广谱抗菌芽孢杆菌的筛选及其抗酵母物质的纯化和鉴定

石举然,别小妹,吕凤霞,陆兆新*

(南京农业大学食品科学与技术学院,江苏 南京 210095)

摘 要:从不同来源的2 种野生蜂蜜中筛选出一株产广谱抗菌活性物质的芽孢杆菌LZ-5,其发酵产物对短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母及米曲霉等多种食品腐败微生物均有抑制作用。通过形态观察、生理生化实验、16S rDNA分析等手段初步确定LZ-5在细菌发育分类学上属于淀粉液化芽孢杆菌。利用有机溶剂萃取、SephdexLH-20凝胶柱层析、高效液相色谱等方法对其发酵产物中对酵母菌有抑菌活性的物质进行分离纯化,利用液相色谱-质谱法测定分子质量,并与标准品进行比较,初步确定该物质为iturinA2、iturinA3和iturinA6的混合物。

关键词:解淀粉芽孢杆菌;筛选;抗菌物质;分离鉴定;iturinA

抗菌脂肽是一类主要由芽孢杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属和节细菌属等产生 [1]的具有抗菌作用的脂肽类化合物,其分子中的氨基酸与烃链上的烃基或氨基以内酯或酰胺键结合形成环型脂肽,具有良好的蛋白酶稳定性 [2]。相对于化学抑菌剂来讲,其细胞毒性低,可生物降解并且不容易使病原微生物产生抗性 [2],在天然食品防腐剂 [3]、抗植物真菌感染 [4]以及制药 [5]方面具有潜在应用价值。在食品工业中作为天然防腐剂,不仅能降低其传统化学防腐剂带来的危害,而且减少了热加工造成的食品中营养成分的流失,使产品能够最大程度地保持天然状态 [6]

芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌(B a cillu s su b tilis)和解淀粉芽孢杆菌(B acillu s am yloliq uefa ciens)在自然界中分布广泛,是目前研究最多的抗菌脂肽产生菌。其产生的抗菌脂肽主要包括3大类:surfactin、fengycin和iturin [7]。其中surfactin具有较强的表面活性和广谱的抑制细菌效果 [8],而iturin因为其良好的抗真菌活性,主要用作植物病原菌的防治 [9]。关于脂肽对酵母菌抑制作用的报道相对较少。针对目前食品中出现的酵母菌污染 [10],有必要开发一种安全、高效的酵母菌抑制剂。芽孢杆菌中的代谢产物,iturinA、bacillomycin F [11]、mycosubtilin [12]等对酵母菌有抑制作用,为天然酵母菌抑制剂的开发提供了一条新的途径。

蜂蜜是工蜂将采集的植物花蜜或分泌物经过充分酿造而贮存在蜂巢内的甜味物质 [13],具有渗透压高、水分含量低、pH值低(3.2~4.5)等特点 [14],所以蜂蜜中的微生物主要以芽孢的形式存在。研究表明,野生蜂蜜中普遍存在能产抗菌物质的芽孢杆菌,从蜂蜜中分离出的能够形成芽孢的需氧细菌对病原菌有抑制作用 [2]。本研究以采集自海南的野生荔枝蜜和山东的野生槐花蜜为样品来源,筛选出1 株有广谱抗菌活性的芽孢杆菌,并将其发酵产物中对酿酒酵母有抑制作用的成分进行纯化和鉴定,为抗菌脂肽的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

野生荔枝蜂蜜和洋槐蜂蜜,分别为海南黎族和山东平度农家自产蜂蜜。

1.1.2 菌株

大肠埃希氏杆菌ASI.48(E sc h e ric h ia co li)、蜡样芽孢杆菌ASI.18 4(B a c illu s cereu s)、短小芽孢杆菌AS1.594(B a cillu s p umilu s)、藤黄微球菌CMCC2800(M ic ro c o c c u s lu te u s)、荧光假单胞菌ASI.1 8 0 2(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉AS335(Aspergillus n ig er)、米曲霉AS3.951(A sp e rg illu s ory za e)、串珠镰孢菌(F usa rium mo nilifo rm e)、点青霉(P eniclliu m notatu m)、桃软腐病病菌(R hizopu s sto lonifer)、赤霉菌(Fusarium graminearum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(P ich ia pa sto ris)、葡萄有孢汉逊酵母(H a n se n ia sp o ra u v a ru m)、异常威客汉姆酵母(Wickerh a mo m yces a n o m a lu s)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)均为南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保藏。

