响应面试验优化动物源性食品中呋喃西林代谢物ELISA检测的衍生条件

彭宏威 1,白瑞樱 2,陈 殿 1,孙远明 1,徐振林 1,曾道平 3,李 段 3,伍志权 4,杨金易 1,*

(1.华南农业大学食品学院,农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室,广东省食品质量安全重点实验室,广东 广州 510642;2.新乡医学院生理学与神经生物学教研室,河南 新乡 453003;

3.广州万联生物科技有限公司,广东 广州 510642;4.广东汇信农产品检验有限公司,广东 佛山 528200)

摘 要:利用响应面法优化酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测呋喃西林代谢物前处理的衍生条件。根据Box-Behnken试验设计原理,在单因素试验基础上,以呋喃西林代谢物回收率为响应值,应用响应面分析法研究衍生剂体积、衍生剂浓度、衍生温度和衍生时间各因素间的交互作用及对呋喃西林代谢物回收率的影响。最终确定ELISA方法线性检测范围为0.13~10.51 ng/mL,IC 50为1.17 ng/mL;在选取样品质量为2 g时,最佳衍生条件为衍生剂体积415 μL、衍生剂浓度15 mmol/L、衍生温度57 ℃、衍生时间50 mi n,实际回收率为98.57%~103.76%;衍生产物与呋喃西林原药交叉反应率为7.63%,与其他结构类似物、功能类似物及衍生剂交叉反应率均小于0.17%;加标回收率为93.45%~103.21%,批内变异系数为1.86%~6.15%,批间变异系数为3.88%~8.84%。该衍生条件高效,检测方法准确可靠,适用于动物源性食品中呋喃西林代谢物的快速筛查。

关键词:呋喃西林代谢物;衍生条件;响应面法;动物源性食品;酶联免疫吸附法

呋喃西林是一种人工合成的具有硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药,对革兰阳性菌及革兰阴性菌均具有很好的抗菌作用 [1],因其效高廉价,故在畜牧和水产养殖中得到广泛应用。由于呋喃西林药物及其代谢物具有毒性和致癌性,欧盟已于1995年将其列为禁用药物 [2],我国也在2002年将其列为禁用药物。呋喃类原药在动物体内极不稳定,代谢迅速,代谢物可与组织蛋白形成稳定的化合物 [3],一旦过度使用,会导致呋喃类药物及其代谢物在可食用组织中严重残留,这极大地威胁了人类的身体健康。因此,呋喃类药物及其代谢物的检测和危害评估等 [4-9]一直是科研工作者们的研究热点,呋喃类代谢物的免疫检测方法众多,其中酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)因其具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测时间短、适合大规模现场检测、高通量等特点 [10-11],已经广泛应用于动物产品及相应食品中呋喃类的快速检测中 [12-16]

在动物体内,由于呋喃类药物容易代谢,所以通常都是检测呋喃类代谢物,又因为呋喃类代谢物分子质量比较小,故在免疫检测方法中只能先对其进行衍生再检测它的衍生产物 [17]。但ELISA法检测实际样品中的呋喃类代谢物并作定量分析时容易出现较大的偏差,除了样品基质对抗原抗体结合的影响外,样品前处理衍生过程也是决定最后检测结果的关键。高效的衍生方法往往使检测过程及效果均事半功倍,近年来,用于免疫检测的快速衍生方法 [18-19]使用愈加广泛,效果良好。

本实验选取呋喃西林代谢物(semicarbazide,SEM)为研究对象,对SEM衍生化反应条件进行优化筛选,着重考察衍生剂体积、衍生剂浓度、衍生温度和衍生时间对SEM回收率及衍生率的影响,应用响应面分析法优化SEM衍生条件,以期建立更为可靠、稳定且灵敏的SEM快速检测方法,为呋喃类快速检测前处理条件提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼肉、虾肉、猪肉和鸡肉样品 广州市长湴市场佳恩超市。

