N-糖基化修饰对极端嗜热酸性α-淀粉酶ApkA酶学性质的影响

曾 静,郭建军,袁 林*

(江西省科学院微生物研究所,江西 南昌 330096)

摘 要:为探索N-糖基化修饰对极端嗜热酸性α-淀粉酶ApkA酶学性质的影响,同时为构建酵母工程菌奠定基础,将Apk A缺失信号肽突变体Apk Ads及含有2 个潜在N-糖基化修饰位点的突变体Apk AdsD182N/G373S在毕赤酵母(Pichia pa storis)GS115中进行表达。ApkAds和ApkAdsD182N/G373S在Pichia pastoris GS115中大量表达并分泌到胞外,ApkAds的表观分子质量约为45 kD,ApkAdsD182N/G373S的表观分子质量约为55 kD。酶学性质分析表明,与ApkAds相比,ApkAdsD182N/G373S的酶学性质发生了一定的变化。其最适反应p H值由6.5降低至5.5~6.0,酸性条件下稳定性增强;最适反应温度由90 ℃提高至100 ℃;于90 ℃的半衰期由5 h增加至5.5 h,于100 ℃保温10 min后的相对酶活力由32.03%增加至49.04%。结果表明N-糖基化修饰可适当提高ApkA的酸性条件下酶活力和稳定性、最适反应温度、热稳定性。突变体ApkAdsD182N/G373S的酶学性质使其适于淀粉液化工艺的应用。

关键词:极端嗜热酸性α-淀粉酶;毕赤酵母GS115;N-糖基化修饰;分泌表达

α-淀粉酶是一类作用于淀粉分子,从其分子内部随机切断α-1,4糖苷键,生成葡萄糖、还原糖、极限糊精和含4 个以上葡萄糖残基的低聚糖的水解酶 [1-3]。α-淀粉酶是最重要的工业酶制剂之一,占全球工业用酶份额的30%,在食品、医药以及制糖工业等多种领域都有应用 [4-6]。耐高温α-淀粉酶常被应用于淀粉液化工艺,将淀粉水解成低分子质量的糊精,以制造各种糖浆 [7-8]

目前淀粉液化工艺存在以下几个主要缺点:105 ℃条件下α-淀粉酶易失活、温度和pH值的反复调节、Ca 2+的添加和排除等 [9-10]。已报道的文献表明极端嗜热微生物来源的极端嗜热酸性α-淀粉酶具有较好的高温活性和热稳定性 [11-12]。因此,极端嗜热酸性α-淀粉酶在淀粉液化工艺中的应用,可以简化淀粉液化工艺流程、避免pH值的反复调节,同时可以降低能耗、提高转化率、减少环境污染,使产品的质量和产量大大提高 [8]。但是极端嗜热微生物的培养条件严格,并且产酶量低,直接从极端嗜热微生物中分离获得极端嗜热酸性α-淀粉酶的产率较低,从而不易大量获得极端嗜热酸性α-淀粉酶,使其应用受到限制 [13-14]。因此将极端嗜热酸性α-淀粉酶的基因进行克隆并在常温表达宿主中进行表达,以获得适用于淀粉液化工艺的α-淀粉酶具有重要的应用意义。

由极端嗜热古生菌Thermoco ccu s kodakaren sis KOD1所产生的胞外α-淀粉酶ApkA具有较好的高温活性和热稳定性 [15],其最适反应温度为90 ℃,100 ℃条件下可保持80%的酶活力,110 ℃条件下仍有20%的酶活力。Apk A的最适反应pH值为6.5,于pH 4.5保持40%的酶活力。该酶在未补加Ca 2+的条件下于90 ℃保温1 h后保持90%的剩余活力。鉴于Apk A具有较好的高温活性和热稳定性,并且耐酸性强,因此其在淀粉液化工艺中具有较大的应用潜力。但是将Apk A应用于淀粉液化工艺仍存在较多的问题,例如Apk A的最适反应温度、最适反应p H值以及耐酸耐热性与工业用酶的要求还有一定的距离 [16];重组α-淀粉酶Apk A的宿主菌的安全性。为了达到生产的目的,本研究采用分子生物学技术来提高Apk A的最适作用温度、降低最适作用pH值、提高耐酸耐热性,并采用酵母作为表达的宿主菌。本研究将密码子优化改造后的人工合成ApkA ds基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中表达,获得重组α-淀粉酶ApkAds。另外,本研究通过对比Apk A与极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA的氨基酸序列,设计在ApkA中构建潜在的N-糖基化修饰位点,选定待突变的氨基酸残基,并采用定点突变技术构建突变体,在Pichia pa sto ris GS115中表达,验证突变体的酶学性质,从而为ApkA的开发和应用研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与质粒