1.1.3 培养基与试剂

种子培养基:营养肉汤(nutrient broth,NB)培养基;发酵培养基:Landy培养基;指示细菌培养基:营养琼脂(nutrient agar,NA)培养基;霉菌及酵母培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基、马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth,PDB)培养基;菌株鉴定用培养基 [11]:葡萄糖蛋白胨水培养基、淀粉培养基、糖发酵培养基等。

DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、琼脂糖上海生工生物工程有限公司;T a q DNA聚合酶大连宝生物科技有限公司;d NTP、DNA标准分子质量Mark er 南京金斯瑞公司;革兰氏染色试剂盒杭州百思生物技术有限公司;细菌鉴定通用引物fD1(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和rp l(5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’) 北京三博远志生物技术有限公司;iturin A标准品 美国Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.4 仪器与设备

高压蒸汽灭菌锅 北京发恩科贸有限公司;SW-CJIBU超净工作台 苏净集团安泰公司;Orion 3-Star pH计美国Thermo公司;PYX-DHS-50X65隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂;UV-2450紫外分光光度计日本Shimadzu公司;Eclipse801光学显微镜 日本Nikon公司;centrifuge 5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;PTC-100TM聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪 美国MJ Research公司;PowerPac HC 164-5052高电流电泳仪 美国Bio-Rad公司;JS-3 8 0C全自动数码凝胶成像分析仪 上海培清科技有限公司;1100高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪、6520液相色谱-质谱(LC-mass spectrometry,LC-MS)联用仪 美国Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 芽孢杆菌的分离纯化

将2 g蜂蜜样品在无菌生理盐水中进行10 倍梯度稀释并编号,分别在80 ℃水浴中处理20 min [15]后涂布于NA平板,30 ℃条件下培养36~48 h,直至菌落直径大于2 mm。选取长有单菌落的平板,用无菌牙签将单菌落转移至新的NA培养基,培养36 h后保存于4 ℃冰箱备用。

初筛:将分离到的芽孢杆菌接种在NA平板上37 ℃培养36 h,用无菌打孔器在每个菌落旁取出直径5 mm的琼脂块,整齐放在接种了指示菌的固体培养基上检测各菌株的抑菌活性。

复筛:将初筛中对短小芽孢杆菌、大肠杆菌和酿酒酵母均有抑菌效果的菌株接种到Landy培养基,180 r/min摇床培养48 h,经12 000 r/min离心20 min后得到发酵上清液。用牛津杯法进行抑菌活性检测。

抑菌活性检测:将短小芽孢杆菌、大肠杆菌分别接种于NB培养基,37 ℃条件下180 r/min振荡培养10 h,将酿酒酵母接种于PDB培养基,30 ℃条件下180 r/min振荡培养24 h,按照1%接种量将各指示菌悬液分别接种于NA培养基和PDA培养基,倾倒于放置有牛津杯的平板中,取出牛津杯后在孔中加入10 0 μL发酵上清液并分别在37 ℃和30 ℃条件下培养12 h,观察抑菌情况。

1.2.2 发酵产物的抑菌谱测定

本研究选取16 株指示菌,其中3 株革兰氏阳性菌,2 株革兰氏阴性菌,6 株霉菌,5 株酵母菌。将霉菌接种到PDA培养基,并于30 ℃条件下振荡培养48 h。其他指示菌培养及抑菌活性检测方法同1.2.1节。

1.2.3 菌株鉴定

1.2.3.1 菌体形态以及生理生化鉴定

结合目标菌的菌落和菌体形态特征、芽孢有无、着生情况,并根据《微生物学实验教程》 [16]提供的方法进行生理生化实验,最后参照《伯杰细菌鉴定手册》 [17]进行初步鉴定。

1.2.3.2 16S rRNA序列同源性分析鉴定

LZ-5菌株基因组提取按照细菌基因组提取试剂盒说明。

PCR扩增:用于16S rDNA基因PCR扩增的引物为通用引物fD1和rP1。PCR体系(50µL)为:10×PCR缓冲液5 µL、dNTP(2.0 nmol/L)4 µL、引物fD1和rP1各1 µL、模板DNA 1 µL、Ta q酶1 U、超纯水37 µL。PCR程序:95 ℃、5 min,94 ℃、1 min,55 ℃、1 min,72 ℃、3 min,循环30 次;72 ℃、10 min。经琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。用DNA回收试剂盒回收扩增产物后送到南京金斯瑞生物科技公司测序。