2-硝基苯亚甲基-氨基脲(2-n itro b en zy lid en esemicarbazide,NPSEM)单克隆抗体、包被原 广州万联生物科技有限公司;HRP标记羊抗鼠IgG 武汉博士德生物工程有限公司;SEM、NPSEM、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃唑酮、2-硝基苯亚甲基-氨基乙内酰脲(2-nitrobenzylidene-aminohydantoin,NPAHD)、2-硝基苯亚甲基-3-氨基-2-唑酮(n itrobe nzy lid ene-3-amino-2-oxazolone,NPAOZ)和2-硝基苯亚甲基-3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮(2-nitrobenzylidene-3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone,NPAMOZ) 美国Sigma公司;2-硝基苯甲醛、氯霉素、孔雀石绿 百灵威化学公司;包被液、稀释液、洗涤液、封闭液均按照文献[20]方法配制;乙酸乙酯、正己烷、磷酸氢二钠、氯化钠等试剂均为市售国产分析纯;实验用水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

Wellwash MK-2洗板机、Multiskan MK-3酶标仪美国Thermo公司;6K-15高速冷冻离心机 美国Sigma-Sato rius公司;微量移液器 美国Epp end o rf公司;Peference超纯水系统 美国密理博公司;DK-8D型电热恒温水槽 上海医用恒温设备厂;BSA224S型电子天平赛多利斯科学仪器有限公司;96孔可拆卸酶标板 深圳金灿华实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NPSEM间接竞争ELISA法基本操作步骤

用包被液将NPSEM包被原稀释一定倍数,加入酶标板孔中,100 μL/孔,37 ℃包被过夜;用洗涤液洗2 次,拍干,加入120 μL封闭液,37 ℃水浴箱孵育3 h,甩干孔中液体,放37 ℃烘箱中烘干备用。取50 μL稀释好的标准品溶液或处理好的样液到包被好的板条中,加入50 μL稀释好的NPSEM单克隆抗体,在37 ℃水浴箱中孵育40 min,用洗液洗5 次;拍干后加入100 μL酶标二抗(羊抗鼠),在37 ℃水浴箱中孵育30 min,用洗液洗5次;拍干后加入底物缓冲液和底物液等体积混合液100 μL/孔,混匀后置于37 ℃水浴箱孵育10 min。加入50 μL终止液,用波长为450 nm的酶标仪测定吸光度。

1.3.2 NPSEM间接竞争ELISA标准曲线的绘制

用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液配制质量浓度为36.45、12.15、4.05、1.35、0.45、0.15、0.05、0.02、0 ng/mL的NPSEM标准品溶液。按照1.3.1节方法测定每个质量浓度的吸光度,每个质量浓度重复测定3次。以NPSEM药物质量浓度对数为横坐标,B/B 0值(%)为纵坐标,采用OriginPro 8.5软件进行拟合,绘制NPSEM间接竞争ELISA方法的标准曲线。根据标准曲线计算出该方法的半抑制浓度(IC 50)和线性范围(IC 20~IC 80)。

1.3.3 样品前处理

取2 g均质好的鱼肉样品,分别加入4 m L水、0.5 mL 1 mol/L HCl溶液和10 0 μL 10 mmo l/L 2-硝基苯甲醛溶液,充分振荡3 min。在60 ℃水浴条件下孵育1 h,取出后加入5 m L 0.1 mo l/L磷酸氢二钾溶液、0.4 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液、6 mL乙酸乙酯,充分振荡混合1 min,4 000 r/min离心5 min;移取上层溶液3 mL于10 mL离心管中,在60 ℃的水浴或空气吹干仪中,用氮气或空气吹干;向吹干的试管中加入1 mL正己烷,加盖振荡1 min,然后加入1 mL磷酸盐缓冲液,充分混匀,4 000 r/min离心1 min(或静置至明显分层);吸取0.5 mL下层溶液,待检。