大肠杆菌DH5α、大肠杆菌克隆载体pUC57、P ich ia pastoris GS115、穿梭质粒pPIC9K均由江西省科学院微生物研究所分子生物学实验室保存。

1.1.2 培养基

大肠杆菌的培养和转化采用LB培养基。P ic h ia p a sto ris的培养、转化、筛选及诱导表达采用酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培养基、MD(minimal dextrose)培养基、BMGY(buffered glycerol-complex)培养基、BMMY(buffered methanolcomplex)培养基。

1.1.3 试剂

KOD DNA聚合酶及KOD-Plu s-n eo DNA聚合酶日本Toyo bo公司;DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、低分子质量蛋白质Marker 美国Fermentase公司;DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒美国Omega Bio-tek公司;Chelating Sepharose TMFast Flow美国GE Healthcare公司;Bradford法蛋白浓度测定试剂盒上海生工生物工程股份有限公司;其他化学试剂均为国产或进口分析纯。

基因合成由上海博益生物科技有限公司完成,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)引物合成和测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 仪器与设备

PCR仪 德国Eppendorf公司;TY04S-3C凝胶成像系统 北京君意东方电泳设备有限公司;SP-752PC紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;SCIENTZ-ⅡD超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司;MicroPulser电穿孔仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 分子克隆技术和表达产物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(so dium do decy l sulp h atepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析

分子克隆技术和表达产物的SDS-PAGE分析参照文献[17-18]进行。

1.3.2 重组质粒pPIC9K-ApkAds的构建及鉴定

α-淀粉酶Ap k A基因A p k A由上海博益生物科技有限公司合成,将基因A p k A连接至载体p UC57构建质粒p UC57-A p kA,见表1。设计引物A p kA d s-F、A p kA d s-R扩增基因A p kA不含信号肽的结构基因A p kA d s。以质粒pUC57-A pkA为模板,采用引物ApkAds-F、ApkAd s-R,进行PCR扩增。PCR扩增条件为:98 ℃ 5 min;98 ℃ 20 s,60 ℃ 20 s,74 ℃ 2 min,30个循环;74 ℃ 10 min。扩增产物经E co RⅠ和N otⅠ双酶切,连接至载体pPIC9K,构建亚克隆pPIC9K-ApkA ds。采用Eco RⅠ和NotⅠ双酶切质粒鉴定是否有外源基因的插入。

表1 构建重组质粒所用引物
Table 1 Primer sequences used for the construction of recombinant plasmids

注:下划线标注部分为限制性酶切割位点,方框标注部分为突变位点。

引物名称序列ApkAds-F 5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG-3’D182N-F 5’-GCTCTGGGCGAGC AAC GAGAGCTACGCCGCC-3’D182N-R 5’-GGCGGCGTAGCTCTC GTT GCTCGCCCAGAGC-3’G373S-F 5’-GTACATCAACCTC AGC TCTAGCAAGGTC-3’G373S-R 5’-GACCTTGCTAGA GCT GAGGTTGATGTAC-3’5’-CAGGAATTCGCGCAAAGTATTCCGAACTCGAAG-3’ApkAds-R

1.3.3 重组质粒pPIC9K-ApkA dsD 182N/G37 3S的构建及鉴定

根据点突变试剂盒的说明,结合α-淀粉酶Ap k A基因A p k A和拟突变的氨基酸位点设计引物D182 N-F、D182N-R、G373S-F、G373S-R。以p PIC9K-A pkA d s为模板,采用引物D182N-F和D182N-R,进行PCR扩增得到包含载体序列和基因序列的线性片段。PCR扩增条件为:94℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃ 20 s,68℃ 5 min,35个循环;68℃ 10 min。扩增产物经Dp nⅠ酶处理后,转化大肠杆菌DH5α,卡那霉素抗性平板筛选转化子,测序鉴定是否为突变基因A pkA dsD 18 2N。在此基础上,以p PIC9K-A p kA d sD 1 82 N为模板,采用引物共G373S-F和G373S-R,进行PCR扩增,重复以上实验步骤,获得重组质粒pPIC9K-ApkAdsD182N/G373S。

