抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌的胞内作用机制

陈飞龙 1,2,刘渔珠 1,彭 勃 1,陈咏春 1,苗建银 1,3,曹 庸 1,3,*

(1.华南农业大学食品学院,广东 广州 510642;2.南宁赢创美诗药业有限公司,广西 南宁 530100;3.广东省天然活性物工程技术研究中心,广东 广州 510642)

摘 要:研究副干酪乳杆菌FX-6产抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌胞内抑菌作用机制。通过凝胶阻滞电泳、荧光光谱考察抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌DNA的结合作用及方式,考马斯亮蓝法检测、聚丙烯酰胺凝胶电泳考察抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌蛋白合成的影响,邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷法、荧光指示剂法分别测定抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌胞内β-半乳糖苷酶、非特异酯酶表达活性的影响,流式细胞仪分析F1对金黄色葡萄球菌细胞周期的影响。结果显示,抗菌肽F1能以嵌插方式与金黄色葡萄球菌细胞内的DNA结合,阻碍其遗传信息正常表达,使其蛋白的合成减少,并使胞内β-半乳糖苷酶、非特异性酯酶的表达活性减弱,胞内酶系统紊乱,影响其正常代谢,生长周期无法顺利进行,从而起到抑菌的效果。

关键词:抗菌肽F1;金黄色葡萄球菌;胞内作用机制;细胞周期

食品安全是本世纪优先解决的重大问题之一 [1]。我国卫生和计划生育委员会在官方网站通报的2014年食物中毒事件报告中,微生物中毒事件和中毒人数最多,分别占食物中毒事件总数和中毒总人数的42.5%和67.7%,相比2013年,分别增长38.8%和14.1%。其中,金黄色葡萄球菌(Stap hylococcus a ureus)是重要的食源性致病微生物 [2],容易污染乳品、水产品、肉类等食品,其引发的食物毒在细菌性食物中毒中占较大的比例 [3],严重危害人类的健康。同时,人们对食品防腐剂的使用越来越严格,对其品质也要求越来越高,因此,天然食品防腐剂的开发和应用受到广大研究者的关注 [4],而作为天然来源的抗菌肽,具有异于传统抗菌剂的抗菌机制,已成为近年来研究的热点 [5-6]。DNA是生物体储存、复制和传递遗传指令的物质基础,在遗传信息传递、物质合成、生长发育等生物过程中起关键性作用。因此,抗菌药物若与菌体的DNA作用,会干扰菌体的遗传指令的传递,影响与新陈代谢相关的物质合成,从而给菌体的物质代谢、能量代谢带来不良的影响,最终达到抑菌的作用。目前,抗菌药物主要通过静电作用、嵌插作用、沟槽作用与菌体的DNA结合 [7-8]

在前期研究 [9-10]中,从由西藏开菲尔中筛选得到的一株新菌株副干酪乳杆菌FX-6(L a cto b ac illu s p a rac ase i FX-6)的发酵提取物中分离纯化到一种新型的抗菌肽,并将其命名为F1,分子质量为2 113.842 D,由18 个氨基酸组成。同时,F1的抗菌谱广,是首次报道的由副干酪乳杆菌坚韧亚种产生的既能对多数细菌又能对霉菌产生抑菌作用的抗菌肽。另外,抗菌肽F1具有极强的耐热性、较强的耐酶和酸碱的特征。而抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为59.13 μmol/L,而本实验就是以金黄色葡萄球菌为研究对象,考察抗菌肽F1与金黄色葡萄球菌基因组DNA的相互作用,并分析其作用于DNA之后对金黄色葡萄球菌蛋白质合成、β-半乳糖苷酶表达活性、胞内非特异性酯酶活性和细胞周期的影响,以此探讨抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌的胞内作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

抗菌肽F1由广东省天然活性物工程技术研究中心实验室自制 [9];发酵菌副干酪乳杆菌FX-6(L a cto b a cillus paracasei FX-6)、供试菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923(Staphylococcus aureus ATCC25923)由华南农业大学食品学院微生物实验室保藏。