1.3.4 衍生反应单因素试验

准确称取2 g经液相色谱验证未检出呋喃西林及其代谢物的空白鱼肉样品,依次添加20 μL质量浓度分别为100、300 ng/mL和1 000 ng/mL的SEM标准品溶液,另外称取2 g空白鱼肉样品,添加20 μL去离子水来做对照实验。各个单因素试验按照下列条件分别进行:固定衍生剂2-硝基苯甲醛浓度10 mmol/L、衍生温度60 ℃和衍生时间1 h,分别比较不同的衍生剂体积(50、100、200、300、400、500 μL)所得到的SEM回收率;固定衍生剂2-硝基苯甲醛体积100 μL、衍生温度60 ℃和衍生时间1 h,分别比较不同的衍生剂浓度(2.5、5、10、15、20、25 mmol/L)所得到的SEM回收率;固定衍生剂2-硝基苯甲醛浓度10 mmol/L、衍生剂体积100 μL和衍生时间1 h,分别比较不同的衍生温度(20、30、40、50、60、70、80、90 ℃)所得到的SEM回收率;固定衍生剂2-硝基苯甲醛浓度10 mmol/L、衍生剂体积100 μL和衍生温度60 ℃,分别比较不同的衍生时间(10、20、30、40、50、60、70、80 min)所得到的SEM回收率。单因素试验均采用1.3.3节方法进行前处理,每次实验不同变量均设置有如前所述1、3 ng/g和10 ng/g 3 个含量水平的添加回收实验及空白对照实验,每组实验重复3次,用ELISA法检测SEM衍生后的目标产物,计算回收率的平均值作为衡量指标,分别考察衍生剂体积、衍生剂浓度、衍生温度和衍生时间对衍生效果的影响。

1.3.5 SEM衍生反应条件的响应面试验

在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken设计原理,以衍生剂体积(A)、衍生剂浓度(B)、衍生温度(C)、衍生时间(D)为自变量,采用四因素三水平,以在空白样品中添加3 ng/g SEM测定的回收率(Y)为响应值进行响应面分析设计。试验因素与水平设计见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平设计
Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of the optimization parameters used in Box-Behnken experimental design

因素水平A衍生剂B衍生剂浓度/C衍生D衍生体积/μL(mmol/L)温度/℃时间/min -1 300 10 45 40 0 400 15 55 50 1 500 20 65 60

1.3.6 特异性实验

抗体的特异性用交叉反应率来表示,它反映了某种测定方法对被测物质的专一程度。对检测方法特异性的考察,通常比较待测物与其结构或功能类似物质之间的交叉反应率。本研究以NPSEM衍生物为基准物质,采用ELISA测定方法,依次绘制其他结构类似物、功能类似物及其衍生物竞争抑制曲线,计算结构类似物及其衍生物的IC 50,以下式计算交叉反应率。

1.3.7 准确性和精密度测定

通过加标回收率实验及相应的批内变异系数和批间变异系数来验证该方法的可靠性。对空白的鸡肉、虾肉、猪肉和鱼肉样品分别添加1、3 ng/g和10 ng/g 3个水平含量的SEM标准品,按照1.3.5节响应面优化方案所得的最佳衍生条件进行前处理,结合ELISA测定方法,每个水平做6次重复,并分批进行6次实验,分别计算出每次实验的回收率,并求其平均值,同时计算出批内变异系数和批间变异系数。

1.3.8 两种衍生方法的比较及实际样品的测定

对空白的鸡肉、虾肉、猪肉和鱼肉样品进行添加回收实验,结合ELISA方法,分别测定采用响应面法优化的最佳衍生条件和优化前大多数商业试剂盒所采用的衍生方式的回收率,比较两种衍生方式的差异性。

随机抽取鸡肉、虾肉、猪肉和鱼肉盲样各5份,用本实验所用的ELISA方法结合响应面优化的最佳前处理方法与GB/T 20752—2006《猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》 [21]分别对其进行检测,根据检测的结果验证本实验建立的ELISA方法及最佳衍生方式可靠有效。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

在最佳条件下,对NPSEM标准品溶液系列质量浓度进行ELISA实验,以NPSEM标准品溶液质量浓度对数为横坐标,B/B 0值为纵坐标,利用Origin Pro 8.5软件进行拟合,结果如图1所示。标准曲线的线性范围为0.13~10.51 ng/mL,可在此范围内进行精确检测,IC 50为1.17 ng/mL,检测限(IC 10)为0.088 ng/mL。对线性方程范围内的4 个NPSEM标准品溶液质量浓度对数值及相对应的B/B 0值进行线性模拟,所得线性方程为y=-26.89 x+ 62.48,R 2=0.997 9。

图1 NPSEM-ELISA标准曲线(n=3)
Fig. 1 Standard curve of NPSEM-ELISA (n = 3)

2.2 衍生化反应单因素试验结果

2.2.1 衍生剂体积对回收率的影响

图2 衍生剂体积对SEM回收率的影响(n=3)
Fig. 2 Effect of derivatization agent volume on the recovery of SEM determined by ELISA (n = 3)