构建系统发育树:将测序结果在NCBI的GenBank数据库中进行BLAST分析,根据序列同源性选取不同模式菌株,用MEGA6.06软件构建系统发育树,确定菌株LZ-5的种属关系。

1.2.4 抗菌物质的纯化与鉴定

在菌种LZ-5保藏斜面上挑取一环转接到NB培养基中,37 ℃条件下180 r/min摇床中培养12 h到达对数生长期。种子液以5%接种量接种到Landy培养基中,30 ℃条件下180 r/min振荡培养36 h。将发酵液在12 000 r/min离心20 min得到发酵上清液备用。

1.2.4.1 有机溶剂萃取

将发酵上清液按照1∶1(V/V)的比例分别与正丁醇、乙酸乙酯、异戊醇、正己烷、丙酮、甲醇进行混合,4 ℃条件下静置过夜。分离水相和有机相,用旋蒸仪去除有机溶剂并用相同体积甲醇复溶固形物。按照1.2.1节中牛津杯法检测各有机萃取物对酿酒酵母的抑菌活性。

1.2.4.2 全波长扫描

将有机溶剂萃取得到的抗菌粗提物用紫外分光光度计在190~450 nm进行全波长扫描,确定活性组分的检测波长。

1.2.4.3 SephadexLH-20凝胶层析

采用SephadexLH-20色谱柱对抗菌粗提物进行初步纯化。首先用1 L 80%甲醇溶液平衡柱子,取1 mL抗菌粗提物上样(上样之前用孔径为0.22 μm的滤膜去除杂质)。用80%甲醇溶液洗脱2 个柱体积,流速为0.2 mL/min,用自动收集器每18 min收集一管。将每管在确定波长下进行紫外检测并同时按照1.2.1节中的牛津杯法测定其对酿酒酵母的抑菌活性。

1.2.4.4 HPLC分析

将经过Sep hadex LH-2 0收集到的有抑菌活性的洗脱液用高效液相色谱系统进一步纯化并检测活性物质的纯度,以确保样品的纯度达到结构鉴定的要求。样品上柱前经0.2 2 μm微孔滤膜过滤,洗脱剂经抽滤装置脱气。HPLC条件:色谱柱COSMOSIL5 C 18-AR-Ⅱ(4.6 mm×250 mm);紫外检测器;检测波长202 nm;进样量2 0 μL;柱温25 ℃;流速0.6 m L/min;流动相A为水;流动相B为乙腈;洗脱条件为0 min 9 0% A,10 min 60% A,30 min 40% A。

1.2.4.5 LC-MS分析

LC条件同1.2.4.4节。MS条件:电喷雾离子源,正离子检测;全离子扫描范围150~1 500 u;毛细管电压-10 V;毛细管温度350 ℃;电喷雾电压4.0 kV。

2 结果与分析

2.1 有抗菌活性芽孢杆菌的筛选

表1 筛选得到各菌株的发酵上清液的抑菌情况
Table 1 Antimicrobial activities of the fermentation broths of screened strains

注:-. 无抑菌活性;+. 抑菌圈直径<15 mm;++. 抑菌圈直径>15 mm。

菌株来源菌株编号抑菌圈短小芽孢杆菌大肠杆菌酿酒酵母荔枝蜂蜜LZ-1++--LZ-2+--LZ-3++-LZ-4++--LZ-5+++++ LZ-6+--LZ-7++--LZ-8+--YH-1++--YH-2-+-YH-3-+-YH-4++--YH-5+--洋槐蜂蜜

从海南野生荔枝蜜与山东野生洋槐蜜中共分离出122株芽孢杆菌,经初筛和复筛共得到13 株有良好抑菌活性的芽孢杆菌。其中11 株对短小芽孢杆菌有抑菌作用,4 株对大肠杆菌有抑制作用,1 株对酿酒酵母、短小芽孢杆菌和大肠杆菌均有抑菌作用,选取其中对3 种指示菌均有抑菌效果的菌株做进一步研究。