1.3.4 Pichia pastoris转化及高表达重组子的筛选

用限制性内切酶B glⅡ酶切重组质粒pPIC9K-Apk Ad s和pPIC9K-A pkA dsD 18 2 N/G 37 3S,使其线性化,回收后于-20℃条件下保存。Pich ia pa storis GS115感受态细胞的制备参照文献[19]进行。取5 μL线性化重组质粒(约5~20 μg),加入到40 μL感受态细胞中,并将混合物迅速转移到0.2 cm电转杯中。将加有混合物的电转杯冰浴5 min后,采用Micro Pulser电穿孔仪电击细胞,参数设置为:1.5 k V,5 ms。电击完成后,立即向其中加入1 mL冰浴的山梨醇,并将细胞转移至无菌Eppendorf管中,全部涂布MD平板(200 μL/块),30 ℃条件下培养2 d。

向转化平板MD上加入适量无菌水,用涂布棒将长出的转化子收集到无菌Eppendorf管中。经适当稀释后,将转化子分别涂布于含有不同质量浓度G418(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL)的YPD平板上。于30℃条件下培养2~5 d后,选取抗G418质量浓度最大并且生长最快的菌落,接种于5 mL YPD液体培养基中,30℃条件下培养过夜。采用Easy DNA kit提取酵母基因组DNA,进行PCR鉴定,保存阳性克隆。

1.3.5 重组α-淀粉酶的诱导表达和纯化

接种单克隆到100 mL BMGY培养基中,30℃条件下振荡培养至菌液OD 600 nm为2~6。1 500×g离心5 min收集细胞,用约10~20 mL BMMY培养基重悬细胞,继续于30℃条件下振荡培养。每隔24 h补加甲醇至其最终体积分数为0.5%,诱导细胞表达重组蛋白质。从24 h开始,每隔12 h取样,测定上清液中α-淀粉酶的酶活力,分析表达情况。

采用Ni 2+亲和层析柱对发酵上清液中目的蛋白质进行纯化,用250 mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱,即得到纯化后的重组α-淀粉酶。利用SDS-PAGE检测重组α-淀粉酶的纯度,并采用Bradford法测定重组α-淀粉酶的质量浓度。

1.3.6 α-淀粉酶活力测定

将10 μL酶液与490 μL 50 mmol/L pH 6.5 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid,MES)缓冲液(含1 g/100 mL可溶性淀粉)混合,于90 ℃条件下反应30 min后,迅速放入冰水浴中终止反应,然后采用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法 [20]测定反应体系中还原糖的物质的量。酶活力单位(U)定义:在一定反应条件下,每分钟催化产生1 μmol还原糖的酶量为一个酶活力单位。

1.3.7 α-淀粉酶的酶学性质研究

按照上述反应体系混合酶液和底物,分别于40~110 ℃条件下反应30 min,测定不同温度条件下绝对酶活力,并以绝对酶活力对反应温度作图,确定其最适反应温度。

将酶液与不同p H值的1 g/100 mL可溶性淀粉溶液混合,于90 ℃条件下进行酶活力测定。采用不同缓冲液配制不同p H值的1 g/100 mL可溶性淀粉溶液:50 mmol/L MES(pH 4.0~7.0)、50 mmol/L 3-(N-玛琳代)丙磺酸缓冲液(3-(N-morpholino)-propanesulfonic acid,MOPS)(pH 7.0~9.0)。

将酶液与不同p H值的Britto n-Ro b in so n缓冲液(pH 4.0~9.0)混合,分别于90、100 ℃保温1 h后取出样品,根据如上反应体系测定酶活力。将未处理酶液的酶活力定义为100%,并以相对酶活力的百分比对pH值作图,评价酶的pH值稳定性。