LB肉汤培养基 广东环凯微生物科技有限公司;磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS) 武汉博士德生物工程有限公司;邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷 广州瑞舒生物科技有限公司;TE缓冲液 北京鼎国生物技术有限公司。M9乳糖诱导培养基:磷酸氢二钠1.28 g、磷酸二氢钾0.3 g、氯化钠0.05 g、氯化铵0.1 g、硫酸镁0.05 g、氯化钙0.001 g、乳糖0.5 g,用双蒸水定容至100 mL。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-50A高压灭菌器 上海申安医疗器械有限公司;SW-CJ-1G型单人净化工作台 上海雷韵试验仪器制造有限公司;L-530型台式低速离心机 湖南湘仪仪器有限公司;RE-52AA型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;PL203型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;FD-1PF型立式冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司;LC-15C型高压液相色谱-质谱联用仪、UV-VIS型紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司;DH500BⅡ型电热恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司;En Spire2300型多功能酶标仪 美国Perkinelmer公司;KQ500-B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;GelDoc XR+凝胶成像系统 美国Bio-Rad科技有限公司;NanoDrop2000超微量分光光度计 赛默飞世尔科技公司;JY92-2D细胞超声破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌肽F1与金黄色葡萄球菌DNA相互作用

收集对数期的金黄色葡萄球菌菌体,然后采用十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)法 [11]提取金黄色葡萄球菌基因组DNA,室温干燥,重溶于10 0 μL的TE缓冲液。用超微量分光光度计测定基因组DNA的OD 260 nm、OD 2 80 n m,OD 260 nm/OD 2 80 n m比值为1.8~1.9,DNA纯度较高。同时,0.8%琼脂糖凝胶电泳未观察到DNA降解。

凝胶阻滞实验 [12]分析抗菌肽F1与金黄色葡萄球菌DNA的结合情况:凝胶阻滞实验的反应体系为12 μL,金黄色葡萄球菌基因组DNA与抗菌肽F1溶液按1∶1(V/V)添加,两者混匀后,置于生化培养箱中37 ℃条件下作用30 min后加入2 μL上样缓冲液,采用1%的琼脂糖凝胶,电压90 V,电流70~80 mA,电泳时间约60 min,加样量10 μL。电泳结束后,将电泳胶置于凝胶成像系统下观察、记录,分析DNA的迁移情况。

抗菌肽F1与溴化乙锭(ethidium bromide,EB)竞争性结合DNA的荧光光谱实验 [13]分析抗菌肽F1与金黄色葡萄球菌基因组DNA的作用方式:用TE缓冲液将金黄色葡萄球菌基因组DNA稀释为50 μg/mL。反应在96 孔板进行,首先每个孔加入50 μL的DNA溶液和0.75 μL 100 μg/mL EB 溶液,混匀后置于生化培养箱中37 ℃条件下避光孵育10 min。接着加入50 μL不同浓度的肽溶液,空白对照组用50 μL蒸馏水代替,混匀之后置于生化培养箱中37 ℃避光孵育30 min。孵育结束后,用多功能酶标仪测定样品在激发波长535 nm及发射波长550~750 nm范围内的荧光光谱。

1.3.2 抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌蛋白合成的影响

参考文献:[1 4]的方法,金黄色葡萄球菌过夜培养至对数生长期,4 00 0 r/min离心10 min收集菌体,PBS洗涤2 次后,用新鲜无菌的LB肉汤培养基重悬至1.0×10 8CFU/mL,接着移取900 μL菌悬液至2 mL离心管中,加入100 μL抗菌肽F1,使其终浓度为3×MIC,37 ℃条件下孵育不同时间,4 000 r/min离心10 min弃上清液。同时,添加等体积的无菌水作为空白对照组。将离心收集的菌体沉淀用PBS清洗2 次后,离心弃上清液,分别添加50 μL 10 g/L溶菌酶和50 μL TE缓冲液,使之重悬,并置于37 ℃恒温培养箱中孵育10 min。接着分别加入500 μL冰冷20%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)和400 μL冰纯水,混匀之后冰浴10 min。然后,离心弃上清液,用1 mL冰冷的10% TCA重悬,离心去上清液,转移菌体沉淀至干净的10 mL试管中,先加入100 μL 0.15 mol/L Na Cl溶液重悬,再加入5 m L考马斯亮蓝染色液(含考马斯亮蓝G-250 100 mg,95%乙醇50 mL,85%磷酸100 mL,蒸馏水定容至1 00 0 mL),混匀后置于室温1 h,最后测定其在595 nm波长处的吸光度。实验重复3 次,数据取其平均值。