图2 结果表明,衍生剂体积从5 0 μL增大到4 00 μL时,回收率不断增大,衍生效率也逐步提高,当衍生剂体积超过400 μL后,回收率基本不再发生变化。这是因为SEM衍生所需的衍生剂用量基本已达到饱和,增加衍生剂并不会继续提升衍生率。因此,初步确定衍生剂的最佳使用体积为300~500 μL。

2.2.2 衍生剂浓度对回收率的影响

由图3可知,衍生剂2-硝基苯甲醛的浓度小于15 mmol/L时,随着衍生剂浓度的不断增大,回收率呈现逐渐上升的趋势,衍生效率也不断提高;当衍生剂浓度大于15 mmol/L后,回收率基本不再发生变化,说明衍生剂的量基本达到饱和状态。因此,初步确定衍生剂的最佳浓度为10~20 mmol/L。

图3 衍生剂浓度对SEM回收率的影响(n=3)
Fig. 3 Effect of derivatization agent concentration on the recovery of SEM determined by ELISA (n = 3)

2.2.3 衍生温度对回收率的影响

图4 衍生温度对SEM回收率的影响(n=3)
Fig. 4 Effect of derivatization temperature on the recovery of SEM determined by ELISA (n = 3)

由图4可知,衍生温度在20~60 ℃范围内,SEM回收率随温度的升高而增大,衍生效率逐渐提高,当温度超过60 ℃时,回收率反而有所下降。说明在50~60 ℃范围内,衍生产物生成量相对稳定,这跟曹志海等 [22]报道基本一致。因此,初步确定衍生温度为45~65 ℃。

2.2.4 衍生时间对回收率的影响

图5 衍生时间对SEM回收率的影响(n=3)
Fig. 5 Effect of derivatization time on the recovery of SEM determined by ELISA (n = 3)

由图5可知,衍生时间从1 0 min延长到50 min时,SEM回收率逐渐增大并达到最大值,衍生时间超过50 min以后,随着时间的增加,回收率基本保持不变,衍生率不再增加。说明SEM在6 0℃条件下快速衍生50 min时即可获得最大的衍生产物量;这种高温短时的前处理方法在近些年来屡次被用在许多快速免疫检测方法 [23-24]中,跟许多常规衍生方法 [25-2 6]相比,节省了大量的前处理时间,具有极大的优势。因此,初步确定衍生时间为40~60 min。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 Box-Behnken试验设计与结果

在单因素试验结果的基础上,根据Box-Behnken设计原理 [27],采用四因素三水平响应面分析法优化SEM衍生条件。共进行了29 组试验,其中5 组为区域的中心点(5 个零点)重复试验,用以估计试验误差,响应面分析方案及试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

试验号A衍生剂体积B衍生剂浓度C衍生温度D衍生时间Y回收率/% 1-1-1 0 0 74.71 2 1-1 0 0 91.95 3-1 1 0 0 87.95 4 1 1 0 0 97.67 5 0 0-1-1 73.28 6 0 0 1-1 83.26 7 0 0-1 1 79.64 8 0 0 1 1 96.59 9-1 0 0-1 77.83 10 1 0 0-1 81.68 11-1 0 0 1 75.34 12 1 0 0 1 98.27 13 0-1-1 0 72.31 14 0 1-1 0 93.74 15 0-1 1 0 97.35 16 0 1 1 0 94.62 17-1 0-1 0 78.33 18 1 0-1 0 88.24 19-1 0 1 0 91.02 20 1 0 1 0 97.85 21 0-1 0-1 83.96 22 0 1 0-1 80.48 23 0-1 0 1 81.21 24 0 1 0 1 98.52 25 0 0 0 0 104.38 26 0 0 0 0 101.36 27 0 0 0 0 102.93 28 0 0 0 0 103.31 29 0 0 0 0 102.92

2.3.2 方差分析

利用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行整理与回归拟合,得到关于衍生剂体积、衍生剂浓度、衍生温度和衍生时间的模型。回归方程为:

Y=102.98+5.87A+4.29B+6.26C+4.09D-1.88AB-0.77AC+4.77A D-6.04 BC+5.20BD+1.74C D-7.88A 2-6.17B 2-7.20C 2-11.72D 2

表3 回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

注:*. P<0.05,差异显著;**. P<0.01,差异极显著。

方差来源平方和 自由度 均方 F值 P值模型2 945.82 14 210.42 63.15<0.000 1** A衍生剂体积413.95 1 413.95 124.24<0.000 1** B衍生剂浓度220.94 1 220.94 66.31<0.000 1** C衍生温度470.63 1 470.63 141.25<0.000 1** D衍生时间200.74 1 200.74 60.25<0.000 1** AB 14.14 1 14.14 4.24 0.058 5 AC 2.37 1 2.37 0.71 0.413 0 AD 91.01 1 91.01 27.31 0.000 1** BC 145.93 1 145.93 43.80<0.000 1** BD 108.06 1 108.06 32.43<0.000 1** CD 12.15 1 12.15 3.65 0.076 9 A 2402.43 1 402.43 120.78<0.000 1** B 2247.17 1 247.17 74.18<0.000 1** C 2336.53 1 336.53 101.00<0.000 1** D 2891.61 1 891.61 267.59<0.000 1**残差46.65 14 3.33失拟项41.95 10 4.19 3.57 0.115 7纯误差4.70 4 1.17总和2 992.46 28

回归方程的方差分析如表3所示,模型P值小于0.000 1,表明试验选用的模型极显著。模型失拟项P=0.115 7>0.05,表明失拟项相对于绝对误差不显著,模型选择合适,模型可靠。回归方程相关系数R 2为0.968 8,变异系数为2.04%,说明回收率实际值与预测值之间具有较好的拟合度,方程可较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。

由表3可知,因素A、B、C、D、AD、BC、BD、A 2、B 2、C 2、D 2对SEM回收率影响极显著(P<0.01)。由F值可以看出,衍生条件对SEM回收率的影响程度从大到小依次为:衍生温度>衍生剂体积>衍生剂浓度>衍生时间。

2.3.3 响应面分析及衍生条件优化

通过方差分析对交互作用显著的因素绘制等高线与响应面图,能够更直观深入地探讨相关变量之间的交互影响并且找到最优点,固定任意两个因素,考察另两个因素的交互作用即得等高线与响应面如图6所示,响应面陡表示交互作用显著,响应面缓则不显著 [28]。由图6可知,衍生剂体积与衍生时间、衍生剂浓度与衍生温度、衍生剂浓度与衍生时间均有着显著的交互作用。

图6 各因素交互作用对SEM回收率影响的等高线及响应面图
Fig. 6 Response surface plots and corresponding contour plots showing the effect of various parameters on the recovery of SEM

2.4 验证实验结果

采用Design-Expert软件对参数进行优化分析,得到SEM衍生反应的最佳条件为衍生剂体积414.70 μL、衍生剂浓度14.68 mmol/L、衍生温度57.05 ℃、衍生时间49.90 min,对应的SEM回收率为104.71%。为检验模型的准确性,分别在空白样品中添加1、3 ng/g和10 ng/g的SEM进行回收率实验,每个水平均重复3 次实验,根据响应面分析结果将SEM衍生条件设定为衍生剂体积415 μL、衍生剂浓度15 mmol/L、衍生温度57 ℃、衍生时间50 min,最后得到的回收率分别为98.57%、103.76%和101.41%。实测值与理论值没有显著性差异,说明采用响应面分析法优化SEM的衍生条件可靠。

2.5 特异性实验结果

抗体的特异性是衡量抗体质量的重要指标,本实验选取了呋喃类抗生素及其代谢物、邻硝基苯甲醛和氯霉素等12 种SEM的结构类似物或功能类似物来做交叉反应,实验结果见表4。从表4可知,NPSEM与呋喃西林有一定的交叉反应率(7.63%),可能是因为SEM与其原药有类似的结构所致,而对其他的结构类似物或功能类似物交叉反应率均较低,表明NPSEM抗体特异性良好。

表4 SEM交叉反应率的测定结果
Table 4 Determination of the cross-reactivity of SEM by ELISA

竞争药物IC 50/(ng/mL)交叉反应率/% NPSEM 0.98 100 NPAHD 896.54 0.11 NPAOZ>2 000<0.05 NPAMOZ>2 000<0.05 SEM 573.72 0.17呋喃西林12.84 7.63呋喃妥因>2 000<0.05呋喃唑酮>2 000<0.05呋喃它酮>2 000<0.05邻硝基苯甲醛>2 000<0.05恩诺沙星>2 000<0.05氯霉素>2 000<0.05孔雀石绿>2 000<0.05