2.2 菌株LZ-5抑菌谱的测定

表2 LZ-5抑菌谱测定
Table 2 Antimicrobial spectrum of the fermentation supernatant of strain LZ-5

注:-.无抑菌活性。

指示菌抑菌圈直径/mm指示菌抑菌圈直径/mm荧光假单胞菌-赤霉菌16.33±0.31蜡样芽孢杆菌13.06±0.52黑曲霉-大肠杆菌11.78±0.36米曲霉25.87±0.28短小芽孢杆菌20.39±0.22串珠镰孢菌24.90±0.31藤黄微球菌16.76±0.15点青霉17.22±0.32桃软腐霉14.23±0.44酿酒酵母22.23±0.28葡萄有孢汉逊酵母18.52±0.28异常威客汉姆酵母14.60±0.42鲁氏接合酵母13.02±0.31毕赤酵母-

菌株LZ-5的发酵上清液对所选择的16 株指示菌抑菌结果如表2所示,可以看出该菌株对其中的13 株菌均有抑制作用,能够全部抑制短小芽孢杆菌和藤黄微球菌等3 种革兰氏阳性菌,而且对大肠杆菌有一定的抑菌效果。在所选择的6 株丝状真菌中,除了对黑曲霉没有抑制作用,对其他丝状真菌均有不同程度的抑菌效果,尤其能够有效抑制串珠镰孢菌。而且,该菌株对多种酵母菌均有抑制作用,尤其是对作为食品的主要腐败酵母——酿酒酵母有较好的抑制效果。这表明其具有较为广泛的抑菌谱,对多种食品腐败微生物均有抑制作用。

2.3 菌株鉴定

2.3.1 形态特征鉴定

图1 LZ-5菌体光学显微镜照片(A)(×100)和菌落形态特征(B)
Fig. 1 Mycelial morphology of strain LZ-5 by optical microscope and its colonial morphology

由图1A可知,菌体呈长杆状,染色均匀,革兰氏染色阳性,可形成内生孢子,芽孢囊不显膨大,芽孢椭圆形,中生到次端生。液体培养基中静置培养培养基表面形成菌膜。由图1B可知,在NA培养基上平板划线培养2 4 h,长出圆形菌落,边缘整齐,表面光滑黏稠,半透明。培养36 h之后长成白色不透明菌落,表面褶皱,凸起。

2.3.2 生理生化鉴定

由表3可知,该菌株需氧生长;V.P实验阳性;甲基红阴性;石蕊牛奶实验中,细菌产蛋白酶使牛奶胨化;产凝乳酶使牛奶凝固,能水解淀粉,耐受10% NaCl。糖发酵实验中,不能利用D-甘露糖、D-木糖、α-乳糖。

表3 菌株LZ-5生理生化特征
Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain LZ-5

注:+. 阳性结果;-. 阴性结果。

特征结果特征结果革兰氏染色+麦芽糖+芽孢有无+蔗糖+需氧+鼠李糖+厌氧-葡萄糖+ V.P+纤维二糖+甲基红-D-甘露糖-牛奶凝固+α-乳糖-牛奶胨化+D-木糖-淀粉水解+肌醇+ NaCl耐受<10%D-山梨醇+ pH 7.49 L-阿拉伯糖+

2.3.3 分子生物学鉴定

图2 菌株Bacillus amyloliquefaciens LZ-5的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene sequence of Bacillus amyloliquefaciens LZ-5

以菌株LZ-5总DNA为模板,将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后进行胶回收并测序,将测序结果在NCBI的Gen Bank数据库中进行BLAST程序比对,结果与淀粉液化芽孢杆菌FZB42(NR_075005)的序列相似性最高,达到99.86%。根据同源性从GenBank中选择相关的菌株,构建系统发育树,结果见图2。结合该菌株的形态特征和生理生化实验结果,初步确定该菌株为淀粉液化芽孢杆菌,并命名为Bacillus amyloliquefaciens LZ-5。

2.4 抗菌物质的纯化与鉴定

2.4.1 有机溶剂萃取

表4 不同有机溶剂萃取抑菌效果比较
Table 4 Diameters of inhibition zones of different organic solvent extracts