将酶液分别于90、100 ℃保温,分时间梯度取出部分样品,根据如上反应体系测定酶活力。将未处理的酶液的酶活力定义为100%,并以相对酶活力的百分比对时间作图,评价酶的热稳定性。

1.4 数据统计分析

α-淀粉酶的酶学性质研究实验中,每个实验做3 个平行。运用软件SigmaPlot 11.0对试验数据进行统计分析并作图,数据均以 ±s表示。

2 结果与分析

2.1 定点突变位点的选择

图1 ApkA与PFA的氨基酸序列比对结果
Fig. 1 Sequence comparison of ApkA and PFA

采用BLAST分析Ap k A的氨基酸序列,结果表明Ap k A与来源于极端嗜热古生菌P yro co ccu s fu rio su s的α-淀粉酶PFA具有最高的氨基酸序列相似性,其氨基酸序列相似性高达89%。PFA是目前已知的热稳定性最好的α-淀粉酶之一 [21],具有优良的高温活性和热稳定性,其最适反应温度高达100℃,于98 ℃的α-淀粉酶活力高达3 900 U/mg,在未补加Ca 2+的条件下于98℃的半衰期长达13 h,最适反应pH值为5.5~6.0。郭建强等 [22]将PFA于Pichia pastoris GS115中进行异源表达,重组PFA在酵母细胞中大量表达并分泌到胞外。与大肠杆菌中表达得到的重组PFA相比,酵母细胞中表达得到的重组PFA的高温活性和热稳定性基本不变,但是其分子质量偏大(约为60 kD),最适反应pH值偏低(约为4.5~5.0),这些可能与其糖基化修饰相关。采用N连接糖基化在线预测软件NetNGlyc1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)对PFA的氨基酸序列进行分析,发现PFA中存在两个潜在的N-糖基化修饰位点,如图1所示。本研究设计Apk A中氨基酸残基D182和G373为突变位点,构建点突变体Apk AdsD182N/G373S,并分别将野生型ApkAds和突变体ApkAdsD182N/G373S于Pichia pastoris GS115中进行表达,探讨N-糖基化修饰对ApkA性质的影响。

2.2 重组质粒的酶切鉴定

根据P ichia p a storis的密码子偏好性 [23],经密码子优化设计,采用化学合成法合成了极端嗜热α-淀粉酶Apk A的基因A p kA,将基因A p kA连接至载体p UC57构建质粒pUC57-ApkA。以质粒pUC57-ApkA为模板,采用PCR方法扩增目标片段ApkA d s,并连接至载体pPIC9K,构建质粒pPIC9K-Ap kAds。在质粒pPIC9K-A pkAds的基础上,采用定点突变技术构建质粒pPIC9K-A pkAdsD182N/G373S。采用限制性内切酶E co RⅠ和NotⅠ酶切质粒pPIC9K-A pkAds和pPIC9K-ApkAd sD182N/G373 S,得到大小分别约为9 kb和1.3 kb的2 个片段(图2)。

图2 重组质粒的酶切鉴定
Fig. 2 Identification of recombinant vectors by restriction enzyme digestion

2.3 重组酵母基因组DNA的PCR鉴定

图3 重组酵母基因组DNA的PCR鉴定
Fig. 3 PCR identification of recombinant yeast genomic DNA

分别提取宿主菌Pichia pastoris GS115、对照转化子Pichia pastoris GS115/pPIC9K、阳性转化子Pichia pastoris GS115/p PIC9K-A p kA d s、阳性转化子P ich ia p a sto ris GS115/p PIC9K-A p kA dsD1 82 N/G 37 3S的基因组。分别以这4 种基因组为模板,采用引物Ap kA ds-F、Ap kA ds-R,进行PCR鉴定。结果如图3所示,以宿主菌Pichia pastoris GS1 1 5的基因组和对照转化子P ich ia p a sto ris GS1 1 5/ p PIC9K的基因组为模板的反应均无扩增产物出现,而以阳性转化子(包括Pichia pastoris GS115/p PIC9K-ApkA ds和P ichia p astoris GS115/pPIC9K-Ap kAdsD 182N/G373 S)的基因组为模板的反应均有约1.3 kb的扩增产物出现。以上结果表明,阳性转化子P ichia pastoris GS115/pPIC9KA pkAd s和Pichia pa storis GS115/pPIC9K-A pkAd sD 18 2N/G373S的基因组中已分别整合了α-淀粉酶的基因ApkAds和ApkAdsD182N/G373S。