同时,取得3×MIC F1作用金黄色葡萄球菌过程中0、20、50、80 min的菌体,在600 nm波长处调节其吸光度为0.3后,取2.5 mL进行4 000 r/min离心5 min,弃上清液后,加无菌水1 mL混匀,4 000 r/min离心5 min,弃上清液,加入10 μL 5×SDS上样缓冲液,混匀,于沸水浴中加热5 min,加入30 μL无菌水混匀后离心,取18 μL上清液上样,参考文献[15]的方法进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)分析。

1.3.3 抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌胞内β-半乳糖苷酶表达活性的影响 [14,16]

金黄色葡萄球菌于3 7 ℃摇床培养至对数期,离心收集,PBS洗涤2 次,用无菌的M9乳糖诱导培养基重悬,并于3 7 ℃恒温培养箱中培养5~8 h,4 0 00 r/min离心1 0 min洗涤2 次菌体后,用LB肉汤培养基重悬至1.0×10 8CFU/mL待用。取10 mL重悬后的菌液,分别加入100 μL抗菌肽F1,使其终浓度为相应倍数的MIC,同时添加100 μL无菌水作为空白对照组。各组于37 ℃条件下温育1 h,4 000 r/min离心10 min清洗菌体2 次。菌体沉淀用50 μL TE缓冲液和50 μL 10 g/L溶菌酶重悬,37 ℃条件下温育10 min,接着加入1 mL β-半乳糖苷酶反应缓冲液,置200 W超声波细胞粉碎仪中,冰浴,间歇式超声5 min。4 500 r/min离心15 min,取上清液50 μL于96 孔板中,添加100 μL β-半乳糖苷酶反应缓冲液,再添加50 μL的10 g/L邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG),混匀,37 ℃条件下温育2 h,加入50 μL 1 mol/L Na 2CO 3溶液终止反应,用酶标仪检测其在420 nm波长处的吸光度。

1.3.4 抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌胞内非特异性酯酶表达活性的影响

参考文献[17]的方法,4 000 r/min离心10 min收集对数后期金黄色葡萄球菌菌体,PBS清洗2 遍,用新鲜无菌LB肉汤培养基重悬至1.0×10 8CFU/mL。分别加入抗菌肽F1使肽的终浓度为MIC的倍数,并且以等体积的无菌水作为空白对照组,混匀后加入5 μL 10 mmol/L二乙酸荧光素在37 ℃条件下染色10 min,然后置于37 ℃的多功能酶标仪中孵育并连续测定其荧光值,其中激发波长480 nm、发射波长530 nm。

1.3.5 抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌周期的影响

参考文献[18]的方法,取对数期金黄色葡萄球菌菌液,4 000 r/min离心10 min收集菌体,PBS洗涤2 遍,重悬为1.0×10 8CFU/mL的菌悬液。加入抗菌肽F1溶液使其终浓度为1×MIC、3×MIC,混匀后置于37 ℃、150 r/min的摇床中培养1 h。同时,加入等体积的无菌水做空白对照。培养完之后,4 000 r/min离心10 min收集菌体细胞,弃上清液,PBS清洗2 次。接着加入1 m L预冷(-20 ℃)的70%乙醇充分重悬菌体细胞沉淀,并置于4 ℃冰箱过夜固定。固定后,4 000 r/min离心10 min去上清液,PBS清洗2 次,向金黄色葡萄球菌细胞沉淀中加入450 μL PBS重悬,再加入50 μL 1 mg/ml RNase溶液和5 μL 1 mg/mL碘化丙锭(propidium iodide,PI)溶液,混匀后置于4 ℃条件下避光孵育15 min,最后使用流式细胞仪分析。实验重复3 次,数据取其平均值。

