于0.1%,蛋白质去除率达到99%以上,达到了医药级透明质酸标准。酶解法去除透明质酸发酵液中蛋白质反应条件温和,可使透明质酸与蛋白质的络合解除,有利于透明质酸的分离提取,对实现医药级透明质酸的产业化生产具有实际意义。

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Enzymatic Removal of Protein from Fermentation Broth Containing Hyaluronic Acid

NIU Quanfeng 1, XU Hui 2, LI Wenjing 2, SUN Wentao 2, LI Bo 2, CHENG Cheng 1, LIU Jianjun 1,2,*
(1. College of Biological Engineering, Qilu University of Technology, Jinan 250300, China; 2. Food and Fermentation Engineering Key Lab of Shandong Province, Jinan 250013, China)

Abstract:The present work was aimed at optimizing the enzymatic removal of protein from the fermentation broth rich in hyaluronic acid using a combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The results showed that trypsin was selected as the best enzyme for minimum protein content. The optimal hydrolysis conditions were obtained as follows: initial pH value, 8.4; temperature, 50 ℃; enzyme dosage, 44 000 U/g; and time, 6 h. Under these conditions, the protein content was reduced to 6.75% with a percentage removal of 66.25%. After further processing with diatomite, the protein content was decreased to as low as 0.1% with a percentage removal of over 99%, which reached the standard of pharmaceutical grade hyaluronic acid.

Key words:hyaluronic acid; protein; trypsin; response surface methodology

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706025

中图分类号:R284.2

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)06-0160-05

引文格式:

牛全凤, 徐慧, 李文婧, 等. 酶解法去除透明质酸发酵液中蛋白质[J]. 食品科学, 2017, 38(6): 160-164. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201706025. http://www.spkx.net.cn

NIU Quanfeng, XU Hui, LI Wenjing, et al. Enzymatic removal of protein from fermentation broth containing hyaluronic acid[J]. Food Science, 2017, 38(6): 160-164. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706025. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-05-11

作者简介:牛全凤(1992—),女,硕士研究生,研究方向为微生物资源开发。E-mail:Niuquanfeng0629@163.com

*通信作者:刘建军(1962—),男,研究员,博士,研究方向为微生物资源开发。E-mail:liujj-2000@163.com