注: -.没有抑菌圈或没有结果。

有机溶剂抑菌圈直径/mm水相有机相正丁醇12.69 22.75乙酸乙酯19.90-异戊醇11.49 22.71正己烷19.25-丙酮15.49-甲醇14.93-

将有机溶剂和发酵上清液等体积混合,4 ℃条件下静置过夜后,丙酮和甲醇与水互溶,不出现分层现象,达不到萃取的效果。而正丁醇、乙酸乙酯、异戊醇和正己烷萃取体系均出现了明显的分层现象。将各有机相浓缩相同倍数之后进行抑菌活性检测,结果如表4所示,乙酸乙酯和正己烷萃取的水相抑菌圈较大,有机相没有抑菌活性,说明抗菌活性物质并不能被这2 种有机溶剂萃取出来;正丁醇和异戊醇萃取之后,水相的抑菌活性明显降低,说明发酵上清液中的抑菌物质能够被萃取到有机相中,如图3所示。考虑到异戊醇毒性较大,最终选择正丁醇作为抗菌物质的萃取剂。

图3 不同有机溶剂萃取抑菌效果比较
Fig. 3 Antibacterial effects of different organic solvent extracts

2.4.2 抗菌粗提物全波长扫描

图4 LZ-5抗菌粗提物的全波长扫描图谱
Fig. 4 UV absorption spectrum of the crude antibacterial extract from LZ-5

将有机溶剂萃取液在190~450 nm进行全波长扫描,由图4可知,该混合物在202 nm和225 nm有2 个吸收峰,202 nm吸收更强,所以选择202 nm为检测波长。

2.4.3 抗菌粗提物的SephadexLH-20凝胶层析

图5 SephadexLH-20凝胶层析各管吸光度(A)和抑菌情况(B)
Fig. 5 Separation of the crude antibacterial extract on SephadexLH-20 and its anti-yeast fractions

将有机溶剂萃取液用旋转蒸发仪在45 ℃条件下浓缩50 倍,经过Sep hadex LH-2 0进行凝胶过滤之后,将每一管收集组分在202 nm波长处进行紫外检测,得到5 个吸收峰(图5A)。检测各管对酿酒酵母的抑菌活性,其中第25~30管有抑菌活性(图5B)。比较两种检测结果,如图5A所示,其中抑菌活性峰与3号峰基本重合,说明Seph adex LH-20的洗脱峰中3号峰对酿酒酵母有抑菌活性。

2.4.4 抗酵母成分的HPLC检测

由图6可知,检测到的一组峰中一共有6 个峰,出峰时间分别为18.447、20.052、20.323、22.950、23.507 min和25.527 min,这与iturin A标准品液相检测结果基本一致。初步确定LZ-5发酵液中对酿酒酵母有抑菌活性的组分为iturinA的一系列同系物。

图6 抗酵母菌成分和iturinA标准品的液相色谱检测比较
Fig. 6 HPLC chromatograms of the anti-yeast substances and iturinA standard

2.4.5 LC-ESI-MS

图7 抗酵母成分的LC-MS图
Fig. 7 LC-MS spectra of the anti-yeast substances from Bacillus amyloliquefaciens LZ-5

为了进一步确定该抗菌物质为iturin A的同系物,将液相上收集到的纯度为99%的组分进行LC-MS检测,结果检测到3 组明显的离子峰,如图7所示,(M+H) +分别为1 043.6、1 057.6和1 071.6,离子峰之间差值为14,说明在分子结构上相差一个CH 2,这恰好与iturinA的3 种同系物iturinA2、iturin A3和iturin A6的相对分子质量相对应。由此可以断定该物质为iturinA同系物的混合物。

3 讨 论

蜂蜜本身具有抑菌作用,其中存在的具有抑菌作用的微生物主要为芽孢杆菌。本研究从2 种野生蜂蜜中筛选出13 株有抑菌作用的芽孢杆菌,其中1 株活力高,抑菌谱广,对短小芽孢杆菌、大肠杆菌和酿酒酵母均有抑制作用。通过菌落形态观察,生理生化实验和分子生物学鉴定,确认该菌株为解淀粉芽孢杆菌,并命名为B acillu s amyloliquefaciens LZ-5。据报道,Lee等 [18]从8 种蜂蜜中分离到的2 000多株菌中有92.5%对所选择的指示菌具有不同程度的抑制作用,进一步分离得到1 株多黏类芽孢杆菌能够有效抑制P aenibacillus larvae引起的美洲蜂幼虫腐臭病 [19]。韩惠丽等 [20]从4 种蜂蜜中分离到枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对大肠杆菌和痢疾杆菌有较好抑制效果。而目前尚未有从蜂蜜中分离得到解淀粉芽孢杆菌的报道。