1.4 数据分析

运用SPSS 17.0对测定的数据进行显著性比较分析。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽F1与金黄色葡萄球菌DNA相互作用

抗菌肽进入菌体细胞内,与菌体DNA结合后影响菌体细胞的正常生理功能,从而达到抑菌效果,这是部分抗菌肽的作用机制 [19]。琼脂糖凝胶阻滞实验常用来考察抗菌肽与菌体DNA的结合作用,它通过分析样品的电泳迁移率来分析抗菌肽与菌体DNA的结合情况 [20-21]。若抗菌肽F1与金黄色葡萄球菌的DNA发生结合,则其在电泳中的迁移率就会受到影响,即与单独的DNA迁移距离相比有一定的滞后。

图1 抗菌肽F1与金黄色葡萄球菌DNA结合的凝胶阻滞分析
Fig. 1 Gel electrophoresesis of S. aureus genomic DNA treated with antimicrobial peptide F1

如图1所示,当抗菌肽F1浓度为2 3 6 μmo l/L时,可以观察到明显的凝胶阻滞现象。当抗菌肽F1浓度为700 μmol/L时,DNA几乎全部被阻滞在点样孔附近,可能是抗菌肽F1与DNA大量结合导致的。同时,DNA的条带明显变暗,这可能是因为抗菌肽F1与DNA结合,从而竞争了核酸染料与DNA的结合位点,使的DNA的条带变暗的。为了进一步了解抗菌肽F1与金黄色葡萄球菌基因组DNA的相互作用,分析了抗菌肽F1与EB竞争性结合DNA的荧光光谱。

图2 抗菌肽F1与EB竞争性结合金黄色葡萄球菌DNA的荧光光谱
Fig. 2 Fluorescence spectra of competitive binding of antimicrobial peptide F1 and EB with S. aureus genomic DNA

在水溶液中,EB的荧光很弱,但是当它通过以较高的亲合力、嵌入的方式与双链DNA结合时,其荧光强度大幅度增强 [22]。若EB-DNA复合物体系中存在能与DNA发生类似作用的物质将结合在DNA上的EB竞争下来时,体系的荧光强度就会降低,说明竞争物与EB一样的嵌插作用模式与DNA结合。因此,通过测定DNA-EB复合物体系与竞争物作用的荧光光谱的变化,来判定竞争物是否也同EB一样通过嵌插方式与DNA结合。

EB-DNA复合物与抗菌肽F1的荧光光谱如图2所示,结果显示随着抗菌肽F1浓度的增加,EB-DNA复合物的荧光强度也显著降低(P<0.05),说明抗菌肽F1与金黄色葡萄球菌DNA发生了嵌插结合,把之前结合在DNA碱基对的EB竞争下来,代替EB以嵌插方式与DNA结合,使整个体系的荧光强度降低。

2.2 抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌蛋白合成的影响

如图3所示,对照组即没经过抗菌肽F1处理的金黄色葡萄球菌的蛋白含量呈稳定且略有上升的趋势,说明其生长基本正常。而经3×MIC抗菌肽F1处理的金黄色葡萄球菌的蛋白含量随着作用时间的延长在持续并显著下降(P<0.05),说明抗菌肽F1影响金黄色葡萄球菌的基因转录或翻译的过程,抑制其蛋白的合成,从而导致蛋白的含量降低。为更全面地了解抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌蛋白的影响,取等量的3×MIC抗菌肽F1作用0、20、50、80 min后的金黄色葡萄球菌进行蛋白电泳分析。如图4所示,0 min时的金黄色葡萄球菌的蛋白条带清晰完整,颜色较深,但是随着时间的延长,金黄色葡萄球菌的蛋白条带清晰度显著下降及颜色显著变浅(P<0.05),说明金黄色葡萄球菌经抗菌肽F1处理之后,其蛋白合成受到抑制,尤其分子质量为20~30 kD的蛋白质。