2.4 重组α-淀粉酶的诱导表达与纯化

图4 诱导时间对酶活力的影响
Fig. 4 Time-dependent induction of α-amylase activity

将对照转化子P ich ia p a storis GS115/p PIC9K、阳性转化子Pic h ia pa storis GS115/pPIC9K-ApkAds和Pichia p asto ris GS115/p PIC9K-A pkA d sD 1 82 N/G 3 7 3S诱导培养6 d,每隔12 h取样并收集上清液,测定上清液中α-淀粉酶活力。结果表明(图4),对于阳性转化子P ich ia pa storis GS115/pPIC9K-ApkAds和Pichia p astoris GS115/ p PIC9 K-A p k A d sD 1 8 2 N/G 3 7 3 S,在诱导培养的1~5 d内,上清液中的α-淀粉酶活力随时间的增加基本上呈线性关系;在诱导培养5 d后,上清液中α-淀粉酶活力达到最大值;诱导培养5.5 d后,上清液中α-淀粉酶活力开始下降。

图5 重组α-淀粉酶的SDS-PAGE检测图
Fig. 5 SDS-PAGE analysis of recombinant α-amylases

同时采用SDS-PAGE分析对照转化子和阳性转化子诱导培养5 d后重组α-淀粉酶的表达情况,结果如图5所示。阳性转化子Pichia p astoris GS115/pPIC9K-ApkAd s的上清液中有一条约4 5 k D大小的蛋白质条带,即P ich ia p asto ris GS115表达的重组α-淀粉酶ApkAds与大肠杆菌表达的重组α-淀粉酶ApkAds的表观分子质量大小一致;阳性转化子Pichia pastoris GS115/pPIC9K-A pkAdsD182N/ G 3 7 3 S的上清液中有一条约55 k D大小的蛋白质条带;而对照转化子P ic h ia p a sto ris GS115/p PIC9K的上清液中没有这两种大小的蛋白质条带。采用Ni 2+亲和层析柱纯化位于上清液中的目的蛋白质,得到纯化后的重组α-淀粉酶Ap k Ad s和Apk AdsD182N/G3 73S。此外,Apk AdsD182N/G373S经糖苷酶Endo H f处理后,其表观分子质量明显减小,约为45 k D,与Apk Ads的表观分子质量大小基本一致。这表明,Pichia pasto ris GS115表达的重组α-淀粉酶ApkAds未受到糖基化修饰,而其突变体ApkAdsD182N/G373S受到糖基化修饰,所以其表观分子质量比Apk Ads大。

2.5 重组α-淀粉酶的酶学性质

2.5.1 pH值对重组α-淀粉酶活力的影响

图6 pH值对酶活力的影响
Fig. 6 pH dependence of α-amylase activity

由图6可知,Ap k Ad s的最适反应p H值约为6.5,于p H 4.5~8之间可保持4 0%以上的相对酶活力;Apk AdsD182N/G373S的最适反应p H值约为5.5~6.0,于p H 4.5~7.5之间可保持60%以上的相对酶活力。与ApkAds相比,突变体ApkAdsD182N/G373S在酸性条件下的相对酶活力得到提高。

图7 90 ℃条件下作用1 h酶的pH值稳定性
Fig. 7 pH stability of α-amylases at 90 ℃ for 1 h

由图7可知,ApkAds、ApkAdsD182N/G373S分别在90 ℃、pH 4.5~9.0和90 ℃、pH 4.0~9.0条件下具有较好的稳定性,相对酶活力均大于40%。

由图8可知,Apk Ads、ApkAdsD182N/G373S分别在100 ℃、p H 5.0~8.0和100 ℃、p H 4.5~8.0具有较好的稳定性,相对酶活力均大于40%。即与ApkAds相比,突变体Apk AdsD182N/G373S在酸性条件下的稳定性得到提高。