2.6 准确性和精密度测定结果

ELISA法测定的准确度以回收率表示,精密度以变异系数表示。分别取空白鸡肉、虾肉、猪肉和鱼肉样本,以1、3、10 ng/g 3个添加量的SEM对其进行添加回收实验,每个添加量做6 个平行实验,并分批进行6 次实验,计算其平均回收率和变异系数。由表5的结果可知,鸡肉、虾肉、猪肉和鱼肉的加标平均回收率范围为93.45%~103.21%,批内变异系数为1.86%~6.15%,批间变异系数为3.88%~8.84%,表明该ELISA方法的准确度和精确度较好。

表5 ELISA方法的准确度和精密度(n=6)
Table 5 Accuracy and precision of the ELISA method (n= 6)

样品SEM添加量/平均批内变异批间变异(ng/g)回收率/%系数/%系数/% 1 96.28 5.93 3.88鸡肉398.84 3.43 6.78 10 102.35 1.86 4.95 1 93.45 4.67 7.81虾肉398.96 3.31 6.11 10 102.63 2.98 5.47 1 97.38 6.15 8.16猪肉3101.93 2.76 8.79 10 98.55 2.58 4.65 1 94.86 5.64 8.84鱼肉3103.21 4.23 6.53 10 100.76 3.59 5.17

2.7 两种衍生方法的比较

响应面法优化的衍生方式与未经优化的衍生方式结合ELISA法测定鸡肉、虾肉、猪肉和鱼肉样品中的SEM结果如表6所示。响应面优化的衍生方法回收率为9 5.6 3%~1 03.88%,未经优化的衍生方法回收率为74.97%~94.47%。采用未经优化的衍生方法来处理动物源性样品时,除了个别样品的回收率达到了90%以上,但都没有超过95%,绝大部分回收率都不是十分理想;而经过响应面法优化的衍生方法回收率全部都在95%以上,且测定值比较稳定,误差较小,经过响应面法优化的衍生方法具有明显的优势。

表6 两种衍生方法处理样品的比较
Table 6 Comparison between optimized and unoptimized derivatization method

样品SEM添加量/响应面优化衍生方法未经优化衍生方法(ng/g)测定值/(ng/g)回收率/%测定值/(ng/g)回收率/% 1 0.96 96.36 0.92 91.64鸡肉32.87 95.81 2.54 84.56 10 10.39 103.88 7.50 74.97 1 1.02 101.74 0.86 86.34虾肉32.98 99.21 2.83 94.47 10 9.56 95.63 9.33 93.26 1 1.00 100.42 0.75 75.42猪肉32.87 95.82 2.35 78.49 10 9.73 97.27 8.02 80.24 1 0.99 98.53 0.78 77.62鱼肉33.01 100.49 2.36 78.55 10 10.35 103.53 8.45 84.52

2.8 实际样品的测定结果

通过本实验所建立的ELISA方法和仪器方法对随机抽取的鸡肉、虾肉、猪肉和鱼肉样品进行测定,结果筛选出5 份阳性样品,其中鸡肉1 份、猪肉2 份、鱼肉2 份,两种方法比较结果见表7。由表7可知,本实验ELISA方法对20种盲样的检测结果跟液相色谱-串联质谱的测定结果基本一致,5种阳性样品的测定结果也非常接近,因此可以说明本实验ELISA方法适用于动物组织中SEM残留的快速筛选。

表7 ELISA法和液相色谱-串联质谱法检测实际样品的结果
Table 7 Results of determination by ELISA and LC-MS/MS of SEM in real samples ng/g

注:—.未检出。

样品号ELISA检测液相色谱-串联质谱检测鸡肉1——鸡肉2——鸡肉3 0.83 0.57鸡肉4——鸡肉5——虾肉1——虾肉2——虾肉3——虾肉4——虾肉5——猪肉1——猪肉2 1.63 1.48猪肉3——猪肉4 3.52 3.44猪肉5——鱼肉1——鱼肉2 1.86 1.75鱼肉3 0.63 0.72鱼肉4——鱼肉5——