图3 抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌蛋白的影响
Fig. 3 Influence of antimicrobial peptide F1 on the protein synthesis of S. aureus

图4 抗菌肽F1作用金黄色葡萄球菌后的蛋白电泳图
Fig. 4 SDS-PAGE of S. aureus proteins treated with antimicrobial peptide F1

2.3 抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌胞内β-半乳糖苷酶表达活性的影响

经M9诱导的金黄色葡萄球菌会产生β-半乳糖苷酶,而ONPG会被β-半乳糖苷酶催化水解,从而生成半乳糖、黄色的邻-硝基苯酚 [23],因此,通过测定反应体系的吸光度可以考察β-半乳糖苷酶的表达活性。如图5所示,对照组金黄色葡萄球菌的β-半乳糖苷酶表达活性最高,而添加了抗菌肽F1的金黄色葡萄球菌的β-半乳糖苷酶的表达活性显著下降(P<0.05),且抗菌肽F1的浓度越高,活性下降越显著(P<0.05)。因此,抗菌肽F1能抑制金黄色葡萄球菌的胞内酶β-半乳糖苷酶的表达活性,扰乱金黄色葡萄球菌胞内酶系统,对其生长繁殖产生不利影响。

图5 抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌胞内β-半乳糖苷酶表达活性的影响
Fig. 5 Inhibition of β-galactosidase activities of S. aureus cells by antimicrobial peptide F1

2.4 抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌胞内非特异性酯酶表达活性的影响

二乙酸荧光素是一种可用于评价细胞酶活力的荧光染料,它能够穿越细胞膜,进入细胞后,二乙酸荧光素会被细胞内非特异性酯酶水解生成极性、不能穿过细胞膜的荧光物质:羧基荧光素。因此,若反应体系荧光强度降低,表明细胞内酶体系紊乱,细胞代谢受到影响 [17,24]

图6 抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌胞内非特异性酯酶的影响
Fig. 6 Inhibition of non-specific esterase activities of S. aureus cells by antimicrobial peptide F1

如图6所示,随着时间的延长,对照组的荧光强度逐渐增强而后趋于平缓,说明金黄色葡萄球菌胞内非特异性酯酶先逐渐大量合成而后合成减少且趋于稳定。与对照组相比,添加1×MIC、3×MIC抗菌肽F1的反应体系的荧光强度显著低于对照组(P<0.05),其中3×MIC抗菌肽F1组荧光强度最低。由此推测抗菌肽F1作用金黄色葡萄球菌之后,会抑制其细胞内非特异性酯酶表达活性,抑制其合成,导致细胞内酶系统紊乱,从而影响金黄色葡萄球菌的正常代谢,不利于其正常生长繁殖。

2.5 抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌周期的影响

金黄色葡萄球菌的生长周期由I、R、D 3 个时期组成,没有DNA复制的后期G2期。其中,I期是指DNA复制前的准备时期,相当于真核细胞的G1期;R期是指DNA复制的时期,相当于真核细胞的S期;D期是指细胞分裂的时期,相当于真核细胞的M期 [18,25]

图7 对照组(A)、1×MIC F1(B)、3×MIC F1(C)处理组金黄色葡萄球菌流式细胞周期图
Fig. 7 Cell cycle profiles of S. aureus in different treatment groups

由图7可知,阴影面积越来越大,即处于S期(R期)金黄色葡萄球菌比例越来越高。

图8 不同处理组金黄色葡萄球菌的S期细胞数统计
Fig. 8 Percentages of S-phase cells of S. aureus in different treatment groups