图8 100 ℃条件下作用1 h后酶的pH值稳定性
Fig. 8 pH stability of α-amylases at 100 ℃ for 1 h

2.5.2 温度对重组α-淀粉酶活力的影响

图9 温度对酶活力的影响
Fig. 9 Temperature dependence of α-amylase activity

由图9可知,Ap k Ad s的最适反应温度为9 0 ℃,在此温度条件下的绝对酶活力为3 0 5 6.7 5 U/mg,并且在6 0~1 0 0 ℃间可保持6 0%以上的相对酶活力;ApkAdsD182N/G373S的最适反应温度为100 ℃,在此温度下的绝对酶活力为3 301.08 U/mg,并且在50~110 ℃间其绝对酶活力均高于ApkAds的绝对酶活力。与ApkAds相比,突变体ApkAdsD182N/G373S的最适反应温度和绝对酶活力均得到提高。

2.5.3 重组α-淀粉酶的热稳定性

由图1 0、1 1可知,在9 0℃和1 0 0 ℃条件下,突变体Apk AdsD182N/G373 S的热稳定性均高于Apk Ads的热稳定性。其中Apk Ads于9 0℃的半衰期约为5 h,Apk Ad sD1 82 N/G37 3S于90℃的半衰期约为5.5 h。于100℃保温10 min后,Apk Ads保持约32.03%的相对酶活力,ApkAdsA180K的相对酶活力为49.04%。

图10 90 ℃重组α-淀粉酶的热稳定性
Fig. 10 Thermal stability of α-amylases at 90 ℃

图11 100 ℃重组α-淀粉酶的热稳定性
Fig. 11 Thermal stability of α-amylases at 100 ℃

3 讨 论

极端嗜热酸性α-淀粉酶具有反应温度高、液化速度快、热稳定性好、酸性条件下酶活力高等优点,在淀粉液化工艺中具有巨大的应用前景 [11-12]。但是极端嗜热酸性α-淀粉酶不易从极端嗜热微生物中大量获得,这限制了它在淀粉液化工艺中的应用 [13-14]。因此将极端嗜热酸性α-淀粉酶的基因在常温表达宿主如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母等中进行表达,以大量获得适用于淀粉液化工艺的重组α-淀粉酶具有重要的实际意义。由于极端嗜热微生物与常温微生物的密码子偏好性差别较大,采用常温微生物作为极端嗜热酸性α-淀粉酶的表达宿主存在表达量低、不可溶性表达或催化活性下降等缺陷 [24]。本研究根据P ichia pa storis的密码子偏好性 [23],经密码子优化设计,采用化学合成方法合成极端嗜热酸性α-淀粉酶Apk A的基因Ap kA,引入载体pPIC9K中,将重组质粒转化P ichia p a sto ris GS115,获得酵母工程菌株。重组α-淀粉酶Apk Ads受到甲醇的严格调控和诱导,在Pichia pastoris GS115中大量表达并分泌到胞外,在诱导培养5 d后发酵上清液中α-淀粉酶酶活力达到最大值。酵母细胞表达得到的重组α-淀粉酶Apk Ads与大肠杆菌表达得到的重组α-淀粉酶Apk Ads的酶学性质基本一致 [15]。但是该酵母工程菌株表达产生的重组α-淀粉酶Apk Ads能够有效地分泌到胞外,避免了纯化过程中细胞破碎的步骤,为蛋白质纯化提供了便利,更适用于工业应用。