3 结 论

本研究所建立的E L IS A方法线性检测范围为0.13~10.51 ng/mL,IC 50为1.17 ng/mL。在此ELISA方法的基础上,先采用单因素试验设计考察了衍生剂体积、衍生剂浓度、衍生温度和衍生时间对SEM回收率的影响,并在此基础上,利用响应面分析法优化了SEM的快速衍生条件,建立了衍生条件与SEM回收率关系的回收模型,回归数学模型相关系数R 2为0.968 8,经方差分析证明模型合理可靠,能够较好预测SEM的回收率。各因素对SEM回收率的影响程度从大到小依次为:衍生温度>衍生剂体积>衍生剂浓度>衍生时间。响应面分析得到的最佳衍生条件为衍生剂体积415 μL、衍生剂浓度15 mmol/L、衍生温度57 ℃和衍生时间50 min,实际回收率98.57%~103.76%;在最佳条件下,加标回收率为93.45%~103.21%,批内变异系数为1.86%~6.15%,批间变异系数为3.88%~8.84%,SEM回收率与理论值无显著差异,响应面分析法优化SEM的衍生条件准确可靠;NPSEM除与呋喃西林原药交叉反应率为7.63%,与其他结构类似物、功能类似物及衍生剂交叉反应率均小于0.17%,NPSEM抗体的特异性较好。该衍生条件和检测方法均表现出较好的应用前景,用于动物源性食品中SEM的快速筛查具有较大的优势。

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Optimization of Derivatization Conditions by Response Surface Methodology for the Determination of Semicarbazide in Animal-Derived Foods by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

PENG Hongwei 1, BAI Ruiying 2, CHEN Dian 1, SUN Yuanming 1, XU Zhenlin 1, ZENG Daoping 3, LI Duan 3, WU Zhiquan 4, YANG Jinyi 1,*
(1. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment in Agricultural Products Preservation, Ministry of Agriculture, Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. Department of Physiology and Neurobiology, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China; 3. Guangzhou Wanlian Biological Technology Co. Ltd., Guangzhou 510642, China; 4. Guangdong Huixin Agricultural Product Inspection Co. Ltd., Foshan 528200, China)

Abstract:The derivatization conditions for the determination of semicarbazide by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were optimized using combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology with Box-Behnken design. The independent variables were volume and concentration of derivatization agent, derivatization temperature and time and the recovery of semicarbazide was used as response variable. The linear range of ELISA was 0.13-10.51 ng/mL and the 50% inhibitory concentration (IC 50) value was 1.17 ng/mL. The optimal derivatization conditions were determined as follows: using 415 μL of 15 mmol/L derivatization agent and derivative at 57 ℃ for 50 min. Under these conditions, the recovery of semicarbazide was in the range of 98.57%-103.76%. The cross-reactivity value of the derivatization product was 7.63% with furacilin and lower than 0.17% with its structural and functional analogues. The recoveries in spiked negative samples ranged from 93.45% to 103.21%. The intra-assay and inter-assay coefficients of variation were 1.86%-6.15% and 3.88%-8.84%, respectively. The derivatization conditions were highly efficient and the ELISA method was sensitive, accurate, and suitable for the fast screening of semicarbazidee in animal-derived foods.

Key words:semicarbazide (SEM); derivatization conditions; response surface methodology; animal-derived foods; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

DOI:=288,ebook=302

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706045

中图分类号:TS207.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)06-0287-08

收稿日期:2016-06-29

基金项目:国家星火计划项目(2012GA780001;2013GA780035);“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD31B0302);

广东省自然科学基金项目(S2013030013338);NSFC-广东联合基金项目(U1301214);广东省科技计划项目(2012A020100002);广州市珠江科技新星专项(2013J2200080);广州市科技计划项目(2014J4200015)

作者简介:彭宏威(1990—),男,硕士研究生,研究方向为食品质量与安全。E-mail:penghong.wei@163.com

*通信作者:杨金易(1979—),男,副研究员,博士,研究方向为食品质量与安全。E-mail:yjy361@163.com

引文格式:

彭宏威, 白瑞樱, 陈殿, 等. 响应面试验优化动物源性食品中呋喃西林代谢物ELISA检测的衍生条件[J]. 食品科学, 2017, 38(6): 287-294.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706045. http://www.spkx.net.cn

PENG Hongwei, BAI Ruiying, CHEN Dian, et al. Optimization of derivatization conditions by response surface methodology for the determination of semicarbazide in animal-derived foods by enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Food Science, 2017, 38(6): 287-294. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706045. http://www.spkx.net.cn