研究分离的Bacillus amyloliquefaciens LZ-5具有较为广泛的抑菌谱,对革兰氏阳性菌,部分革兰氏阴性菌和酵母菌以及多种植物病原菌都有抑制作用。在之前的研究中,孙力军等 [21]发现同样广谱抑菌的B acillus sub tilis NT-6中产生的脂肽组分多达20多种,主要包括surfactin、iturin和feng ycin 3 组。因为surfactin主要抑制细菌,fengycin主要有抑制丝状真菌的作用,而iturin能够抑制丝状真菌和酵母菌。这表明芽孢杆菌广泛的抑菌谱与发酵产物中多种成分的协同作用有很大关系。

针对目前研究的微生物源抗菌物质多数只对革兰氏阳性菌有效而无法解决食品工业上酵母菌污染的情况,本研究从菌株的发酵产物中对能够抑制酵母菌生长的抗菌成分进行分离纯化。经过有机溶剂萃取,Sephadex LH-20凝胶柱层析、HPLC等手段得到一种纯度较高的抗菌物质,最终经LC-ESI-MS检测确定为iturinA3种同系物的混合物。目前,抗菌脂肽的分离纯化主要采用酸沉法 [22]、薄层色谱 [9]、C 18柱固相萃取 [23]、硅胶柱层析 [24]和反相HPLC结合的方案,也有研究用有机溶剂萃取代替酸沉法达到较好的分离效果。Jasim等 [25]利用乙酸乙酯从Bm B 9的发酵上清液中萃取得到脂肽粗提物,并直接进行液相检测确定其组分,但这种方法不能将单一抗菌组分分离出来。本研究在有机溶剂萃取获得抗菌粗提物之后利用Sep hadex LH-20柱层析进一步纯化,获得纯度较高的itu rin A,减少了液相检测时其他杂质造成的干扰,结果更准确。这也是在iturin A的分离中首次应用Sephadex LH-20柱层析的方法,其操作简便,纯化效率高。

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Screening of A Broad-Spectrum Antibacterial Bacillus and Purification and Identification of the Anti-Yeast

Substances Produced by It SHI Juran, BIE Xiaomei, LÜ Fengxia, LU Zhaoxin*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract:One strain of B acillu s amyloliqu efacien named LZ-5 was isolated from two wild honey samples collected from different regions. It was found to possess a broad spectrum of antimicrobial activity. Its secondary metabolites had strong antimicrobial activities against some kinds of food spoilage microorganisms, including B acillu s pu m ilus, Staph ylo cco cus au reus, Saccha romyces cerevisiae and Asperg illus oryza e. According to its morphological and cultural characteristics, physiological and biochemical properties and 16S rDNA sequence analysis, the strain was identified as Ba cillus amylo liquefacien. The main anti-yeast substances produced by it were separated by organic solvent extraction, SephadexLH-20 column chromatography and high performance liquid chromatography. Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry was adopted to determine the molecular masses of the substances by comparison with standard compounds. The anti-yeast substances were preliminarily identified as a mixture of iturinA2, iturinA3 and iturinA6.

Key words:Bacillus amyloliquefaciens; screening; antibacterial substance; separation and identification; iturinA

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706002

中图分类号:TS201.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)06-0006-07

引文格式:

石举然, 别小妹, 吕凤霞, 等. 广谱抗菌芽孢杆菌的筛选及其抗酵母物质的纯化和鉴定[J]. 食品科学, 2017, 38(6): 6-12.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706002. http://www.spkx.net.cn

SHI Juran, BIE Xiaomei, LÜ Fengxia, et al. Screening of a broad-spectrum antibacterial Ba cillus and purification and identification of the anti-yeast substances produced by it[J]. Food Science, 2017, 38(6): 6-12. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706002. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-05-25

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31271936)

作者简介:石举然(1991—),女,硕士研究生,研究方向为食品生物技术。E-mail:15366198509@163.com

*通信作者:陆兆新(1957—),男,教授,博士,研究方向为食品生物技术。E-mail:fmb@njau.edu.cn