糖基化修饰影响酶分子的折叠、组装、分泌等,从而改变酶分子的定位、催化活性、稳定性等 [25]。已有研究表明糖基化修饰会对α-淀粉酶的酶学性质产生影响。例如柯涛等在P ic h ia pastoris GS115中表达嗜热酸性α-淀粉酶BD5088,发现糖基化修饰可以提高BD5088的热稳定性、最适反应温度和酸性条件下酶活力 [26]。Tull等 [27]发现N-糖基化修饰有利于提高来源于芽孢杆菌B a cillu s strain NCIB 12513的α-淀粉酶ABA在酸性条件下的活性,但不利于其维持热稳定性。本研究通过对比Apk A和与其氨基酸序列同源性高达89%的极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA的氨基酸序列,选取氨基酸残基D1 8 2和G373为突变位点,构建含有两个潜在N-糖基化修饰位点的突变体ApkAdsD182N/G373S,并在Pichia pastoris GS115中表达该突变体,获得重组α-淀粉酶Apk AdsD182N/G373S。突变体ApkAdsD182N/G373S在酵母细胞中的表达情况与野生型ApkAds基本一致,但是其酶学性质发生了一定的变化。SDS-PAGE分析结果显示Apk Ads的表观分子质量约为45 kD,经N-糖基化修饰的Apk AdsD182N/G373S的表观分子质量约为55 kD。与ApkAds相比,ApkAdsD182N/ G373S的最适反应pH值由6.5降至5.5~6.0,于pH 4.5~7.5之间的相对酶活力由40%以上增加至60%以上;在90℃和10 0℃条件下,酸性条件下稳定性得到提高;最适反应温度由90 ℃提高至100 ℃,并且于5 0~11 0 ℃的酶活力均高于Apk Ads;于90 ℃的半衰期由5 h增加至5.5 h,于100 ℃保温10 min后的相对酶活力由32.03%增加至49.04%。以上结果表明,N-糖基化修饰有利于提高Apk A在酸性条件下酶活力和稳定性、最适反应温度及热稳定性。本研究所获得的经N-糖基化修饰的突变体Apk AdsD182N/G373S的高温活性、稳定性、酸性条件下的酶活力和稳定性等酶学性质达到了淀粉液化工艺对α-淀粉酶的要求,能够适用于淀粉液化工艺。

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Effect of N-Glycosylation on Enzymatic Characteristics of Hyperthermoacidophilic α-Amylase ApkA

ZENG Jing, GUO Jianjun, YUAN Lin*
(Institute of Microbiology, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330096, China)

Abstract:This study aimed to explore the effect of N-glycosylation on enzymatic characteristics of hyperthermoacidophilic α-amylase ApkA for the purpose of establishing the basis of the development of genetically engineered yeast. Based on the amino acid sequence analysis of ApkA, a signal peptide deleted mutant ApkAds and a double site mutant ApkAdsD182N/ G373S containing two potential N-glycosylation sites were constructed and expressed in Pichia pa sto ris GS115. The recombinant α-amylases ApkAds and ApkAdsD182N/G373S were expressed at high levels and secreted into the culture medium. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis showed that the molecular weights of ApkAds and ApkAdsD182N/G373S were about 45 and 55 kD, respectively. Compared with ApkAds, the mutant ApkAdsD182N/G373S showed optimal pH of 5.5-6.0 instead of 6.5. The mutant ApkAdsD182N/G373S was more stable under acidic conditions. Its optimal temperature was 100 ℃ compared with 90 ℃ for ApkAds . When incubated at 90 ℃, ApkAds and ApkAdsD182N/G373S exhibited half-lives of 5 and 5.5 h, respectively. After incubated at 100 ℃ for 10 min, the residual activities of ApkAds and ApkAdsD182N/G373S were 32.03% and 49.04%, respectively. These results suggest that N-glycosylation moderately increases enzymatic activity and stability under acidic conditions, optimal temperature, and thermostability of ApkA, and the mutant ApkAdsD182N/G373S is ideal for starch liquefication.

Key words:hyperthermoacidophilic α-amylase; Pichia pastoris GS115; N-glycosylation; secretion expression

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706008

中图分类号:Q814

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)06-0048-07

引文格式:

曾静, 郭建军, 袁林. N-糖基化修饰对极端嗜热酸性α-淀粉酶Apk A酶学性质的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(6): 48-54.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706008. http://www.spkx.net.cn

ZENG Jing, GUO Jianjun, YUAN Lin. Effect of N-glycosylation on enzymatic characteristics of hyperthermoacidophilic α-amylase ApkA[J]. Food Science, 2017, 38(6): 48-54. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706008. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-05-11

基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(31501422);江西省青年科学基金项目(20151BAB214001);

江西省科学院资助项目(2014-YYB-08;2014-XTPH1-08)

作者简介:曾静(1986—),女,助理研究员,博士,研究方向为极端嗜热酶的开发与应用。E-mail:zengjingwhu@126.com

*通信作者:袁林(1980—),男,副研究员,博士,研究方向为工业微生物的应用。E-mail:yuanlincn2003@aliyun.com