由图8可知,对照组、1×MIC抗菌肽F1组、3×MIC抗菌肽F1处理组处于S期的细胞比例分别为4 7.46%、5 3.52%、6 1.6 6%,经抗菌肽F1处理后金黄色葡萄球菌处于S期的细胞数显著高于正常的金黄色葡萄球菌(P<0.05),即经抗菌肽F1的处理后,更多的金黄色葡萄球菌细胞滞留在S期,而S期属于金黄色葡萄球菌DNA的复制期,说明抗菌肽F1结合并插入金黄色葡萄球菌DNA,会影响其正常的信息传递和正常生理功能,抑制金黄色葡萄球菌DNA的复制,这可能是抗菌肽F1结合并插入金黄色葡萄球菌DNA导致其结构发生变化,从而阻碍遗传信息正常表达的结果。

3 结 论

本研究发现抗菌肽F1以嵌插方式与金黄色葡萄球菌的DNA结合,进而阻碍金黄色葡萄球菌遗传信息正常表达,使金黄色葡萄球菌蛋白的合成减少,并使金黄色葡萄球菌胞内β-半乳糖苷酶、非特异性酯酶的表达活性减弱,胞内酶系统紊乱,干扰其正常代谢,导致其生长周期无法顺利进行,即细菌无法分裂,从而起到抑菌的效果。

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Intracellular Mechanism of Action of Antimicrobial Peptide F1 on Staphylococcus aureus

CHEN Feilong 1,2, LIU Yuzhu 1, PENG Bo 1, CHEN Yongchun 1, MIAO Jianyin 1,3, CAO Yong 1,3,*
(1. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. Evonik Rexim (Nanning) Pharmaceutical Co. Ltd., Nanning 530100, China; 3. Guangdong Engineering Research Center of Natural Active Substance, Guangzhou 510642, China)

Abstract:This study aimed to elucidate the intracellular mechanism of action of antimicrobial peptide F1 on Staphylococcus aureus. The binding of the genomic DNA of S. aureus to antimicrobial peptide F1 was investigated with gel retardation, and the competitive intercalation of F1 and ethidium bromide (EB) into the genomic DNA were analyzed by fl uorescence spectroscopy. The influence of F1 on the synthesis of protein in S. aureus was determined by Coomassie brilliant blue method and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The inhibition of β-galactosidase and nonspecific esterase activities of S. aureus cells by the antibacterial peptide was measured using o-nitrophenyl β-D-galactopyranosiden (ONPG) and di-O-acetylfluorescein (FDA), respectively. Finally, the changes in the cell cycle of S. aureus after being treated by F1 were monitored with flow cytometry. The results showed that F1 bound with DNA and could weaken the fluorescence intensity of EB-DNA complex, hindering the expression of genetic information of S. aureus. Besides, the protein biosynthesis of S. aureus was also inhibited, which was further proven by the measured activities of two intracellular enzymes, β-galactosidase and non-specific esterase. Therefore, F1 could lead to the aberration of the intracellular enzyme system and metabolic pathways of S. aureus, and block the DNA synthesis phase of the cell cycle of S. aureus.

Key words:antimicrobial peptide F1; Staphylococcus aureus; intracellular mechanism of action; cell cycle

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706006

中图分类号:TS201.2

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)06-0036-06

引文格式:

陈飞龙, 刘渔珠, 彭勃, 等. 抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌的胞内作用机制[J]. 食品科学, 2017, 38(6): 36-41. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201706006. http://www.spkx.net.cn

CHEN Feilong, LIU Yuzhu, PENG Bo, et al. Intracellular mechanism of action of antimicrobial peptide F1 on Staphylococcus aureus[J]. Food Science, 2017, 38(6): 36-41. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706006. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-05-09

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31171768);广东省教育厅科研项目(2013gjhz0003)

作者简介:陈飞龙(1992—),男,硕士研究生,研究方向为食品科学。E-mail:feilong42@163.com

*通信作者:曹庸(1966—),男,教授,博士,研究方向为食品化学与营养。E-mail:caoyong2181@scau.edu.cn